1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征) 。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： (1)形成单键的c电子；(2)形成双键的n电子；(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是： (c)v(n)v( n) v(n * )v( c * ) c，冗是成键轨道，n是非键轨道， c* , n *是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含 有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
紫外光谱的表示方法
紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的 横坐标表示吸收光的波长，用nm （纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用 A （吸光度）、T （透射比或透光率或透过率）、 1-T （吸收率）、?（吸收系数）中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置, 纵坐标为它的吸收强度。 250 A /nm 翠腔的紫外光谨图 四、紫外光 谱中常用的几个术语 1. 发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产 生吸收的基团，不论是否显示颜色 都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（ C=C C=O N=N 、三键、苯环等） 200 300
第十二章荧光分析法（药学） 一、A型题 1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法（）。 A、荧光光度法 B、磷光光度法 C、化学发光法 D、X荧光光谱法 E、原子荧光光谱法 答案：A 2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。 A、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱 B、能发射荧光的物质比较少 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长 D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰 E、分子荧光分析线性范围更宽 答案：B 3荧光量子效率是指（）。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比 答案：B 4.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱
C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：C 5.荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：B 6.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性 E、激发光的强度 答案：A 7.下列结构中荧光效率最高的物质是（）。 A、苯酚 B、苯 C、硝基苯 D、苯甲酸 E、碘苯 答案：A
8.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子 E、激发光强度增大 答案：D 9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比，必须使（）。 A、激发光足够强 B、吸光系数足够大 C、试液浓度足够稀 D、仪器灵敏度足够高 E、仪器选择性足够好 答案：C 10.在测定物质的荧光强度时，荧光标准溶液的作用是（）。 A、用做调整仪器的零点 B、用做参比溶液 C、用做定量标准 D、用做荧光测定的标度 E、以上都不是 答案：D 11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。 A、光源 B、光路 C、单色器 D、检测器
1．简述影响荧光效率的主要因素。 答：（1）分子结构的影响：发荧光的物质中都含有共轭双键的强吸收基团，共轭体系越大，荧光效率越高；分子的刚性平面结构利于荧光的产生；取代基对荧光物质的荧光特征和强度有很大影响，给电子取代基可使荧光增强，吸电子取代基使荧光减弱；重原子效应使荧光减弱。（2）环境因素的影响：溶剂的极性对荧光物质的荧光强度产生影响，溶剂的极性越强，荧光强度越大；温度对溶液荧光强度影响明显，对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁引起的荧光的效率降低；溶液pH值对含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质有影响；表面活性剂的存在会使荧光效率增强；顺磁性物质如溶液中溶解氧的存在会使荧光效率降低。 2．试从原理和仪器两方面比较荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。 答：（1）在原理方面：荧光分析法和磷光分析法测定的荧光和磷光是光致发光，均是物质的基态分子吸收一定波长范围的光辐射激发至单重激发态，测量的是由激发态回到基态产生的二次辐射，不同的是荧光分析法测定的是从单重激发态向基态跃迁产生的辐射，磷光分析法测定的是单重激发态先过渡到三重激发态，再由三重激发态向基态跃迁产生的辐射，二者所需的激发能是光辐射能。而化学发光分析法测定的是化学反应物或反应产物受反应释放的化学能激发而产生的光辐射，所需的激发能是化学能。 （2）在仪器方面：荧光分析和磷光分析所用仪器相似，都由光源、激发单色器、液槽、发射单色器、检测器和放大显示器组成。由于在分析原理上的差别，磷光分析仪器有些特殊部件，如试样室、磷光镜等。而化学发光分析法所用仪器不同，它不需要光源，但有反应器和反应池及化学反应需要的恒温装置，还有与荧光和磷光分析仪器相同的液槽、单色器、检测器等。 3．如何区别荧光和磷光？其依据是什么？ 答：为了区别磷光和荧光，常采用一种叫磷光镜的机械切光装置，利用荧光和磷光寿命的差异消除荧光干扰或将磷光和荧光分辨开。 4．采取哪些措施可使磷光物质在室温下有较大的磷光效率？ 答：（1）在试液中加入表面活性剂，；（2）将被分析物吸附在固体的表面。 5．化学发光反应要满足哪些条件？ 答：（1）能快速地释放出足够的能量；（2）反应途径有利于激发态产物的形成；（3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其它分子。 6．简述流动注射式化学发光分析法及其特点。 答：流动注射分析是一种自动化溶液分析技术，它是基于把一定体积的液体试样注射到一个连续流动着的载流中，试样在流动过程中分散、反应，并被载流带到检测器中，再连续记录其光强、吸光度、电极电位等物理参数。其特点是，具有很高的灵敏度和很好的精密度。1．谱线自吸对光谱定量分析有何影响？ 答：在光谱定量分析中，自吸现象的出现，将严重影响谱线的强度，限制可分析的含量范围。2．激发光源的作用是什么？对其性能有何具体要求？ 答：激发光源的作用是提供试样蒸发、解离和激发所需要的能量，并产生辐射信号；对激发光源的要求是：激发能力强，灵敏度高，稳定性好，结构简单，操作方便，使用安全。
