第二章染色体与DNA
本章内容
1. 染色体
2. DNA的结构
3. DNA的复制
4. 原核生物和真核生物DNA复制特点
5. DNA的修复
6. DNA的转座
第一节染色体(chromosome)
概念：
染色体(chromosome)：原指真核生物细胞分裂中期具有一定形态特征的染色质。现在这一概念已扩大为包括原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。
染色质(chromatin)：由DNA和蛋白质构成，在分裂间期染色体结构疏松，称为染色质。其实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。
常染色质(euchromatin)：是进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染，易被核酸酶在一些敏感的位点(hypersensitive sites)降解。
异染色质(heterochromatin)：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质(inactive chromatin)，是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制，早凝缩，即异固缩现象(heteropycnosis)。
原核细胞与真核细胞特征分析
染色体特性：
分子结构相对稳定
能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性
能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程
能够产生可遗传的变异
真核细胞染色体的组成
DNA 30%--40%
组蛋白(histone) 30%--40%
非组蛋白(NHP) 变化很大
少量RNA
染色体中的蛋白质
组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力。
组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。
非组蛋白(non-histone protein)：是染色体上与特异DNA 序列结合的蛋白质，所以又称为序列特异性DNA结合蛋白。
组蛋白具有如下特性：1、进化上的极端保守性。
2、无组织特异性。
3、肽链上氨基酸分布的不对称性。
4、组蛋白的修饰作用。
5、富含赖氨酸的组蛋白H5。
非组蛋白：
非组蛋白大约占组蛋白总量的60－70%，种类很多。
（1）HMG蛋白(high mobility group protein) ，能与DNA 结合(不牢固)，也能与H1作用,可能与DNA的超螺旋结构有关。
（2）DNA结合蛋白：可能是一些与DNA的复制或转录有关的酶或调节物质。
（3）A24非组蛋白：与H2A差不多，位于核小体内，功能不祥。
非组蛋白的一般特性：
1.非组蛋白的多样性；
非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。
2.非组蛋白的组织专一性和种属专一性。
DNA
C值：通常指一种生物单倍体基因组DNA的总量。
C值反常现象：真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。
染色体中的DNA
根据DNA的动力学研究，真核细胞DNA可分为：
高度重复序列：几百→几万 copy。如：卫星DNA和微卫星DNA。
中度重复序列：10 →几百 copy。如：各种rDNA、tDNA及组蛋白基因。
低度重复序列：2 →10 copy。如：血红蛋白。
单拷贝序列：大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。只有一个拷贝。如：蛋清蛋白。
染色体折叠
DNA
核小体
螺线管
圆筒
超螺旋
（1）核小体
染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体(nucleosome)：DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp)，形成核小体核心颗粒。
（2）螺线管
10nm的染色质细丝盘绕成螺旋管状的30nm纤维粗丝，
通称螺线管（solenoid）。螺线管的每一螺旋包含6个核小体，其压缩比为6。这种螺线管是分裂间期染色质和分裂中期染色体的基本组分。
（3）上述螺线管可进一步压缩形成超螺旋。由30nm螺线管缠绕而成一细长、中空的圆筒，直径为4 000nm，压缩比是40。
（4）超螺旋进一步压缩1/5便成为染色体单体，总压缩比是7×6×40×5，将近一万倍。
原核生物基因组
特点：
1、结构简练
2、存在转录单元多顺反子mRNA
3、有重叠基因
Sanger1977在《Nature》上发表了ΦX174 DNA的全部核苷酸序列，正式发现了重叠基因。
第二节 DNA的结构
一、DNA的一级结构
所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
基本特点
①DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。
②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。
③两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。
2、DNA的二级结构
DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。
通常情况下，DNA的二级结构分两大类：一类是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一类是左手螺旋，即Z-DNA。
3、DNA的高级结构
DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成
的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。
DNA分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示：
L=T+W其中L为连接数（linking number），是指环形DNA 分子两条链间交叉的次数。只要不发生链的断裂，L是个常量。T为双螺旋的盘绕数（twisting number），W为超螺旋数（writhing number），它们是变量。2．3DNA的复制
2.3.1 DNA的半保留复制机理
2.3.2 复制的起点、方向和速度
2.3.3 复制的几种主要方式
一、DNA的复制
1、DNA的半保留复制
每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA的半保留复制（semiconservative replication）。DNA的这种半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性。
2、复制的起点与方向
一般把生物体的复制单位称为复制子（replicon）。一个复制子只含一个复制起点。
多复制子：DNA复制时，原核生物一般只有一个起始位点，而真核生物则有多个起始位点，因而在复制时呈现多复制泡，也称为多复制子。
DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的（图2-18）。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。
拓扑异构酶I
拓扑异构酶I解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。参与解链的除一组解链酶外，还有Dna 蛋白等。
DNA解链酶（DNA helicase）
DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。
单链结合蛋白（SSB蛋白）
SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB蛋白只保持单链的存在，并不能起解链的作用。
3、DNA的半不连续复制与冈崎片段
DNA复制时，短时间内合成的约1000个核苷酸左右的小片段，称之为冈崎片段(Okazaki fragment)
DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶连成大分子DNA。现在已知一般原核生物的冈崎片段要长些，真核生物中的要短些。进一步研究还证明，这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为双螺旋的半不连续复制。
DNA链的延伸：
DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA 聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。
4、滞后链的引发
DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3' 端开始合成新的DNA链。滞后链的引发过程往往由引发体（primosome）来完成。引发体由6种蛋白质n、n'、n''、Dna B、C和I共同组成，只有当引发前体（preprimosome）把这6种蛋白质合在一起并与引发酶（primase）进一步组装后形成引发体，才能发挥其功效。
5、链的终止
当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。
6、复制的几种方式
(1)环状DNA双链的复制
环状双链DNA的复制可分为θ型、滚环型和D-环型几种类型。
(a) θ型
复制的起始点涉及到DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制的引物。
(b) 滚环型（rolling circle）
这是单向复制的特殊方式。如ΦX174的双链环状DNA 复制型（RF）就是以这种方式复制的。DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始，所形成的自由5‘端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。在这个过程中，单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步。
（c） D-环型（D-loop）
这也是一种单向复制的特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环（即D-环）。
（2）线性DNA双链的复制
线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下5'端部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，使子链短于母链。T4和T7噬菌体DNA通过其末端的简并性使不同链的3'端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经DNA连接酶作用生成二联体。这个过程可重复进行直到生成原长20多倍的多联体，并由噬菌体DNA编码的核酸酶特异切割形成单位长度的DNA分子。
二、原核和真核生物DNA的复制特点
1、原核生物DNA的复制特点
大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较
原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ：有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性。保证DNA复制的准确性。
DNA聚合酶Ⅱ：活性低，其3’→5’核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修复DNA的作用。
DNA聚合酶Ⅲ：7种亚单位9个亚基。只具3’→5’外切酶活性，主导聚合酶。
Klenow fragment：用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶，获得两个片段，大片段分子量76000U，称为Klenow 片段。它保留着聚合酶和3’→5’外切酶的活性，广泛使用于DNA序列分析中。
三、真核生物DNA的复制特点
真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORC）参与。
真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp/秒，还不到大肠杆菌的1/20。
真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA 的复制不能再开始。
真核生物DNA聚合酶的特性比较
2.4.3 DNA复制的调控
原核细胞DNA的复制调控：复制叉的多少决定了复制频率的高低。
真核细胞DNA的复制调控：
1.细胞生活周期水平调控
2.染色体水平调控
3.复制子水平调控
真核和原核生物DNA复制的比较
相同：
1.半保留复制
2.都有引发、延长、终止三个阶段
3.都必须有相应功能的蛋白质和DNA聚合酶参与
区别：
1.真：多个复制起始点；原：一个复制起始点
2.真：所有复制受一种调控；原：一个复制子上有多个复制叉
2.5 DNA的修复
DNA修复系统功能
错配修复恢复错配
碱基切除修复切除突变的碱基核苷酸切除修复修复被破坏的DNA
DNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNA 2.6 DNA的转座
2.6.1 转座子的分类和结构特征
2.6.2 转座作用的机制
2.6.3 转座作用的遗传学效应
2.6.4 真核生物中的转座子
移动基因(Movable gene)：又称为转位因子(Transposable elements)，是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一位置，甚至在不同染色体之间跃迁，因此有时也称为跳跃基因(Jumping gene)。
原核生物的转座因子可分为：
插入序列(insertion sequence，IS)：最简单的不含有任何宿主基因的转位因子。片段长度700—2500bp。
复合转座子(transposon，Tn)：是一类携带某些与转座无关的抗性基因(或其它宿主基因)的转座子。分子量＞2000bp。转座噬菌体(Mu，D108)：具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体。
插入序列的结构特点：
1.在IS两端含有长度为10—40bp反向重叠序列
2.含有一个编码转座酶的长编码区。
3.插入时在DNA位点产生一个短的(3—9bp)正向重复序列。
复合转座子的结构特点：
1.两翼为两个相同或相似的IS序列。
2.中部为某种抗性基因。
3.IS序列一般不能单独移动。
Conclusion
a) 转座过程是由Donor 提供Tn copy到 target site，涉及酶切、复制、重组的遗传学过程。
b) 转座完成后，在Tn的两端出现target site序列的正向重复，其长度取决于staggered cutting的长度。
c) 转座因子的 IR 序列是转座酶的重要识别位点，与转座，切除有关
d) Cointegrater 是转座过程的中间体 (具有两个 Tn 和两个 replicon), 其稳定性依 Tn不同而异，或 resolution 完成转座过程.
