第六章外源基因的表达
1、名词解释
融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称为融合蛋白。
分泌蛋白：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。
包涵体：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。
外源基因表达体系：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。
2、大肠杆菌表达载体构成的重要元件有哪些？
①启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7。②核糖体结合位点。③插入位点
④终止子⑤复制起始区⑥选择标记
3. 试比较大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞基因表达载体各自组成的特点。
（1）大肠杆菌基因表达载体构成的重要元件（见上题）；
（2）酵母表达载体的重要组成原件
?复制起始区：
?选择标记：营养缺陷型；显性选择标记
?有丝分裂稳定区
?表达盒（expression cassette)：启动子、分泌信号序列和终止子。
（3）植物基因表达载体的组成特征：
?以Ti质粒为基础构建而成。
?启动子：组成型、诱导型和组织特异型。
?终止子：rbs小亚基基因3’端终止子序列。
?T-DNA：边界序列25bp正向重复序列，为控制外源基因的转移和整合必需的功能元件。?内含子序列：有效提高成熟mRNA的含量，提高外源基因的表达水平。
?选择标记与报告基因
（4）动物细胞基因表达载体组成特征：
①、启动子②、复制子③、mRNA剪接和加尾信号④、筛选标记
4. 真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题和高效表达的对策是什么？
真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题：
?真核基因的结构具有内含子，而大肠杆菌等原核生物没有转录产物剪接加工系统。
?真核生物mRNA的结构与大肠杆菌中的不同，影响到真核mRNA在原核细胞中的稳定性及与核糖体的结合能力。
?真核生物的基因对简并密码子的使用偏好与大肠杆菌的不同。
?大肠杆菌细胞没有真核生物的蛋白质加工修饰系统，使表达产物不能正常折叠。
?大肠杆菌内源蛋白酶会对真核基因表达产物产生降解，造成表达产物的不稳定性。真核基因在大肠杆菌中高效表达的对策：
?克隆真核基因的cDNA或化学合成不带内含子的基因进行表达。
?将SD序列（核糖体结合位点）引入表达载体，使之位于转录起始点的下游和插入外源基因的上游，保证SD序列与起始密码子间的准确距离和碱基组成，防止核糖体结合位点附近序列转录后形成茎环二级结构。
?通过点突变等方法将外源基因中的密码子转化为大肠杆菌等受体细胞高频出现的同义密码子。
5. 基因表达产物的检测方法有哪些？
?报告基因的酶法检测
?酶联免疫吸附法
?Western印迹法
?表达产物生物学活性检测
基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的 RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA， 然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同 RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个 相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种 因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以 芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对 表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空 间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA 的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。 基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在 细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一 特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因 产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的 运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几 种方法广泛应用于于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分 析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查 基因表达的应用。8 f3 f- |2 L) K) b7 ]- ~- | RT-PCR检测基因表达的问题讨论