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
第十一章 荧光分析法 、选择题 1．荧光分析法是通过测定 ( ) 而达到对物质的定性或定量分析。 A 、激发光 D 、散射光 2．下面 ( )分析方法不属于分子发射光谱法。 3．荧光发射光谱含有 ( )个发射带。 A 、 1 B 、 2 C 、 3 4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是( ) A 、 荧光光谱的形状与激发光的波长无关 B 、 荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像 C 、 荧光光谱属于分子的受激发射光谱 D 、 荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合 5．下列叙述错误的是( ) A 、 荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应 B 、 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应 C 、 荧光光谱的形状与激发光波长无关 D 、 荧光波长大于激发光波长 6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激 发三重态， 再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级， 然后发出光辐射跃迁至基态的各个振 动能级，这种光辐射称为 ( )。 A 、分子荧光 B 、分子磷光 C 、瑞利散射光 D 、拉曼散射光 7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是 ( )。 A 、振动弛豫只能在同一电子能级内进行 B 、振动弛豫属于无辐射跃迁 C 、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动 能级 D 、振动弛豫是产生 Stokes 位移的原因之一 8．荧光寿命指的是 ( )。 A 、 从激发光开始照射到发射荧光的时间 B 、 受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间 C 、 从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间 D 、 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间 9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是( ) A 、 具有长共轭的 n~ ；跃迁的物质具有较大的荧光效率 B 、 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大 C 、 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体 学习资料 D 、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同 10．采用下列 ( )措施可使物质的荧光效率提高。 学习资料 B 、磷光 C 、发射光 A 、紫外一可见分光光度法 C 、磷光分析法 B 、荧光分析法 D 、化学发光分析法 D 、不一定
荧光分析法在生物领域的应用于发展摘要：本文对荧光分析法在检测细胞活性，测定生物样品，推断生物成虫日龄，研究生 物群落动态的应用与进展进行了综述与分析。并就其包含的不同方法进行一一介绍，展望了荧光分析法技术在生物领域中的应用前景。 关键词:荧光分析法生物领域应用发展 引言：利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停止，则称荧光超过此限度即称为磷光。特点：灵敏度更高10-10-10-12g/ml，应用不如UV广泛。SO2分子受特定光照射后处于激发态的SO2分子返回基态时发出荧光, 其荧光强度与SO2呈线性关系, 从而可测出气体浓度。当检测仪器系统确定后，荧光总光强I与SO2浓度的之间的关系可表示为：I=KC 在稳定的条件下，这些参数也随之确定，k可视为常数。因此，式I=kC 表示的紫外荧光光强I与样气的浓度C成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。 荧光色谱法相关内容 1.荧光色谱法的近期发展状况 （1）近10年来,由于微量分析的需要迅速增加,灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增,内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展,应用遍及各个领域。荧光光谱图册也陆续出版,美国费城Sadtler研究实验室自1974年起出版标准荧光光谱图及各专用荧光光谱图(如药物)。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿,成为一种重要的仪器分析方法。 （2）荧光分析法在纳米生物分析中的应用巨大。纳米荧光探针、纳米生物传感器等纳米生物分析材料器件的特性及其在生物分析中的应用。对发光量子点、复合型荧光纳米粒子和具有光学活性的金属纳米粒子作为生物分子的标记探针取得了成果。 2.荧光分析法基本原理分子角度 分子的激发态，单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”
2、激发态分子的常见去活化过程有哪几种？ 答：振动弛豫内转换系间窜越外转换荧光发射磷光发射 3、何谓荧光的激发光谱和发射光谱？它们之间有什么关系？答：固定荧光的发射波长，不断改变激发光波长，以所测得的该发射波长下的荧光强度对激发光波长作图，即得到荧光化合物的激发光谱。 使激发光的强度和波长固定不变，测定不同发射波长下的荧光强度，即得到发射光谱。 任何荧光（磷光）物质都具有激发光谱和发射光谱这两种特征光谱。 4、何谓荧光效率？荧光定量分析的基本依据是什么？ 答：物质发出荧光量子数和吸收激发光量子数的比值称为荧光效率。依据：溶液的荧光强度和该溶液的吸收光强度以及荧光效率成正比。 5、下列化合物中那个荧光效率大，为什么？ 答：第一个荧光效率大。因为两个物质都有大π键，但第一个物质具有刚性平面结构，荧光量子产率高。 6、影响荧光强度的环境因素有哪些？ 答：溶剂温度溶液pH 各种散射光激发光照荧光猝灭 7、为什么荧光分析法比紫外-可见法具有更高的灵敏度和选择性？ 答：因为荧光或磷光分析法是在入射光的直角方向测定荧光强度，即在黑背景下进行检测，因此可以通过增加入射光强度或增大荧光或