e) Cointegrater 可能导致 Tn 和抗性的积累。
转座作用的遗传学效应
1. 诱变效应（提高重组频率、形成易变基因…）
2. 切除效应 (倒位、缺失、重复、footprinting)
3. 双转座效应（外显子改组 exon shuffling ）
4. 位置效应（启动表达、增强表达…）
5. 转座爆炸（激活表达、基因内重排突变基因形成）
转位作用的机制：靶序列的复制。
转位作用的遗传学效应：引起插入突变；产生新基因；产生染色体畸变；引起生物进化。转座因子的应用：利用转座子分离、克隆基因；利用Tn进行基因定位；作为基因转移载体。
真核生物中的转座子
1、玉米中的控制因子
自主性因子：具有自主剪接和转座的功能；
非自主性因子：单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。
Ac－Ds体系、Spm, En转座子。
2、果蝇中的转座子
Copia类、P转座子等。
本章重点
染色体及DNA结构 DNA复制
习题
1.DNA以半保留方式进行复制,若一完全被标记的DNA分子,置于无放射标记的溶液中复制两代,所产生的4个DNA分子中放射性状况如何?
A.两个分子有放射性,两个分子无放射性
B.均有放射性
C.两条链中的半条具有放射性
D.两条链中的一条具有放射性
E.均无放射性
2.DNA复制时哪种酶不需要?
A.DNA指导的DNA聚合酶
B.DNA指导的RNA聚合酶
C.连接酶
D.RNA指导的DNA聚合酶
E.拓扑异构酶
3.原核生物的DNA聚合酶:
A.DNA聚合酶Ⅰ有7种、9个亚单位
B.DNA聚合酶Ⅱ有最强的外切核酸酶的活性
C.DNA聚合酶Ⅲ是真正的起复制作用的酶
D.催化过程产生的焦磷酸是主要底物
E.用4种脱氧核苷作底物
生物信息的传递(上)—从DNA到RNA
基因表达：是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。
转录(transcription)：以DNA为模板，按照碱基互补原则合成一条单链RNA，从而将DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程称为转录。
编码链(coding strand)=有意义链
模板链(template strand)=反义链
不对称转录(asymmetric transcription)：转录仅发生在DNA的一条链上。
启动子(promoter)：是DNA转录起始信号的一段序列，它能指导全酶与模板正确的结合，并活化酶使之具有起始特异性转录形式。
终止子(terminator)：转录终止的信号，其作用是在DNA模板特异位置处终止RNA的合成。
转录单位：DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。
3.1 RNA的转录
转录的基本过程都包括：模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。
1、模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA 双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。
2、转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。
3、转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。
4、RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。
5、当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，这就是转录的终止。
3.1.1 转录的基本过程
RNA合成的基本特点：
1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP
2.在聚合酶作用下形成磷酸酯键
3.RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定
4.仅以一条DNA链作为模板
5.合成方向为5’→3’
6.合成中不需要引物
3.1.2 转录机器的主要成分
原核生物RNA聚合酶：
亚基基因相对分子量亚基数组
分功能
α rpoA 3.65×10 4 2 核心
酶核心酶组装，
启动子识别
β rpoB 1.51×10 5 1 核心酶β和β’共同形成
RNA合成的活性中心
β’ rpoC 1.55×10 5 1 核心酶
？11×10 4 1 核心
酶未知
σ rpoD 7.0×10 4 1 σ因子存在多种σ因子，用
于识别不同的启动子
1、RNA聚合酶
大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×105。研究发现，由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。
σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，加入σ因子以后，RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了107倍。
σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，
转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子-酶复合物相结合构成新生RNA的5’端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反映在σ因子的释放。过去认为二核苷酸的形成就是转录起始的终止，实际上，只有当新生RNA链达到6-9个核苷酸时才能形成稳定的酶
-DNA-RNA三元复合物，才释放σ因子，转录进入延伸期。真核生物RNA聚合酶
真核生物中共有3类RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。
除了细胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶。线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于7×104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。叶绿体RNA聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码。线粒体和叶绿体RNA聚合酶活性不受α-鹅膏覃碱所抑制。
常用的转录抑制剂及其作用：
抑制剂靶酶抑制作用
利福霉素细菌的全酶与β亚基结合，阻止起始
链霉溶菌素细菌的核心酶与β亚基结合，阻止延长
放线菌素D 真核RNA聚合酶Ⅰ与DNA结合，并阻止延长
α-鹅膏蕈碱真核RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶Ⅱ结合
起始复合物的形成
转录可被分为4个阶段，即启动子的选择、转录起始、RNA 链的延伸和终止。
原核生物中：启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closed complex）。
真核生物RNA聚合酶Ⅱ所形成的转录起始复合物：除了RNA 聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与
一般情况下，该复合物可以进入两条不同的反应途径，
一是合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；
二是尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。RNA聚合酶的核心酶虽可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位点。
只有带б因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。б因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。
真核生物RNA Pol II的转录起始复合物
真核生物转录起始除RNA聚合酶外，至少还需要7种辅助因子参与，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。
3.2 启动子与转录起始
2、启动子与转录起始
启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与范本DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。
转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。
3.2.1 启动子区的基本结构
转录单元(transcription unit)：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。
转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5’末端的序列称为上游(upstream)，而把其后面即3’末端的序列称为下游(downstream)。
在启动子区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA 聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区(Pribnow box)，这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。
绝大部分启动子都存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区。这两段共同序列是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。
Pribnow区（Pribnow box）这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。
TTGACA。这个区的中央大约位于起点上游35bp处，所以又称为–35区。
–10位的TATA区和–35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。
在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游–25～–30 bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区（图3-7）。
另外，在起始位点上游–70～–78 bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中–35 bp区相对应的序列，称为CAAT区（CAAT box）。
在–70～–80区含有CCAAT序列（CAAT box），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。
3.2.2 启动子区的识别
氢键互补学说：RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。
这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响这一事实。
3.2.3 酶与启动子区的结合
在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。
DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。
RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。
3.2.4 -10区和-35区的最佳间距
在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。
在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变(down mutation)，如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平；另一类突变叫上升突变(up mutation)，即增加Pribnow区共同序列的同一性。
3.2.5 增强子及其功能
能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。
增强子很可能通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与范本DNA相结合，起始基因转录。
增强子与启动子的区别：
1.增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动；
2.它能在两个方向产生作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。
3.2.6 真核生物启动子对转录的影响
习惯上，将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或称上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)。
在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游–25～–30 bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区。
另外，在起始位点上游–70～–78 bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中–35 bp区相对应的序列，称为CAAT区（CAAT box）。
在–70～–80区含有CCAAT序列（CAAT box），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。
TATA区的主要作用是使转录精确地起始；
CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。
转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。
转录的终止
RNA聚合酶起始基因转录后，它就会沿着范本5’→3’方向不停地移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都必须被破坏，范本DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。
3.4 终止和抗终止
不依赖于ρ因子的终止
终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。
依赖于ρ因子的终止
ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷酸三磷酸，实际上是一种NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。
3.4.3 抗终止
抗转录终止主要有两种方式：
1.破坏终止位点RNA的茎—环结构
2.依赖于蛋白质因子的转录抗终止
3.3 原核生物与真核生物mRNA的特征比较
原核生物mRNA的特征
mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右（tRNA占16%，而rRNA则占80%以上）。原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。一个原核细胞的mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽。
3.3.1 原核生物mRNA的特征
1.原核生物mRNA的半衰期短
2.许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在
3.原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)结构
4.原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列（Shine –Dalgarno sequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA 3’端反向互补，所以被认为在核糖体
-mRNA的结合过程中起作用。
只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA （monocistronic mRNA），
把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA （polycistronic mRNA）。
多顺反子mRNA是一组相邻或相互重迭基因的转录产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子（operon），是生物体内的重要遗传单位。如大肠杆菌乳糖操纵子转录成编码3条多肽的多顺反子mRNA，经过翻译生成β半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶。
真核生物mRNA的特征
前体RNA 成熟mRNA
“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核苷酸序列！
3.3.2 真核生物mRNA的特征
1. 真核生物mRNA的5’端存在“帽子”结构：pppApNpNp 。
2. 绝大多数真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。
帽子结构
帽子被扣在了mRNA的5’端，并可能在几个位置发生甲基化。
mRNA5′端加“G”的反应是由鸟苷酸转移酶完成的。
帽子甲基化作用
帽子0：出现在所有真核生物中。
尿苷酸一7一甲基转移酶在G的7N 位甲基化
帽子1：除单细胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。
2’一甲基一转移酶
第2个碱基的2’－OH位置上（实际上在任何修饰反应进行前，它是转录物中原来的第1个碱基）
帽子2：甲基基团可以添加到戴帽mRNA的第3碱基上。这个反应的底物是已经具有两个甲基基团的帽子mRNA。
2’一甲基一转移酶催化2’－OH位置上甲基化
这种帽子通常低于戴帽群体总量的10－15％。
二、mRNA的转录后修饰－--------帽子
1、帽子的种类
帽子0（Cap-0） m7GpppXpYp----------（共有）
帽子1 （Cap-1） m7GpppXmpYp----------第一个核苷酸的2’-O 位上产生甲基化（A N6位甲基化）
帽子2（Cap-2） m7GpppXmpYm 第二个核苷酸的2’-O 位上产生甲基化（A、G、C、U）
其中:
☆单细胞真核生物只有 Cap—0
☆ Cap—1 是其余真核生物的主要帽子形
式
☆ Cap—2 存在于某些真核生物中
2、帽子结构的生成
☆甲基供体都为S—腺苷甲硫氨酸（SAM）
☆ RNA鸟苷酸转移酶-----戴帽酶（capping enzyme）
3、帽子结构的功能
（1）对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA 提供信号
Cap—0 的全部都是识别的重要信号
Cap—1,2 的甲基化能增进识别
（2）增加mRNA 的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击
（3）与某些RNA病毒的正链合成有关
（Cap—1、 Cap—2 ）
除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－m6A形式
Poly A尾巴
3、 poly(A) 的功能
（1）可能与核质转运有关
（2）与mRNA的寿命有关
（3）与翻译有关
a、缺失可抑制体外翻译的起
始
b、胚胎发育中，poly(A) 对其mRNA的翻译有影
响（非poly(A) 化的为储藏形式） c、对含 poly(A) 的mRNA 失去 poly(A) 可减弱其翻译
（4） poly(A) 在分子生物学实验中有很大应用价值
a、也可将 oligo (dT) 与载体相连，从总体RNA中分离
纯化mRNA
b、用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成
cDNA
若干基本概念
基因表达的第一步
以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板
在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下
按A ＝ U，C＝G 配对的原则，合成RNA分子
模板单链 DNA的极性方向为3’ →5’,而非模板单链
DNA的极性方向与RNA链相同，均为5’ → 3’.