关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。 7 H+ F& _* S6 W( a8 p: [, @- d, { 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA 合成是否成功还没有进行过严格的研究。
第2节基因表达与性状的关系 一、选择题 知识点一基因表达产物与性状的关系 1．囊性纤维病是北美白种人中常见的一种疾病，研究表明，在70%的患者中，－的CFTR蛋白的第Cl508位的氨发病原因是CFTR基因缺失3个碱基，导致运输－不能有效运出肺等器官的组织细胞。下列理解错误的而直接原因是基酸缺失，Cl是() A．从个体水平看，病人的性状已经发生改变 B．从细胞水平看，病人肺组织细胞膜的功能已发生改变 C．从分子水平看，病人的基因的结构没有发生改变 D．此病可以说明基因通过控制蛋白质的结构来直接控制生物体的性状 答案C 解析该病根本原因是CFTR基因缺失3个碱基，基因结构发生改变。囊性纤维病发病的直接原因是CFTR蛋白发生改变，所以此病可以说明基因是通过控制蛋白质的结构直接影响了生物体的性状。 2．酪氨酸酶存在于正常人体的皮肤、毛囊等处的细胞中，它能使酪氨酸转变为黑色素，下列相关叙述正确的是() A．人体的神经细胞中含有控制酪氨酸酶合成的基因 B．白化病实例说明基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状 C．酪氨酸是基因表达的产物 D．老年人头发变白是由控制酪氨酸酶合成的基因异常引起的 答案A 解析人体所有细胞都是由同一个受精卵发育而来的，都含有该生物全部的基因，因此人体的神经细胞中含有控制酪氨酸酶合成的基因，A正确；白化症状是由编码酪氨酸酶的基因异常引起的，这一实例说明基因通过控制酶的合成来影响细胞代谢，进而间接控制生物体的性状，B错误；酪氨酸是一种氨基酸，不是基因表达的产物，基因表达的产物是蛋白质，C错误；老年人头发变白的原因是酪氨酸
酶的活性降低，黑色素合成减少，D错误。 知识点二基因的选择性表达与细胞分化 3．人的胰岛B细胞能产生胰岛素，但不能产生血红蛋白，据此推测胰岛细胞中() ．只有胰岛素基因A． B．比人受精卵的基因数少 C．既有胰岛素基因，也有血红蛋白基因和其他基因，但只存在胰岛素mRNA D．有胰岛素基因和其他基因，但没有血红蛋白基因 答案C 解析胰岛B细胞由受精卵经分裂分化产生，故胰岛B细胞中既有胰岛素基因也有血红蛋白基因和其他基因，胰岛B细胞能产生胰岛素，不产生血红蛋白是由于基因的选择性表达，故只存在胰岛素mRNA。 4．下列关于细胞分化的叙述，不正确的是() A．细胞分化的本质是基因选择性表达 B．基因选择性表达与基因表达的调控有关 C．生物多种性状的形成，都是以细胞分化为基础的 D．由于细胞分化，肌细胞中已经不存在血红蛋白基因了 答案D 解析肌细胞由受精卵分裂分化而来，分化不会导致基因丢失，只是基因进行选择性表达，D错误。 5．有人把分化细胞中表达的基因形象地分为“管家基因”和“奢侈基因”。“管家基因”在所有细胞中都处于活动状态，是维持细胞基本生命活动所必需的；而“奢侈基因”只在特定组织细胞中才处于活动状态。下列属于“管家基因”指导合成的产物是() A．ATP水解酶B．血红蛋白 D．抗体C．胰岛素 A 答案 正确；血红水解酶基因在所有细胞中都表达，属于管家基因，A解析ATP细胞中特异性表达，抗体在浆B蛋白基因只在红细胞中表达，胰岛素基因在胰岛、细胞中表达，都属于奢侈基因表达的产物，B、CD错误。知识点三表观遗传不同个体出现了不同体F(aa)杂交，产生的(Aa)(AA)6．黄色小鼠与黑色小鼠 1(CpG)基因上二核苷酸基因的碱基序列相同，色。研究表明，不同体色的小鼠A 但A复制。有关胞嘧啶有不同程度的甲基化(如图现象出现，甲基化不影响基因DNA))
基因的表达 一、选择题 1．DNA分子的复制、转录和翻译分别形成（） A．DNA、RNA、蛋白质B．DNA、RNA、氨基酸 C．DNA、RNA、核糖体D．核苷酸、RNA、蛋白质 2．对于中心法则，经科学家深入研究后，发现生物中还存在着逆转录现象，它是指遗传信息的传递从（）A．蛋白质→RNA B．RNA→DNA C．DNA→RNA D．DNA→DNA 3．遗传密码是指（） A．DNA分子决定蛋白质合成的有意链上的碱基排列顺序 B．转运RNA分子一端决定一个氨基酸的三个碱基排列顺序 C．信使RNA上的碱基排列顺序 D．蛋白质分子的氨基酸排列顺序 4．决定信使RNA中核苷酸顺序的是（） A．转运RNA中核苷酸的排列顺序B．蛋白质分子中氨基酸的排列顺序 C．核糖体RNA中的核苷酸排列顺序D．DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序 5．在翻译过程中，不属于信使RNA与转运RNA的碱基配对的一组是（） A．U-A B．A-U C．G-C D．A-T 6．在蛋白质合成过程中，碱基互补配对的原则体现在（） A．DNA的复制过程中B．转录过程中C．翻译过程中D．以上各种过程中 7．一个转运RNA的一端三个碱基是CGA，此转运RNA转运的氨基酸是（） A．精氨酸(密码子CGA)B．丙氨酸(密码子GCU) C．酪氨酸(密码子UAU)D．谷氨酸(密码子GAG) 8．下列对DNA的叙述正确的是（） ①在人白细胞的DNA上含有人的全部遗传信息②DNA是一切生物的遗传物质 ③同种个体间的DNA是完全相同的④一个DNA分子可以控制许多性状 ⑤翻译是以DNA的一条链为模板 A．①②③B．③④⑤C．①④D．②③ 9．人的促黑色素细胞激素是一个22肽化合物，它的合成过程中需要的转运RNA最多有多少种（）A．60种B．22种C．4种D．64种 10．在细胞核内从DNA中的……A－T―G―C ……转录成RNA中的……U―A―C―G ……这一具体
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测 一、背景介绍 1．绿色荧光蛋白 1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非 aequorin。与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。1985到1992年间，科学家 Douglas Prasher 测定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。 绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。 GFP的优点很多：首先，它本身稳定，不需要任何反应底物和辅助因子，且无种属限制，可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光，在450～490nm 蓝光激发下,发光能保持 10min 以上。其次，其分子量小，对目的基因的功能无任何影响，融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质，对细胞没有毒性。最后，GFP观察方便，利用激光扫描共聚焦显微镜，甚至普通显微镜都可以观察到活细胞蛋白的变化、活动，用肉眼就可对辨别细胞是否表达及其表达水平。 作为一种新型的报告基因，绿色荧光蛋白在生命科学的各个领域得到广泛的应用：利
第4章基因的表达 一、选择题 1．DNA分子的复制、转录和翻译分别形成（） A．DNA、RNA、蛋白质B．DNA、RNA、氨基酸 C．DNA、RNA、核糖体D．核苷酸、RNA、蛋白质 2．对于中心法则，经科学家深入研究后，发现生物中还存在着逆转录现象，它是指遗传信息的传递从（） A．蛋白质→RNA B．RNA→DNA C．DNA→RNA D．DNA→DNA 3．遗传密码是指（） A．DNA分子决定蛋白质合成的有意链上的碱基排列顺序 B．转运RNA分子一端决定一个氨基酸的三个碱基排列顺序 C．信使RNA上的碱基排列顺序 D．蛋白质分子的氨基酸排列顺序 4．决定信使RNA中核苷酸顺序的是（） A．转运RNA中核苷酸的排列顺序 B．蛋白质分子中氨基酸的排列顺序 C．核糖体RNA中的核苷酸排列顺序 D．DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序 5．在翻译过程中，不属于信使RNA与转运RNA的碱基配对的一组是（）A．U-A B．A-U C．G-C D．A-T 6．在蛋白质合成过程中，碱基互补配对的原则体现在（） A．DNA的复制过程中B．转录过程中 C．翻译过程中D．以上各种过程中 7．一个转运RNA的一端三个碱基是CGA，此转运RNA转运的氨基酸是（）A．精氨酸(密码子CGA)B．丙氨酸(密码子GCU) C．酪氨酸(密码子UAU)D．谷氨酸(密码子GAG) 8．下列对DNA的叙述正确的是（） ①在人白细胞的DNA上含有人的全部遗传信息 ②DNA是一切生物的遗传物质
③同种个体间的DNA是完全相同的 ④一个DNA分子可以控制许多性状 ⑤翻译是以DNA的一条链为模板 A．①②③B．③④⑤ C．①④D．②③ 9．人的促黑色素细胞激素是一个22肽化合物，它的合成过程中需要的转运RNA最多有多少种（） A．60种B．22种C．4种D．64种 10．在细胞核内从DNA中的……A－T―G―C ……转录成RNA中的……U―A―C―G ……这一具体过程中共有核苷酸（） A．2种B．4种C．5种D．8种 11．一个DNA分子片段有碱基2 400个，它指导合成的肽链最多有氨基酸（）A．200个B．400个C．600个D．800个 12．一种RNA病毒引起艾滋病，被称为HIV病毒。HIV病毒的RNA在宿主细胞内的逆转录酶的作用下，能转录为DNA。下列叙述正确的是（） ①感染了HIV病毒的细胞中，有逆转录的DNA合成 ②感染了HIV病毒的细胞中，有病毒的RNA合成 ③逆转录形成的DNA被转录、翻译为病毒的蛋白质 A．①②B．②③C．①③D．①②③ 13．一条多肽链中有1 500个氨基酸，那么在合成过程中，所用模板和信使RNA的分子组成依次至少需要核苷酸（） A．4 500个，9 000个B．3 000个，1 500个 C．4 500个，4 500个D．9 000个，4 500个 14．下表中决定丝氨酸的密码子是（） A．TCG B．CCG C．AGC D．UGC