磷光信号的放大倍数来提高灵敏度。而紫外-可见光分光光度法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度和透射光强度的比值有关，入射光强度增大，透射光强度也随之增大，增大检测器的放大倍数液同时影响入射光和透射光的检测。又因荧光光谱既包括激发光谱又包括发射光谱，凡是能发射荧光的物质，必须首先吸收一定波长的紫外线，而吸收了紫外线后不一定就发射荧光。能发射荧光的物质，其荧光波长也不尽相同。如果即使荧光光谱相同的话，而它的激光光谱也不一定相同。反之如果它们的激发光谱相同，则可用发射光谱把它们区分开来，因此供选择的余地是比较多的。所以荧光分析的选择性很强。
四川大学仪器分析第八章-分子发光分析法 答案
第八章分子发光分析法 基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素， 掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点， 重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。 参考学时：3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光？ 答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失 活、系间窜跃、荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射； 振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。 系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,就是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱就是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要就是三种电子: (1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致就是: (σ)＜(π)＜(n)＜(π*)＜( σ* ) σ,π就是成键轨道,n 就是非键轨道,σ* ,π* 就是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动与转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级与转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法 紫外光谱图就是由横坐标、纵坐标与吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语
1、发色基团与助色基团 发色基团:就是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论就是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱与的基团都就是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等) 助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常就是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。 2.红移、蓝移、增色效应与减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其她发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反,如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动,则称为蓝移。 由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响,使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级与转动能级。分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15s),成为激发单重
荧光分析法测定维生素B2 一、实验目的 1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法; 2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法; 3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。 二、实验原理 当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。 实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。 图1.荧光分光光度计的结构原理图
荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。 荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。 荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。 定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。对同一物质而言,荧光强度F 与该物质的浓度c 有以下的关系: F = 2、303Фf I0 a b c ⑴ Фf－荧光过程的量子效率; a－荧光分子的吸收系数; I0－入射光强度; b－试液的吸收光程。 在I0 与b 不变时,2、303Фf I0 a b为常数,则⑴式可以表示为 F＝Kc ⑵ ⑵即可作为荧光定量检测的依据。 图2 VB2的结构式