模板单链 DNA的极性方向为3’ →5’,而非模板单链
DNA的极性方向与RNA链相同，均为5’ → 3’.
3.5 内含子的剪接、编辑及化学修饰
一、概述
割裂基因（split gene）：指编码某一RNA的基因中有些序列并不出现在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔开
内含子（intron）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列或基因中与这些RNA序列相应的DNA序列外显子（excon）：
RNA拼接（RNA splicing）：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟RNA分子的过程
拼接点：5’拼接点或左拼接点（内含子上游）
3’拼接点或右拼接点（……下游）
3.5.1 RNA中的内含子
真核生物mRNA前体的加工：
1. 5’端形成特殊的帽子结构
2. 在3’端切断并加上一个poly(A)的尾巴
3. 通过剪接除去转录来的IVS(非翻译区)
4. 链内部核酸的甲基化
内含子的分类
中部核心结构（central core structure）:在有些内含子中，含有4个重复的保守序列，长度为10 ~ 20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用
由于并非所有的内含子都有中部核心结构，所以有了内含子的分类
Ⅰ类（group Ⅰ）:含有中部核心结构的细胞器基因核基因
Ⅱ类（group Ⅱ）:不含有中部核心结构细胞器线粒体基因内核基因
Ⅲ类（group Ⅲ）:具有 GU－AG 特征的边界序列核基因mRNA前体
RNA基因的内元均位于 tRNA 的反密码环上
3、拼接方式
方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成
方式二：自我拼接（两类内含子Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力
方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应
3.5.2 RNA的剪接
RNA的剪接实质：就是要把断裂基因的内含子除去，连接外显子。
剪切方式：mRNA前体的剪接；自我剪接；蛋白质剪接(tRNA)。剪接体(spliceosome)：各种参与剪接的成分形成的一个体系。
Ribozyme：有酶活性的RNA。
拼接机制（Splicing mehanism )
SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接, 形成拼接体( spliceosome)。
Spliceosome 逐级组装， SnRNA（U
1、U
2
、U
5
和U
4
／U
6
）分步
替代
U1通过5，拼接点互补而结合 U2识别并结合分支点
A U1和U2作用使内元的5’端和3’端带到一起（U1与3’拼接点配对） U1、U2、mRNA与U4－U5－U6复合物形成一个完整的拼接体
3.5.3 RNA的编辑和化学修饰
RNA的编辑：是在mRNA水平上改变遗传信息的过程。
种类：单碱基突变；尿苷酸的缺失和添加化学修饰：甲基化；硫代；二价键的饱和化；去氨基化；碱基的同分异构化；核苷酸的替代。
习题
1.真核生物的TATA盒是:
A.转录的起始点
B.翻译的起始点
C.RNA聚合酶与DNA模板稳定结合处
D.DNA聚合酶的活性中心
E.DNA 合成起始位点
2.关于RNA的叙述,错误的是:
A.主要有mRNA、tRNA、rRNA三大类
B.胞质中只有一种RNA，即mRNA
C.最小的一种RNA是tRNA
D.原核生物没有hnRNA
E.原核生物没有snRNA
3.真核细胞中mRNA的加工修饰不包括:
A.在mRNA 3’末端加poly A尾
B.mRNA的前体是核内hnRNA
C.在mRNA 5’端形成7甲基鸟苷酸帽子结构
D.除去非结构信息部分
E.不同RNA片段之间的拼接
4.绝大多数真核生物mRNA 5’端有:
A.帽式结构
B.poly A
C.起始密码子
D.启动
子 E.SD序列
5. snRNA的功能是:B
A.参与DNA复制
B.参与RNA剪接
C.激活RNA聚合
酶 D.形成核糖体 E.是rRNA的前体
6.核酶(ribozyme)的底物是:
A.DNA
B.RNA
C.核糖体
D.细胞核膜
E.核蛋白
7.反义核酸作用主要是:
A.封闭DNA
B.封闭RNA
C.降解DNA
D.降解RNA
E.封闭核糖体
8.转录与DNA复制过程的共同点是:
A.需要DNA聚合酶
B.所用模板相同
C.所用原料相同
D.所得产物相同
E.需要RNA聚合酶
1.真核生物mRNA转录后的成熟步骤主要包括
①5’端形成特殊的帽子结构
②在3’端切断并加上一个poly(A)的尾巴
③通过剪接除去转录来的IVS(非翻译区)
④链内部核酸的甲基化
生物信息的传递(下)—从mRNA到蛋白质
4.1 遗传密码—三联子
1、mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的4.1.1 三联子密码及其破译
遗传密码(code)：mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密码,密码是密码子的总和。
密码子(codon)： mRNA中每个相邻的三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子。
阅读框(reading frame)：遗传密码是三个一读，称为阅读框。
AUG：蛋氨酸(Met)或起始密码
UAA、UAG、UGA：终止密码
UAG—琥珀型(amber)密码子
UGA—蛋白石(opal)密码子
UAA—赭石型(ochre)密码子
三联体密码的破译：
以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成
核糖体结合技术
4.1.2 遗传密码的性质
1.密码的简并性：
简并(Degenracy)：由一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象称为简并。
同义密码子(Synonymous codons)：对应于同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。
2.密码的普遍性与特殊性：
普遍性：无论在体外还是体内，也无论是病毒、细菌、动物还是植物，遗传密码均适用。
特殊性：线粒体密码子，其它例外(支原体、四膜虫)
线粒体mRNA中的密码子：
与胞浆中mRNA的密码子有三点不同(哺乳动物)：
1.线粒体中UGA不代表终止密码子，而是编码Trp；
2.由AUG和AUA二个密码子编码；
3.AGA和AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子，即UAA、UAG、AGA和AGG均为终止密码子。
密码子与反密码子的相互作用：
反密码子(anticodon)：指tRNA上能识别一个mRNA密码子的位置，这个位置上的碱基与密码子的碱基是互补的。
所谓“摆动假说”(Wobble hypothesis)：即密码的第一、第二碱基是必须严格按照标准配对(A-U、G-C)，而第三碱基则可以有一定程度的摆动灵活性。
Wobble hypothesis：
1.任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。
2.反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine(I)作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。
3.如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。
4.根据上述规则，至少需要32种不同的tRNA才能翻译61个codons(密码子)。
密码子—反密码子配对摆动的原则：
反密码子5’端密码子3’端
G U or C
C G only
A U only
U A or G
I U，C or A 遗传密码子的基本特点：
1.每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸；
2.两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以分离，即密码子无逗号；
3.密码子具有方向性，从N端到C端；
4.密码子有简并性；
5.共有64个密码子，其中有1个起始密码子和3个终止密码子；
6.密码子有通用性，即不论是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的。
二、tRNA
tRNA的二级结构(三叶草结构)
1. 3’端含CCA-OH序列
2. TψC环(TψC loop)：7个碱基
3.额外环(extro variable loop)：3-18个碱基
4.反密码环(anticodon loop)：7个碱基
5.二氢尿嘧啶环(dihydr-Uloop或D-loop)：8-12个碱基
6.螺旋区：4-5个碱基
4.2 tRNA
4.2.1 tRNA的L形三级结构
tRNA的三级结构主要由在二级结构中未配对碱基间形成氢键而引发的。在三叶草结构中的氢键被称为次级氢键，在三级结构中的就称为三级氢键。大部分恒定或半恒定核苷酸都参与三级氢键的形成。
4.2.2 tRNA的功能
在蛋白质生物合成过程中，tRNA主要起转运氨基酸的作用。tRNA上与多肽链合成有关的位点：
1. 3’端—CCA上的氨基酸接受位点
2. 识别氨酰tRNA合成酶的位点
3. 核糖体识别位点
4. 反密码子位点
4.2.3 tRNA的种类
起始tRNA；
延伸tRNA；
同工tRNA；
校正tRNA。
校正tRNA：分为无义突变及错义突变校正
在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。
错义突变：由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。
4.2.4 氨酰– tRNA合成酶
是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下：AA+tRNA+ATP → AA-tRNA+AMP+PPi
它实际上包括两步反应：
第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。
AA+ATP+酶（E）→ E-AA-AMP+PPi
第二步是氨酰基转移到tRNA 3' 末端腺苷残基的2' 或3'-羟基上。
E-AA-AMP+tRNA → AA-tRNA+E+AMP
4.3 核糖体
4.3.3 核糖体的功能
4.3.1 核糖体的结构
由几十种蛋白质和几种rRNA组成。
包括两个亚基，大亚基约为小亚基相对分子质量的一倍。每个亚基包含一个主要的rRNA成分和许多不同功能的蛋白质分子。
核糖体上有不止一个的活性中心，每一个这样的中心都由一组特殊的蛋白质构成。
核糖体的基本功能依赖于其中的rRNA，核糖体蛋白质起着加强rRNA功能的作用。
多聚核糖体(polyribosome)：在执行蛋白质合成功能时，单个核糖核蛋白体经常5-6个或更多个串联在一起，形成一个聚合体，称为多核蛋白体或多核糖体(polyribosome或polysome)。
4.3.2 rRNA
rRNA的基本特点
1. rRNA是单链RNA。
2.G-C碱基对与A-U碱基对的总量不等。
3.单股rRNA链可自行折叠，形成螺旋区和环区，所有螺旋区的碱基都是保守的。
4.所有来源rRNA均能形成4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，每个结构域均含许多茎(螺旋段)和环，它们通过无距离碱基对的相互反应彼此靠近。
5.绝大多数的rRNA碱基的特异功能尚不清楚。
rRNA 1、5S rRNA: 含与tRNA和23S rRNA识别序列
2、16S rRNA：含与mRNA5’端和 23SrRNA互补序列。
3、23S rRNA ：存在一段能与tRNAMet序列互补的片段，5S rRNA互补序列。
4、5.8S rRNA ：与tRNA作用的识别序列，同5SrRNA。
5、18S rRNA ：与16SrRNA同源。
6、28S rRNA
4.3.3 核糖体的功能
核糖体必须包括至少5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位）、结合或接受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及形成肽键的部位（转肽酶中心）。核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，如起始部分的识别、密码子与反密码子的相互作用等，mRNA的结合位点也在此亚基上
大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、
AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等，A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。
4.4 蛋白质合成的生物学机制
4.4.1 氨基酸的活化
氨基酸必须在氨基酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA。
tRNA与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤，因为只要tRNA携带了正确的氨基酸，多肽合成的准确性就相对有了保障。
4.4.2 翻译的起始
起始密码子和起始信号：
1.mRNA上的起始密码子常为AUG，少数为GUG
2.在mRNA起始密码子上游8-13个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列，称为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它和16S rRNA 3’端有一个互补的序列，它们互相识别，以保证起始的正确性。
Eukaryotic ribosomes migrate from the 5 end of mRNA to the ribosome binding site, which includes an AUG initiation codon.
翻译的起始：
第一步，30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，再在SD序列的帮助下与mRNA模板结合。
第二步，在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。
原核生物的翻译的起始因子：
IF-1 9.5kd 加强IF-2，IF-3的酶活