基因表达与性状的关系 【概念·诊断】 1.细胞通过精准的调控,实现了基因对性状的控制。下列有关说法,正确的是____。 ①基因通过控制蛋白质的合成直接控制生物的性状 ②同一个体的不同组织细胞中蛋白质种类不完全相同 ③柳穿鱼花的不同形态是由一对等位基因控制的 ④DNA的甲基化修饰不能遗传给后代 ⑤基因能否表达是基因表达调控的唯一方式 ⑥基因通常是有遗传效应的DNA片段,不同基因之间的作用可能相互影响 【解析】选②⑥。基因控制性状的途径包括直接途径和间接途径两种类型,①错误;同一个体的不同组织细胞中蛋白质种类不完全相同,②正确;柳穿鱼花的不同形态是表观遗传现象,不是由一对等位基因控制的,③错误;DNA的甲基化修饰能遗传给后代,④错误;基因表达调控包括基因能否表达以及表达水平的高低,⑤错误;不同基因之间的作用可能相互影响,⑥正确。 2.关于表观遗传的理解,下列说法正确的是( ) A.DNA的甲基化与环境因素无关 B.DNA的甲基化影响基因的翻译过程 C.表观遗传现象不符合孟德尔遗传定律 D.DNA的甲基化导致基因的碱基序列改变 【解析】选C。环境因素会影响DNA的甲基化,A项错误;DNA的甲基化影响基因的转录过程,B 项错误;表观遗传现象不符合孟德尔遗传定律,C项正确;DNA的甲基化不会导致基因的碱基序列改变,D项错误。 3.下列有关细胞分化的分析中错误的是( ) A.在个体发育过程中,有序的细胞分化能够增加细胞的类型 B.从细胞器水平分析,细胞分化是细胞器的种类、数目改变的结果 C.细胞分化使各种细胞的遗传物质有所差异,导致细胞的形态和功能各不相同 D.从蛋白质角度分析,细胞分化是蛋白质种类、数量改变的结果,这是细胞分化的直接原因【解析】选C。细胞分化的过程中,细胞会在形态、结构等方面发生稳定性差异,故能够增加细胞的类型,A正确;细胞分化的过程中,细胞的功能会出现差异,细胞器的种类、数目均会发生改
基因表达及其分析技术 生命现象的奥秘隐藏在基因组中，对基因组的解码一直是现代生命科学的主流。基因组学研究可以说是当今生命科学领域炙手可热的方向。从DNA 测序到SNP、拷贝数变异(copy number variation , CNV)等DNA多态性分析，到DNA 甲基化修饰等表观遗传学研究，生命过程的遗传基础不断被解读。 基因组研究的重要性自然不言而喻。应该说，DNA 测序技术在基因组研究 中功不可没，从San ger测序技术到目前盛行的新一代测序技术(Next Gen eration Seque ncing NGS)到即将走到前台的单分子测序技术，测序技术是基因组解读最重要的主流技术。而基因组测序、基因组多态性分析、DNA 甲基化修饰等表观遗传分析等在基因组研究中是最前沿的课题。但是基因组研究终究类似“基因算命”，再清晰的序列信息也无法真正说明一个基因的功能，基因功能的最后鉴定还得依赖转录组学和蛋白组学，而转录作为基因发挥功能的第一步，对基因功能解读就变得至关重要。声称特定基因、特定SNP、特定CNV、特定DNA修饰等与某种表型有关，最终需要转基因、基因敲除、突变、 RNAi 、中和抗体等技术验证，并必不可少要结合基因转录、翻译和蛋白修饰等数据。 基因实现功能的第一步就是转录为mRNA或非编码RNA，转录组学主要研究基因转录为RNA 的过程。在转录研究中，下面几点是必须考虑的： 1，基因是否转录(基因是否表达)及基因表达水平高低(基因是低丰度表达还是中、高丰度表达)。特定基因有时候在一个细胞中只有一个拷贝的表达，而表达量会随细胞类型不同或发育、生长阶段不同或生理、病理状态不同而改变。因此任何基
基因的表达测试题（附解析） 一、选择题 1．下列关于RNA的叙述，正确的是( ) A．75个碱基组成的tRNA，其上含有25个反密码子 B．900个碱基组成的mRNA，其上含有的密码子均决定氨基酸 C．结核杆菌的rRNA的形成与核仁密切相关 D．人体的不同细胞中，mRNA的种类不一定相同 解析：选D 一个tRNA上只有1个反密码子；mRNA上终止密码子不对应氨基酸；结核杆菌是原核细胞，没有细胞核，也没有核仁；人体的不同细胞中，不同的基因选择性表达，也有部分相同基因表达，所以mRNA的种类不一定相同。 2．下列关于生物体内遗传信息传递的叙述，正确的是( ) A．翻译时，每种密码子都有与之对应的反密码子 B．没有外界因素干扰时，DNA分子的复制也可能出错 C．转录开始时，RNA聚合酶必须与基因上的起始密码结合 D．