IF-2 95kd-117kd 促使fMet-tRNAfMet选择性的结合在30S亚基上
IF-3 20kd 促使30S亚基结合于mRNA起始部分，阻碍30S与50S亚基的结合
真核生物
蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有
m7GpppNp帽子结构，Met-tRNA Met不甲酰化，mRNA分子5' 端的“帽子”参与形成翻译起始复合物。
真核生物的翻译的起始因子：
eIF2 3种亚基形成三元起始复合体
(eIF2,GTP,tRNA)
eIF2-A 65kd Met-tRNAmet与40S
亚基结合
eIF1 15kd 促使mRNA与40S 亚基结合
eIF3 ＞500kd 促使mRNA与40S亚基结合
eIF4b 80kd 促使mRNA与40S亚基结合
eIF4a 50kd 促使与mRNA，GTP 结合
eIF4c 19kd 促使两
亚基结合
eIF5 150kd 释放
eIF2，eIF3
eIF4e(eIF4f的亚基) 与5’端帽子结合
4.4.3 肽链的延伸
过程：后续AA-tRNA与核糖体结合
肽链的生成
移位
延伸因子：EF-Tu，EF-Ts，EF-G(原核生物)
EF-1,EF-2(真核生物)
2个GTP
后续AA-tRNA与核糖体结合
细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨基酰-tRNA的结合。该氨基酰-tRNA首先与EF-Tu · GTP形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP并使EF-Tu结合另一分子GTP，进入新一轮循环。
肽键的生成
核糖体·mRNA·AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNA fMet占据P位。在肽基转移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNA fMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。
移位
肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向mRNA 3' 端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基tRNA
2
从A位进入P位，去氨基酰-tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。EF-G是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解。
4.4.4 肽链的终止
终止因子：
原核生物有3种蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1用于识别终止密码子UAA、UAG；RF2帮助识别UAA、UAG；RF3不识别终止密码子，主要是协助肽的释放。一旦tRNA从核糖体上脱落，则核糖体立即离开mRNA，并解离成50S和30S亚基，核糖体可以重复使用。
真核生物仅一种：RF
4.4.5 蛋白质前体的加工
1.N端fMet或Met的切除
2.二硫键的形成：蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成
3.特定氨基酸的修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化
4.切除新生肽链中的非功能片段
糖蛋白中常见的糖—肽连接键：
N—糖苷键：β-N-乙酰氨基葡萄糖基-天冬酰胺
(GlcNAc-Asn)
O—糖苷键：α-N-乙酰氨基半乳糖基-丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)
4.4.6 蛋白质合成的抑制剂
1.抗生素类阻断剂：
链霉素、卡那霉素、新霉素等：竞争性抑制蛋白质合成
四环素和土霉素：四环素阻止氨酰-tRNA转移到A位置
氯霉素：阻断50S亚基的活性
嘌呤霉素(Puromycin)
白喉霉素(diphtheria toxin)：与延长因子发生作用
2.干扰素对病毒蛋白合成的抑制：
从白细胞中得到α-干扰素，从成纤维细胞中得到β-干扰素，在免疫细胞中得到γ-干扰素。
抗生素抑制蛋白质生物合成的原理
抗生素作用点作用原理
四环素族原核核蛋白体小亚基抑制氨酰- tRNA与小亚基结合
氯霉素原核核蛋白体大亚基抑制转肽酶，阻断延长
链霉素/卡那霉素原核核蛋白体小亚基改变
构象引起读码错误，
抑制起始嘌呤霉素原、真核核蛋白体大亚基抑制转肽酶，妨碍移位
放线菌酮真核核蛋白体大亚基抑制
转肽酶，阻断延长
红霉素原核核糖体大亚基阻断移位，阻断Pro合成延长
4.4.7 RNA分子在生物进化中的地位
RNA在生命起源中的地位及其演化过程
生命是自我复制的体系：
三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。
核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。
由RNA催化产生了蛋白质
DNA代替了RNA的遗传信息功能
DNA双链比RNA单链稳定；
DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能
蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；
与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。
4.5 蛋白质运转机制
蛋白质运转类别
若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译运转同步机制；
若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后运转机制。
这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜
结构的相互关系。
4.5.1 翻译—运转同步机制
信号序列(signal sequence)：在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列就被称为信号序列。
信号肽(signal peptide)：绝大多数越膜蛋白的N端都具有长度大约在13-36个残基之间的以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。
信号肽的结构特点：1.一般带有10-15个疏水氨基酸
2.常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸
3.在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)
信号序列的基本作用：
1.通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网结合
2.通过信号序列的疏水性，引导新生肽跨膜转运SRP & DP 信号识别颗粒(signal recognition partical，SRP)：是一种核糖核酸蛋白复合体，它的作用是识别信号序列，并将核糖体引导到内质网上。
停靠蛋白(docking protein，DP，又称SRP受体蛋白)：即SRP在内质网膜上的受体蛋白，它能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合，使它在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。
信号肽假说(signal hypothesis)：
提出：G.Blobel & B.Dobborstein(1975)
证明：基因重组实验
核心内容：核糖体同内质网的结合受制于mRNA中特定的密码序列(可以翻译成信号肽)，具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。
已知野生型细胞中，β-半乳糖酶定位于胞质内，麦芽糖结合蛋白定位于胞外，麦芽糖运转蛋白位于外膜内腔。如果把β-半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白的氨基端基因片段相连，并以此为模板指导合成杂种蛋白质，就可以通过测定β-半乳糖酶的活性确定杂种蛋白质在细胞内的位置。
4.5.2 翻译后运转机制
1.线粒体蛋白质的跨膜运输
2.叶绿体蛋白质的跨膜运输
翻译后运转机制
线粒体蛋白质的跨膜运转
通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。这个过程有如下特征：①通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽（leader peptide）共同组成。②蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需能过程；③蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。
前导肽的作用与性质
拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。
前导肽一般具有如下特性：带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）α-螺旋结构的能力。
叶绿体蛋白质的跨膜运转
叶绿体定位信号肽一般有两个部分，第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。在这一模型中，蛋白质运转是在翻译后进行的，在运转过程中没有蛋白质的合成。
叶绿体蛋白质运转过程有如下特点：
①活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内，这是鉴别翻译后运转的指标之一。
②叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。
③叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不
同而表现出明显的差异。
4.5.3 核定位蛋白的运转机制
核定位序列（NLS—Nuclear Localization Sequence） NLS 可以位于核蛋白的任何部位。
蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的
蛋白因子包括核运转因子（Importin）α、β和一个低分子量GTP酶（Ran）参与。由上述三个蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠Ran GTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。
细菌同样能通过定位于蛋白质N-端的信号肽将新合成的多肽运转到其内膜、外膜、双层膜之间或细胞外等不同部位。
4.5.4 蛋白质的降解
在大肠杆菌中，蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，该酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一个肽键要消耗两个分子的ATP。
成熟蛋白N-端的第一个氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物）在蛋白的降解中有着举足轻重的影响（表4-16）。当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3分钟就被降解了。
在真核生物中，蛋白质的降解依赖于泛蛋白（Ubiquitin），该蛋白只有76个氨基酸残基，序列高度保守（从酵母和人细胞中提取的泛蛋白几乎完全相同！），生物细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛蛋白相连。这个过程需有E1、E2、E3三个降解因子参与。一旦被降解蛋白与泛蛋白相连接，这个复合体就能被运送到分子量高达1×106的蛋白降解体系中直到完全降解。
习题
1.遗传密码的摆动性是指:
A.遗传密码可以互换
B.密码的第3位碱基与反密码的第1位碱基可以不严格互补
C.一种密码可以代表不同的氨基酸
D.密码与反密码可任意配对
E.不同的氨基酸具有相
同密码
2.反密码子IGC可以识别的密码子是:
A.GCG
B.GCA
C.ACG
D.ICG
3.关于tRNA的叙述,下列哪项是错误的:
A.有反密码子,能识别mRNA分子的密码
B.由氨基酸臂携带氨基酸
C.一种tRNA能携带多种氨基酸
D.一种氨基酸可由数种特定的tRNA运载
E.20种氨基酸都各有其特定的tRNA
4.真核生物的翻译起始复合物在何处形成?
A.起始密码子AUG处
B.5’末端的帽子结
构 C.TATA框 D.CAAT框
5.合成蛋白质后才由前体转变而成的氨基酸是:
A.脯氨酸
B.羟脯氨酸
C.丝氨酸
D.赖氨酸
6.下列哪种抗生素兼可抑制原核生物与真核生物的蛋白质
生物合成?
A.环己酰亚胺(放线菌酮)
B.氯霉素
C.四环素
D.链霉素
E.嘌呤霉素
7.细胞合成的分泌蛋白质在N端都有一段信号肽,这些信号肽的长度是多少个氨基酸残基:
A.大于100
B.15到30
C.约50
D.小于10
8.信号识别颗粒(signal recognition particle)的作用是:
A.指导RNA剪切
B.引导分泌蛋白质跨膜
C.指引核糖体大小亚基结合
D.直到转录终止
5 分子生物学研究法
现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步使得分子生物学研究在上个世纪中叶开始高速发展。
5.1 重组DNA技术发展史上的重大事件
上世纪分子生物学研究取得的三大成就：
第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；
第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
1.DNA是遗传物质的实验
40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA 而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
Hershey和Chase（1952）的噬菌体侵染细菌实验
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但是：
当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
重组DNA技术（recombination）
" 重组DNA技术：