翻译时，一个核糖体上结合多条mRNA分子，有利于加快翻译的速度 解析：选B 翻译时，终止密码子不能编码氨基酸，因此终止密码子没有与之对应的反密码子；没有外界因素干扰时，DNA分子的复制也可能出错；启动子位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，可见，转录开始时，RNA聚合酶必须与基因上的启动子结合；翻译时，一个mRNA分子上可以相继结合多个核糖体，同时进行多条肽链的合成，有利于加快翻译的速度。 3．下列关于中心法则的叙述，正确的是( ) A．亲代DNA能通过自我复制在亲子代之间表达遗传信息 B．真核生物基因表达的过程需要多种RNA参与 C．基因的转录过程发生在细胞核中 D．在烟草花叶病毒颗粒内可以合成自身的RNA和蛋白质 解析：选B 亲代DNA能通过自我复制在亲子代之间传递遗传信息；真核生物基因表达的过程需要mRNA、tRNA、rRNA参与；细胞核和线粒体以及叶绿体中均含有DNA，都可以发生基因的转录过程；烟草花叶病毒没有细胞结构，不能独立生活，必须寄生于活细胞中，因此其蛋白质和RNA的合成都发生在烟草细胞中。 4．2017年11月我国爆发了较严重的流感。某流感病毒是一种负链RNA病毒，侵染宿主细胞后会发生－RNA→＋RNA→－RNA和－RNA→＋RNA→蛋白质的过程，再组装成子代流感病毒。“－RNA”表示负链RNA，“＋RNA”表示正链RNA。下列叙述错误的是( ) A．该流感病毒的基因是有遗传效应的DNA片段
基因表达谱分析技术 1、微阵列技术（microarray） 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸），并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。包括cDNA芯片（cDNA microarray）和DNA 芯片（DNA chips）。 cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cm×18cm的膜上。尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA片段。要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂
交。洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。使用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基因表达的差异，只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片灵敏度更高，而且可以使用2种探针同时与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作带来的差异；缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。 Guo等（2004）将包含104个重组子的cDNA文库点在芯片上，用于检测拟南芥叶片衰老时的基因表达模式，得到大约6200差异表达的ESTs，对应2491个非重复基因。其中有134个基因编码转录因子，182个基因预测参与信号传导，如MAPK级联传导路径。Li等（2006）设计高密度的寡核苷酸tiling microarray方法，检测籼稻全基因组转录表达情况。芯片上包含13,078,888个36-mer寡核苷酸探针，基于籼稻全基因组shot-gun测序的序列合成，大约81.9%（35,970）的基因发生转录事件。Hu等（2006）用含有60,000寡核苷酸探针（代表水稻全部预测表达基因）的芯片检测抗旱转基因植株（过量表达SNAC1水稻）中基因的表达情况，揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。 2、基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE）
第六章外源基因的表达 1、名词解释 融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称为融合蛋白。 分泌蛋白：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。 包涵体：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。 外源基因表达体系：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。 2、大肠杆菌表达载体构成的重要元件有哪些？ ①启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7。②核糖体结合位点。③插入位点 ④终止子⑤复制起始区⑥选择标记 3. 试比较大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞基因表达载体各自组成的特点。 （1）大肠杆菌基因表达载体构成的重要元件（见上题）； （2）酵母表达载体的重要组成原件 ?复制起始区： ?选择标记：营养缺陷型；显性选择标记 ?