是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。" 工具酶：
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
DNA连接酶（DNA ligase）
工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件
两大技术保证：
1.DNA的体外切割和连接
重组DNA实验中常见的主要工具酶2.DNA的核苷酸序列分析技术
DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA 片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
分子生物学研究的核心技术
基因操作（gene manipulation）：
DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。
基因工程（gene engineering）：
是指在体外将核酸分子接入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内而能持续的繁殖。
5.2 DNA操作技术
5.2.1 核酸的凝胶电泳
v 电泳的基本原理：
一种带电粒子在电场中，会以一定的速度移向与它自身带相反电荷的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
v 核酸的凝胶电泳：
酶类功能
限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNA
DNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA
片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，
补平DNA双链中的缺口
反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据
碱基互补原则合成DNA链
多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的
5'-OH末端（进行末端标记实验或
用来进行DNA的连接
末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单
核苷酸
DNA外切酶III 从DNA链的3'末端逐个切除单核
苷酸
λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核
苷酸
碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端的磷
酸基团
糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净负电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。v 影响迁移率的四大因素:
一、分子物理性质：
分子大小：大的迁移快
电荷多少：电荷密度大的迁移快
构形：闭环(CCC)>单链开环(OC) >线性(L)
二、支持介质：
在电泳中常用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等，其分子的迁移率与分子的摩擦系数成反比。其中，摩擦系数与凝胶密度相关。
三、电场强度：
电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电
压梯度。在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但当电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。电场强度愈大，带电颗粒的泳动速度愈快。
四、缓冲液离子强度：
缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。常用的缓冲体系有Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（ TBE ）、 Tris-磷酸（ TPE ）三种。以TAE 最为常用，价格低且其缓冲能力低，需经常更新
脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，简称PFGE）:
用于分离超大分子量（有时甚至是整条染色体）DNA。
在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45°夹角，而第二个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45°夹角。
应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功地分离到分子量高达107bp的DNA大分子。
核酸电泳的指示剂:
电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝呈蓝紫色，二甲苯青呈蓝色。
溴酚蓝的分子量为670Da，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为554.6Da，携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶电泳中，迁移率比溴酚蓝慢。
核酸电泳的染色剂:
溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA 或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。溴化乙锭不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合。
在适当的染色条件下（0.5 ug/ml），荧光强度与DNA片段的大小（或数量）成正比。
5.2.2 核酸的分子杂交
定义：
核酸杂交（Nucleic acid hybridization）：是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。
原理：
DNA的变性和复性
在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA 的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性（Denaturation）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。DNA的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA在一定的条件下（低于Tm的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。
影响杂交的主要因素：
温度：一般在低于Tm约15至25度的温度下杂交速率最快。盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M时，对复性速度和Tm值影响不大。
甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少
0.72℃。常用50%甲酰胺。
硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。核酸探针的类型
1 克隆的DNA片段，常用cDNA探针。
2 RNA探针（Riboprobe）
RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。
3 寡核苷酸探针
可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。
4 聚合酶链反应扩增产物
是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。
核酸标记的类型：
放射性同位素：32P, 35S , 33P
目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。
非同位素标记：
常用地高辛或生物素系统。
优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。常用核酸杂交技术
滤膜杂交
固相杂交
原位杂交
核酸杂交
液相杂交
滤膜杂交：是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上，然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。
滤膜杂交的基本过程
1. 核酸探针的制备和标记；
2. 核酸片段的凝胶电泳分离；
3. 将凝胶中的核酸片段通过印迹（blot）转移到某种固相支持物上；
4. 用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交；
5. 洗膜（除去未杂交的游离探针等）；
6. 检测带标记的杂交分子（放射自显影或酶联反应）。
常见的几种滤膜杂交
1. Southern印迹：指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。
Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA
的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基
因突变分析等。
2. Northern印迹：是指RNA经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA 分子的含量与大小。
基本过程包括：
1.RNA的提取
2.RNA变性电泳
3.RNA转移和固定
4.杂交
5.检测
除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外，其余基本与Southern印迹同，关键是减少实验中的RNA酶污染。Northern blotting（诺赛恩RNA印迹技术）
是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。3 蛋白质杂交技术（Western blotting）：又称为immunoblotting，指将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应的技术。
基因探针(probe)：就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分，可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA
探针的种类：基因组探针(genomic probe)；cDNA探针(cDNA probe)；寡核苷酸探针(人工合成的)。
探针的标记：放射性同位素：如32P；非同位素：如生物素、地高辛。
理想标记物特点
一种理想的标记物，应具备以下几种特性：①高度灵敏性；
②标记物与核酸探分子的结合，应绝对不能影响其碱基配对特异性；③应不影响探针分子的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性，杂交体的Tm应无较大的改变；④检测方法具有高度特异性。
1、放射性同位素：灵敏度和特异性高、应用广泛；易造成放射性污染、半衰期短。32P、3H和35S
2、非放射性同位素：无放射性污染，稳定性好；灵敏度和特异性不太高。半抗原、配体结合生物素、地高辛和荧光素。Probe synthesis
Nick Translation切口平移法
Random Priming随机引物合成法
End labeling末端标记法
5.2.3 细菌转化
细菌转化:
是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。
感受态细胞:
处于能够接受外源DNA状态的细胞称为。
步骤：
1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。
2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。
3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。
4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复
5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。
5.2.4 核苷酸序列分析
1968年华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略
Sanger在它的基础之上发展了快速测定DNA的末端终止法
K Mullis完善了PCR扩增DNA方法
1、Sanger双脱氧链终止法
这种方法要求使用一种单链DNA模板和一种适当的DNA引物，因此有时也称为引物合成法或酶催引物合成法。
由于ddTTP没有3'-OH基团，寡核苷酸链不再继续延长，在本该由dTTP掺入的位置上发生了特异性的链终止效应。
2、Maxam-Gilbert化学修饰法
用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生的一组具有各种不同长度的DNA片段的反应混合物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，便可根据X光片底板上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。
Gilbert & Maxam的化学修饰法
G系统： pH 8.0
硫酸二甲酯→ G → m7G →C8~C9断裂→脱G
A+G系统：pH 2.0
哌啶甲酸（pidine）→嘌呤环 N质子化→脱嘌呤
C系统: 1.5 mol/L NaCl
C + 肼（hydrazine）→脱C
T + C系统:
肼(hydrazine) →打开嘧啶环→重新5C环化→脱嘧啶
3. DNA序列测定的自动化
1. DNA测序步骤与自动化
1）模板制备可自动化
2）定序反应可自动化
3）凝胶电泳自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。
4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化
2.自动测序仪
Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。
红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）
黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）
绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）
兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）3、DNA序列分析的自动化
采用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作为荧光剂，预先标记引物DNA。带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。
电泳过程中，当DNA条带在电场的作用下，经过激光通道小孔时，带有荧光剂标记的DNA在激光的激发下便产生了荧光。4、DNA杂交测序法（SBH）
利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。
5.2.5 基因扩增（PCR）
PCR的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
（一）PCR的基本过程
1. 变性（Denaturation）：待扩增的DNA模板加热变性成单链；
2. 退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；
3. 延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA 聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。
" PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。（二）PCR体系中的主要成份
1. Taq DNA 聚合酶
" 它是一种耐热的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性，一般有5’-3外切酶活性，有或无3’-5’外切酶活性（校对活性），无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。
2. 寡核苷酸引物
" 它是决定PCR扩增特异性的关键。PCR中所用引物浓度一般在0.1-0.5uM太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合成效率。
3. MgCl
2
– Mg2+浓度除影响Taq酶活性外，还影响双链DNA的Tm 值，因而影响PCR的特异性和扩增效率。
– PCR中的最适MgCl
2
浓度一般为1.5-2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA 等的浓度有关。
4. 脱氧核苷三磷酸（dNTP）
–一般采用均衡的dNTP浓度，4 种dNTP各为
200umol/L,dNTP可减少游离Mg2+，因此影响聚合酶活性和引物退火。
5. 模板
–单、双链DNA，以及RNA经逆转录合成的cDNA。PCR技术的研究应用
1、基因组克隆
2、反向PCR与染色体步移
3、RT－PCR与RNA分析
4、基因的体外诱变与突变的检测
5、基因组的比较研究(RAPD)
5.2.6 DNA与蛋白质相互作用研究
5.2.
6.1. 凝胶阻滞试验
凝胶阻滞试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。载体
指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA 分子称为载体。载体是基因克隆中外源DNA片段的重要运载工具。
载体必须具备的条件：
①复制起点：是一段具有特殊结构的DNA序列，载体有复制起点才能使其及与其结合的外源基因在适当的宿主细胞中复制繁殖。
②有一个或多个筛选标记，如抗药性、显色表型反应等以区别阳性和阴性重组子。
③多克隆位点:多种限制性内切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。
④适当的拷贝数。一般而言，较高的拷贝数不仅利于载体的制备，同时还会使细胞中克隆基因的剂量增加。
⑤载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应易于分离，便于提纯。
⑥对于表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、加尾信号、增强子等DNA调控信号。
载体的类型：
质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体等。
质粒(plasmid)
是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。
质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状，如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。
基因组文库与cDNA文库的构建
一基因组文库的构建
二 cDNA文库的构建
Ⅰ真核基因组文库
" 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体，构建基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体" 常用的构建真核生物细胞基因组文库的载体是λ噬菌体和粘性质粒。
构建基因组文库的步骤
1、载体的制备
2、基因组DNA的制备
3、载体与基因组DNA的连接
4、体外包装提取物的制备和重组DNA的体外包装
5、重组噬菌体滴度的检测、扩增与保存基因组文库
Ⅱ cDNA文库的构建
" cDNA文库：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。这样的克隆群体叫做cDNA文库。
" cDNA文库可直接进行筛选目的基因，由于cDNA中不含内含子，因此所筛选的基因可以直接表达。
构建cDNA文库主要包括以下几个步骤：
1、 mRNA的分离
2、cDNA第一链的合成
3、cDNA第二链的合成
4、cDNA与载体的连接：
5、噬菌体的包装、转染和质粒DNA的转化
" 如果用质粒DNA做载体，cDNA与载体连接后可直接转染宿主细胞，建立cDNA文库。如采用噬菌体为载体，必需经过体外包装，形成噬菌体颗粒，感染宿主菌。
RNA提取
将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。
5.4 基因的分离与鉴定
基因克隆(gene cloning)：又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
基本步骤：
(1) 用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化；
(2) 外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；
(3) 将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；
(4) 重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。
5.4.4 克隆基因的分离
1、应用核酸探针分离克隆目的基因
2、应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因
3、应用cDNA差示分析法克隆基因
4、应用酵母双杂交体系克隆基因
5、基因的图位克隆法
6、DNA微列阵技术进行基因克隆
1. 应用核酸探针分离克隆目的基因
把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。
应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。
此法应用广泛、有效，适用于大规模筛选。
2. 应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因
看家基因（house-keeping gene），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；
发育调控基因（developmental regulated gene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differential expression）。
DDRT-PCR的主要操作步骤如下：
（1）从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3‘锚定引物作为反转录的引物，合成第一链cDNA；
（2）用5'随机引物和某个3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)；
（3）用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；
（4）回收特异性差别条带；
（5）用同一引物对扩增已回收的DNA条带；
（6）用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；（7）以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。
基因的图位克隆法（Map-based cloning）
所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离
出来。
根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cm≈1000kb；拟南芥菜中，
1cm≈290kb；小麦中，1cm≈3500kb。
本章重点
基因组文库和cDNA文库构建过程及应用PCR技术原理及应用
分子生物学中常用载体的特征
核酸杂交原理（Southern Blotting, Northern Blotting, 菌落杂交等）
探针制备方法
DNA与蛋白质相互作用的研究方法
Sanger DNA测序原理
基因分离方法
影响电泳迁移率的因素
重要概念
基因差别表达、基因克隆、cDNA文库、基因工程、基因探针、转化、质粒
基因表达的调控
本章内容简介
一、基因表达调控的基本概念与原理
二、乳糖操纵子的调控模式
三、色氨酸操纵子的调控模式
一、基因表达调控的基本概念与原理
1.基本概念：
基因表达(gene expression) ：从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，基因表达的实质就是遗传信息的转录和翻译。
基因表达的调控(gene regulation or gene control) ：对基因表达过程的调节就称为基因表达调控。
2.基因表达的时间性及空间性
基因表达的时间特异性(temporal specificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。故又称为阶段特异性。
基因表达的空间特异性（spatial specificity）是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。故又称为细胞特异性或组织特异性。
3.基因表达的方式
组成性基因表达（constitutive gene expression）是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因
表达。其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。这类基因通常被称为管家基因（housekeeping gene）。
诱导表达（induction）是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。
阻遏表达（repression）是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。
分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；
（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度 3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
综述：进化论与进化生物学的发展自达尔文1859年发表《物种起源》（The Origin of Species）一书以来，“进化”（evolution）已逐渐成为生物学文献中出现频率最高的词汇之一，进化生物学（evolutionary biology）则成为当今生命科学中一个重要的前沿领域。 纵观150年来，随着科学界对生物进化现象的认识不断深化，人们对达尔文进化论的理解也随之不断深入，进化论自身也走过了曲折的发展之路。除了像其他任何一种科学理论一样需要补充和修正外，进化论还经受了来自科学领域之外的一次又一次挑战。今天，分子水平的生物进化研究正在蓬勃兴起，人们对进化论的兴趣有增无减，同时也提出了更高的要求，即以进化论为核心的进化生物学研究不仅应能够解释各种复杂生命现象，重建生物的自然历史，而且还应具有一定的预测性和应用潜力。因而，藉纪念达尔文（C. Darwin）诞辰200周年和《物种起源》出版150周年之际，回顾进化论与进化生物学的发展历程，将有助于我们全面了解该领域的科学理论与知识，并用于指导21世纪生命科学的研究。 进化论的科学本质 进化论从本质上改变了人们对地球生命现象的理解。进化论围绕生物多样性的起源与发展，引导人们探索各种生物之间的亲缘关系（或称进化谱系）。例如，作为地球生物的一员，人类究竟何时又是如何在地球上出现的？不同人种或不同人群之间关系如何？人类与其他生物（如细菌）有何种进化上的关联？如此等等，进化论为我们提供了科学的解释。 在进化论中，具有有益性状的生物存在差异的繁殖优势被称为自然选择（natural selection），因为是自然来“选择”提高生物生存与繁殖能力的性状。如果生物的突变性状降低其生存与繁殖能力的话，自然选择就会减少这些性状在生物群体中的扩散。人工选择也是一个类似的过程，但在这种情况下是人而不是自然环境使生物交配以选择理想的性状。最常见的莫过于通过人工选择来获得人们所需的家畜品系和园艺植物品种等。 迄今为止，支持进化论的证据层出不穷，从中华龙鸟化石的发现到酵母实验进化的分析，不胜枚举[1]。近年来比较突出的例子有加拿大北部“大淡水鱼”化石的发现。科学家们根据进化理论和化石分析预测出浅水鱼类向陆地过渡阶段的大致时间，随后他们将目光投向加拿大北部努维特地区的埃尔斯米尔岛，那里有大约37 500万年前的沉积岩。通过四年的努力，科学家们终于从岩层中发掘出命名为“Tiktaalik”（因纽特人的语言中意为“大淡水鱼”）的生物化石，它既具有许多鱼类特征，又具有早期四足动物的典型特征，而它的鳍包含骨骼，可形成类似于有肢动物的肢体，用来移动和支撑躯体[2]。“大淡水鱼”的发现证实了科学家们基于进化论的预测。反过来，对于进化论预测的证实也提高了达尔文理论的可信度。的确，每一种科学理论本质上都要具备对尚未观察到的自然事件或现象作出预测的能力。 另一个经典的例子是科学家们对特立尼达岛阿立波河中的虹鳉鱼进行的观察与实验。按照进化理论，不同时间尺度上的自然选择可能产生全然不同的进化效应。在仅仅几个时代的周期内，生物个体就有可能产生小规模的变异，可称之为微进化（microevolution）。科学家们发现，生活在阿立波河中的虹鳉鱼无论是其幼体还是成体均遭受较大鱼类的捕食，生活在河流上游小溪中的虹鳉鱼只有其幼体会被较小鱼类捕食，因而长期的进化过程导致该河流中的虹鳉鱼个体较小（更易于躲避捕食者），而溪流中的虹鳉鱼则个体较大（不易被较小的鱼类捕食）。科学家们将河流中的虹鳉鱼置于原来没有虹鳉鱼种群的溪流中，发现它们仅仅在20代后就进化出了溪流中虹鳉鱼的特性[3]。 毋庸讳言，在科学上，我们不可能绝对肯定地证明某种解释是完美无缺的，或者是终结性的。然而，迄今为止，许多科学解释已经被人们反复检验，不断增添的新观察结果或新的实验分析很难对其作出重大改变。换言之，科学界已广泛接受这些解释，它们是以观察自然世界获得的证据为基础的。进化理论就是其中一个代表。从这一点出发，我们可以明确地将
分子生物学复习题(有详细答案)
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绪论 思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？ 广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。 狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是 后基因组时代？ 研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。 反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。 后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了“脱氧核糖核苷酸的结构”的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？ 随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。 第四章 思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？ 概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。 发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分
《分子生物学大（综合）实验》课程介绍 课程代码（学校统一编制） 课程名称分子生物学大（综合）实验 英文名称MolecularBiologyBigExperiment 学分：3修读期：第七学期 授课对象：生物科学、生物技术 课程主任：姓名、职称、学位 关洪斌，副教授，博士 课程简介 21世记是生命科学的世记,而分子生物学是带动生命科学的前沿科学。分子生物学是在生物大分子水平上研究细胞的结构、功能及调控的学科,在现代生物学学科发展中的重要性与不容置疑的带头作用是众所周知的。许多重大的理论和技术问题都将依赖于分子生物学的突破。随着分子生物学研究工作的不断深入,相关实验技术方法和技术日新月异的发展。为了适应分子生物学研究工作日益发展的需要,满足培养从事现代生物学研究,尤其是进行分子生物学研究的人才的需要,特设置分子生物学大（综合）实验课程。本课程的教学目标和基本要求是使学习者基本掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法,教学内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。通过本实验可提高学生的动手能力和创造性思维能力,较好地掌握分子生物学实验操作和技能，为今后独立进行科研工作打下坚实基础。 实践教学环节（如果有） 实验内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。 课程考核 实验报告 指定教材 自编 参考书目 1.分子生物学实验指导高等教育出版社施普林格出版社，1999 2.彭秀玲,袁汉英等.基因工程实验技术.湖南科学技术出版社,1997 3.吴乃虎.基因工程原理(上下册).科学出版社,1998 4.F.奥斯伯等著:颜子颖,王海林译.分子克隆实验指南(第二版).科学出版社,1998 5.J.萨姆布鲁克等著:金冬雁,黎孟枫等译.精编分子生物学实验指南.科学出版社,1993
分子生物学笔记 ? ?第一章基因的结构第一节基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列． 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和， 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP） 基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）
第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中． ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 二、真核基因组中DNA序列的分类？ (一)高度重复序列(重复次数>lO5) 卫星DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列 1．中度重复序列的特点 ①重复单位序列相似，但不完全一样， ②散在分布于基因组中． ③序列的长度和拷贝数非常不均一， ④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记． ⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)， 2．中度重复序列的分类 ①长散在重复序列(long interspersed repeated segments．)LINES ②短散在重复序列(Short interspersed repeated segments)SINES SINES：长度<500bp，拷贝数>105．如人Alu序列 LINEs：长度>1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl (三)单拷贝序列(Unique Sequence) 包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列， 三、基因家族(gene family)
现代分子生物学 第一章 DNA的发现： 1928年，英国Griffith的体内转化实验 1944年，Avery的体外转化实验 1952年，Hershey和Chase的噬菌体转导实验 分子生物学主要研究内容（p11） DNA的重组技术 基因表达调控研究 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 基因组，功能基因组与生物信息学研究 第二章 DNA RNA组成 脱氧核糖核酸 A T G C 核糖核酸 A U G C 原核生物DNA的主要特征 ①一般只有一条染色体且带有单拷贝基因； ②整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列组成； ③几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。 染色体作为遗传物质的特点： （1）分子结构相对稳定（贮存遗传信息） （2）通过自我复制使前后代保持连续性（传递遗传信息） （3）通过指导蛋白质合成控制生物状态（表达遗传信息） （4）引起生物遗传的变异（改变遗传信息） C值以及C值反常 C值单倍体基因组DNA的总量 C值反常C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值。如果这些DNA 都是编码蛋白质的功能基因，那么，很难想象在两个相近的物种中，他们的基因数目会 相差100倍，由此推断，许多DNA序列可能不编码蛋白质，是没有生理功能的。 DNA的中度重复序列，高度重复序列 中度各种rRNA，tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因都属于这一类 高度卫星DNA 核小体 是由H2A H2B H3 H4 各2分子生成的八聚体和约200bp的DNA构成的，H1在核小体外面。 真核生物基因组的结构特点 ①基因组庞大； ②大量重复序列； ③大部分为非编码序列，90％以上； ④转录产物为单顺反子； ⑤断裂基因； ⑥大量的顺式作用元件； ⑦DNA多态性：SNP和串联重复序列多态性； ⑧端粒（telomere）结构。
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一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。
二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白
真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。
基于特定引物PCR的DNA分子标记技术研究进展 摘要： PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记技术。SSR、SCAR、SRAP 和TRAP是四种最新发展的基于特定引物PCR的新型DNA分子标记技术，具有简便、高效、重复性好等优点，已在遗传育种的种质资源等各个方面得到广泛应用。介绍了这四种分子标记的基本原理和特点，综述了它们在分子生物学研究中的应用。 关键词：分子标记SSR SCAR SRAP TRAP DNA分子标记技术的研究始于1980年，本质上是指能反映生物个体或种群间基因组某种差异的特异性DNA片段，DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称DNA的指纹图谱。与其他几种遗传标记相比具有的优越性有：大多数分子标记为显性，对隐性的农艺形状的选择十分便利;基因组变异及其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标形状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。目前DNA分子标记技术已有数十种，主要可分为4大类:基于分子杂交的DNA 分子标记技术;基于随机/特定引物PG R的DNA分子标记技术;基子限制性酶切与PCR技术的分子标记技术;基于芯片技术的DNA分子标记技术。概述新型的基于特定引物PCR的DNA分子标记技术，包括SSR,SCAR,SRAP和TRAP。目前这些I3;VA分子标记技术的应用仍具有相当的局限性，如何将它们有效地利用于分子生物学研究是函待解决的问。 1序列特异扩增区域SCAR 1. 1 SCAR标记的原理 序列特异扩增区域(sequence characterised am-plifiedreginn)简称SCAR标记，是1993年Paran和Michelma记[1]]建立的一种可靠、稳定、可长期利用的RAPD 标记技术。SCAR标记的基本流程:先用随机引物进行RAPD筛选，获取特异的RAPD标记，然后对标记进行克隆和测序，根据测定RADII标记两末端的序列设计一对引物，此引物通常包含有原来的RAPD引物序列，多为20-24，再用该引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，这样就可以把与原来的RAPI3片段相对应的单一位点鉴定出来。 1. 2 SCAR标记的特点 SCAR标记方便、快捷、可靠，适合于大量个体的快速检测，结果稳定性好，重复性高。由干SCAR标记使用的引物长，因而试验的可重复性高，它克服了RAPD重复性欠佳的弱点，同时具有STS标记的优点，因此比RAPn及其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好，在分子标记辅助育种、种质资源鉴别等方面有着潜在的应用前景，SCAR标记是共显性遗传的。待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，这甚至可省却电泳的步骤。由于RAPD 扩增过程中错配几率较高，RAPD标记片段同源性高导致SCAR标记的转化成功
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
分子生物学手段 在土壤污染生物修复中的应用 摘要: 污染土壤的修复技术主要有物理修复、化学修复和生物修复，文章 综述了分子生物学技术包括环境微生物群落降解基因分析、16S rRNA序列 分析技术以及荧光原位杂交技术在生物修复技术中跟踪污染土壤中降解微 生物行为、监测降解基因和微生物群落变化，揭示了其中的分子机制的应 用现状，对各项技术应用中需要注意的问题进行了讨论并对其发展前景进 行了展望。 关键词: 分子生物学；降解基因；16S rRNA；FISH Molecular biology techniques in bioremediation of soil: Current status and future Abstract：This review starts with a brief overview of the molecular biology techniques applied to the bioremediation of soil. The principles of the catabolic gene probe analysis of microbial community, 16S rRNA sequence analysis and fluorescent in situ hybridization (FISH) and their applications to monitoring the fate of contaminant-degrading microorganisms, detecting catabolic gene and analyzing the changes of microbial community in contaminated soil are highlighted. The problems and prospects of these techniques are discussed. Key words: molecular biology; catabolic gene; 16S rRNA; FISH