有丝分裂稳定区 ?表达盒（expression cassette)：启动子、分泌信号序列和终止子。 （3）植物基因表达载体的组成特征： ?以Ti质粒为基础构建而成。 ?启动子：组成型、诱导型和组织特异型。 ?终止子：rbs小亚基基因3’端终止子序列。 ?T-DNA：边界序列25bp正向重复序列，为控制外源基因的转移和整合必需的功能元件。?内含子序列：有效提高成熟mRNA的含量，提高外源基因的表达水平。 ?选择标记与报告基因 （4）动物细胞基因表达载体组成特征： ①、启动子②、复制子③、mRNA剪接和加尾信号④、筛选标记 4. 真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题和高效表达的对策是什么？ 真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题： ?真核基因的结构具有内含子，而大肠杆菌等原核生物没有转录产物剪接加工系统。 ?真核生物mRNA的结构与大肠杆菌中的不同，影响到真核mRNA在原核细胞中的稳定性及与核糖体的结合能力。 ?真核生物的基因对简并密码子的使用偏好与大肠杆菌的不同。 ?大肠杆菌细胞没有真核生物的蛋白质加工修饰系统，使表达产物不能正常折叠。 ?大肠杆菌内源蛋白酶会对真核基因表达产物产生降解，造成表达产物的不稳定性。真核基因在大肠杆菌中高效表达的对策：
基因的表达测试 1．甲、乙两图为真核细胞中发生的代谢过程的示意图，下列有关说法正确的是( ) A．甲图所示的过程叫作翻译，多个核糖体共同完成一条多肽链的合成 B．乙图所示过程叫作转录，转录产物的作用一定是作为甲图中的模板 C．甲图所示翻译过程的方向是从右到左 D．甲图和乙图中都发生了碱基互补配对且碱基互补配对方式相同 2．下列有关原核细胞和真核细胞转录和翻译过程的叙述中，正确的是( ) A．原核细胞内，转录还未结束便启动遗传信息的翻译 B．真核细胞内，在转录的同时，核糖体进入细胞核启动遗传信息的翻译 C．原核细胞内，转录促进mRNA在核糖体上移动，以便合成肽链 D．真核细胞内，一个mRNA分子在多个核糖体上移动，同时合成多条肽链 3．下列关于正常的干细胞内遗传信息传递的叙述，不正确的是( ) A．遗传信息的复制阶段，遵循碱基互补配对原则，基因突变可发生在该阶段 B．遗传信息的转录阶段，转录产物的碱基序列与非模板链对应区段不完全相同 C．遗传信息的翻译阶段，mRNA上的密码子都会与tRNA上的反密码子发生碱基配对现象D．遗传信息的复制和转录阶段，都需要聚合酶的催化，且主要场所都是细胞核 4．真核细胞编码蛋白质的起始密码子是AUG，决定的氨基酸为甲硫氨酸。图中①、②、③分别是与起始密码子有关的碱基对序列。下列叙述正确的是( ) ①…TAC… …ATG…② …UAC… …AUG…③ …AUG… …TAC… A．真核细胞每个基因中只含有一组① B．图②所示碱基配对方式发生在转录过程中 C．含有②中UAC的tRNA只转运甲硫氨酸 D．③中存在5种核苷酸 5．研究发现，人类免疫缺陷病毒(HIV)携带的RNA在宿主细胞内不能直接作为合成蛋白质的模板。结合中心法则(下图)，下列相关叙述不正确的是( )
Western blot法测定蛋白表达 1 样品制备 称取100mg组织置于裂解液中充分匀浆，裂解液于4℃、12000rp m离心5min，取上清液。 2 定蛋白 利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中蛋白含量，将每个样品的蛋白浓度调至相同。上清液与5×SDS上样缓冲液按5：1(v:v)混合后，沸水浴中加热5min，离心取上清。 3 蛋白质上样及电泳 每个样品取20μL上清液上样(蛋白总量约50μg)，于20%SDS-PAGE电泳分离。样品首先在80V恒定电压下电泳。当染料显示样品接近分离胶顶端时，调节恒定电压为110V继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。 4 蛋白质转膜 电泳完毕后，卸下玻璃板并取出凝胶。遵循凝胶在负极，膜在正极的原则，按阴极–吸水纸–滤纸–凝胶–硝酸纤维素膜(NC)膜–滤纸–吸水纸–阳极的顺序将凝胶装配于转移装置上。200mA恒定电流条件下，4℃转移1h以上。转移完毕后，剪角标记NC膜，用1×丽春红染液染色以观察转膜效果。用TBS/T洗膜3次，每次5min。 5 封闭 用5％脱脂奶粉溶液封闭膜上的非特异位点，于4℃孵育过夜。 1.2.3.6 一抗孵育 加入一级抗体（工作浓度1：1000），4℃孵育过夜，使抗原抗体结合。一抗孵育结束后，用TBS/T洗膜3次，每次5min。 7 二抗孵育 加入HRP标记的二级抗体（工作浓度1：5000），室温孵育1h，以结合一级抗体。孵育结束后用TBS/T洗膜3次，每次5min。
8 ECL化学发光检测 按ECL试剂盒说明书方法曝光底片，显影、定影后保存胶片。 9 图像扫描及分析 将显影后所得条带扫描并保存为电脑文件，用Image J 图像分析软件对条带的灰度值进行分析。关键控制基因蛋白表达量以目的条带的灰度值与内参条带的比值代表目的蛋白的相对表达水平。