分子生物学笔记第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列. 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控 序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene) ，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划( human genome project, HGP ) 基因组学( genomics ),结构基因组学( structural genomics )和功能基因组学( functional genomics )。 蛋白质组( proteome )和蛋白质组学( proteomics ) 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中. ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2 —>% ), 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因. 可能由某一共同祖先基因(ancestral gene) 经重复(duplication) 和突变产生。 基因家族的特点： ①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如 rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生 有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene) . ￥ a1表示与a1相似的假基因. 四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同． 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1 ．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3 .细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1 .每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA ; 2 .病毒核酸大小差别很大，3X10 3 一3X106bp ; 3.除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4 .大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成. 5. 真核病毒基因有内含子，而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子. 6. 有重叠基因. 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone): 一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力. (二).端粒(telomere) ：真核生物线状染色体分子末端的DNA 区域端粒DNA的特点： 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb). 人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。
分子生物学（molecular biology ）从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。 重点研究下述领域： （1）蛋白质（包括酶）的结构和功能。 （2）核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递。 （3）生物膜的结构和功能。 （4）生物调控的分子基础。 （5）生物进化。 分子生物学是第二次世界大战后，由生物化学,`遗传学,微生物学,病毒学,结构分析及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。 随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 生物学的研究可以说长期以来都是科研的重点，惟其所涉及的方方面面与人类生活紧密相连。本世纪50年代以前的生物学研究，虽然有些已进入了微观领域，但总的来说，主要是研究生物个体组织、器官、细胞或是亚细胞这些东西之间的相互关系。50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。到70年代，重组DNA技术的发展又给人们提供了研究DNA的强有力的手段，于是分子生物学就逐渐形成了。顾名思义，分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究；分子生物学在理论和实践中的发展也为基因工程的出现和发展打下了良好的基础，因此可以说基因工程就是分子生物学的工程应用。现在基因工程所展现出的强大生命力和巨大的经济发展潜力完全得益于分子生物学的迅猛发展，而且有证据表明，基因工程的进一步发展仍然要依赖于分子生物学研究的发展。 分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学一直是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理
分子生物学课程论文
PCR技术发展与应用的研究进展 王亚纯 09120103 摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。 关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR 0 前言 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度
高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)。 随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR 技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影
列〃一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和 3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断 裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome) 一 特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小 用全部 DNA 的碱基对总数表示。 人基因组 3X1 09(30 亿 bp)，共编码约 10 万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部 DNA 量称为 C 值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP）基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。 蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics） 第二节真核生物基因组一、真核生物基因组的特 点：， ①真核基因组 DNA 在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中〃 ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 二、真核基因组中 DNA 序列的分类 • (一)高度重复序列(重复次数>lO5) 卫星 DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列 1〃中度重复序列的特点
①重复单位序列相似，但不完全一样， ②散在分布于基因组中〃 ③序列的长度和拷贝数非常不均一， ④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为 DNA 标记〃 ⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)， 2〃中度重复序列的分类 ①长散在重复序列(long interspersed repeated segments〃) LINES ②短散在重复序列(Short interspersed repeated segments) SINES SINES：长度<500bp，拷贝数>105〃如人 Alu 序列 LINEs：长
现代分子生物学考研复习资料整理 第一章绪论 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构及其重要性、规律性和相互关系的科学 分子生物学的主要研究内容 1、DNA重组技术 2、基因表达调控研究 3、生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 5、DNA的复制转录和翻译 第二章染色体与DNA 半保留复制：DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样，因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA半保留复制 DNA半不连续复制：DNA双螺旋的两条链反向平行，复制时，前导链DNA的合成以5′-3′方向，随着亲本双链体的解开而连续进行复制；后随链在合成过程中，一段亲本DNA单链首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反的方向、按照5′-3′方向合成一系列的冈崎片段，然后再把它们连接成完整的后随链，这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制称为DNA 的半不连续复制 原核生物基因组结构特点：1、基因组很小，大多只有一条染色体2、结构简练3、存在转录单元，多顺反子4、有重叠基因 真核生物基因组的结构特点：1、真核基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组2、真核基因组存在大量的重复序列3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90％以上，该特点是真核生物与细菌和病毒之间最主要区别4、真核基因组的转录产物为单顺反子5、真核基因是断裂基因，有内含子结构6、真核基因组存在大量的顺式作用元件，包括启动子、增强子，沉默子等7、真核基因组中存在大量的DNA多态性8、真核基因组具有端粒结构 DNA转座（移位）是由可移位因子介导的遗传物质重排现象 DNA转座的遗传学效应：1、转座引入插入突变2、转座产生新的基因3、转座产生的染色体畸变4、转座引起生物进化 转座子分为插入序列和复合型转座子两大类 环状DNA复制方式：θ型、滚环型和D-环型 第三章生物信息的传递（上）从DNA到RNA 转录：指拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程 启动子：是一段位于结构基因5′段上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性 原核生物启动子结构：存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区，其是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力 终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列（促进转录终止的DNA序列） 终止子的类型：不依赖于ρ因子和依赖于ρ因子 增强子：能增强或促进转录起始的序列 增强子的特点：1、远距离效应2、无方向性3、顺式调节4、无物种和基因的特异性5、具
中国因大豆最新研究进展报告（专题三） 摘要：大豆是重要的油料作物和饲料作物，也是人类的主要食用蛋白和工业原料的来源。而转基因是一种将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的现代技术。目前，越来越多的转基因技术运用到食品医药行业当中。大豆的转基因研究是国内外植物分子生物学研究的热点之一，通过将目的基因整合到大豆基因中，可获得抗虫大豆，其出油率也高于普通大豆。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。本文概述转基因大豆依据的主要理论，目前国内研究进展，转基因大豆的现状及其安全问题等等。 关键词：转基因大豆食品安全研究进展外源基因现状 前言：大豆是重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，含有丰富的蛋白质、脂肪和多种人体有益的生理活性物质。随着基因工程研究的升入，用转基因来改变大豆的性状已被广泛应用。转基因大豆最早的报道是1984年De Bloke等和Horsch 等的研究结果。1988年，McCabe和Hinchee分别用基因枪轰击大豆未成熟胚生长点和用农杆菌侵染大豆子叶节的方法获得转基因植株。1994年5月，美国孟山都公司培育的抗草甘膦除草剂转基因大豆首先获准在美国商业化种植。1997年，杜邦公司获得美国食品药物管理局批准推广种植高油酸转基因大豆。1998年AgrEvo公司研制的抗草丁膦大豆被批准进行商业化生产。转基因大豆品种的育成和推广是世界大豆科技史上具有里程碑意义的重大突破，已成为世界大豆发展生产的主流趋势。 1转基因大豆简介 转基因大豆最早来源于美国，1996年春，美国伊利诺伊西部许多农场主种植了一种大豆新品种，这种大豆是移植了矮牵牛的一种基因。这个新大豆品种可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这是人类历史上第一次成功培育转基因大豆。 转基因大豆包括抗草胺膦转基因大豆，抗磺酰脲类除草剂转基因大豆，抗草甘膦转基因大豆等等。目前以抗草甘膦为目标而创制出的抗除草剂作物占绝对优势，其中尤以抗草甘膦大豆在世界范围内种植面积最广。 2转基因大豆的主要理论 2.1 转基因技术理论