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮, 检测产物发出的荧光, 荧光强度与Mb浓度呈正比, 可在 8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好, 线性范围宽, 具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例, 首先将特异性抗体与固相载体连接, 形成固相抗体。除去未结合抗体, 然后加受检标本, 使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物, 接着加入荧光标记的抗体, 使之与抗原特异性结合, 形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度, 即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大, 时间分辨荧光免 疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕, 作为标记物, 加入正常液后激发测定, 能有效去除短寿命本底荧光的干扰。 2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原, 竞争性地与抗体结合, 形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物, 并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后经过离心沉淀等方法, 将抗原—抗体复合物与游离抗原分离, 分别测定其放射性强度与标准曲线比较, 即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强, 可准确定量到 ng/ml水平。但早期的方法操作麻烦, 耗时长, 且有放射性污染。近年来, 随着单克隆抗体的应用, RIA的灵敏度又有了较大提高, 且操作大为简化, 并已有商品试剂盒供应, 使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立, 该法的最低检测限为10μg/L, 线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高, 特异性强, 精密度好, 操作简单, 适用于多份标本的检测, 不需特殊仪器设备等优点, 易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
第八章分子发光分析法 基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素， 掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点， 重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。 参考学时：3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光 答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失活、系间窜跃、 荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射； 振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。 系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。 3.溶液中，溶剂的极性、pH值及温度是如何影响荧光强度的。 答：溶剂的影响：随着溶剂极性增加，荧光物质的n—π*跃迁能量增大，π—π*跃迁的能量降低，从而导致荧光强度增加，荧光波长红移。溶剂若能和荧光物质形成氢键或使荧光物质的电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
仪器分析基本原理1、简述仪器分析的一般流程。一个完整的仪器分析流程应包括取样、样品的预处理(溶样、分 离、提纯和制备)、仪器测定、数据处理、结果表达、提供分析报告、对结果进行研究和解释等过程。 2、比较标准加入法与标准曲线法的优缺点。标准曲线法的优点是大批量样品测定非常方便。缺点是：对个别样品测定仍需配制标准系列，手续比较麻烦，特别是遇到组成复杂的样品测定，标准样的组成难以与其相近，基体效应差别较大，测定的准确度欠佳。标准加入法的优点是可最大限度地消除基体干扰，对成分复杂的少量样品测定和低含量成分分析，准确度较高；缺点是不能消除背景吸收，对批量样品测定手续太繁，不宜采用。 3、简述吸收光谱与发射光谱之间的差异。发射光谱：给样品以能量，比如原子发射光谱，原子外层电子由基态到激发态，处于激发态电子不稳定，会以光辐射的形式是放出能量，而回到基态或较低的能级。得到线状光谱。吸收光谱：用一定波长的光照射样品，样品会吸收一部分光，照射前后就有光强度的变化，记录这种变化得到的是吸收光谱，如分子、原子吸收光谱. 区别：发射光谱是指样品本身产生的光谱被检测器接收。比如ICP，样品本身被激发，然后回到基态，发射出特征光谱。发射光谱一般没有光源，如果有光源那也是作为波长确认之用。在测定时该光源也肯定处于关闭状态。吸收光谱是光源发射的光谱被样品吸收了一部分，剩下的那部分光谱被检测器接收。比如原子吸收光谱，空心阴极灯发出的光谱被样品吸收了一部分，检测器则接收剩余的那部分。吸收光谱都有光源，测定时光源始终工作，并且光源、样品、检测器在一直线（中间反射镜不算）。紫外-可见分析技术 1、简述影响紫外可见吸收光谱的因素。（1）温度：在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。在低温时，吸收强度有所增大；在高温时，谱带变宽，谱带精细结构消失。（2）溶剂：由于紫外光谱的测定大多数在溶液中进行，而溶剂的不同将会使吸收带的位置及吸收曲线的形态有较大的影响。所以在测定物质的吸收光谱时，一定要注明所用的溶剂。一般来说，极性溶剂会造成π-π﹡跃迁吸收带发生红移，而使n-σ﹡跃迁发生蓝移。非极性溶剂对上述跃迁影响不太明显。（3）pH值：很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同的pH值的溶液中，分子的解离形式可能发生变化。其吸收峰的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都有可能发生变化。（4）仪器的狭缝宽度：狭缝宽度越大，光的单色性越差，吸收光谱的细微结构就可能消失。 2、简述紫外光谱法在有机化合物分析中的应用，试举例说明。紫外可见光谱一般有以下几个应用：定性分析，定量分析，异构体判断，纯度检查。定性分析：判断共轭关系及某些官能团。如在（200-400nm）之间无吸收峰，说明该未知物无共轭关系，且不会是醛、酮，很可能是一个饱和化合物。定量分析：用于测定物质的浓度和含量。异构体判断：乙酰乙酸乙酯存在酮-烯醇互变异构体。酮式没有共轭双键，在204nm处有弱吸收；烯醇式有共轭双键，在245nm处有强吸收。故可根据它们的紫外吸收光谱可判断其存在与否。纯度检查：例如，如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中杂质有较强的吸收，就可方便检测出该化合物的痕量杂质。 3、简述紫外可见吸收光谱波长范围的划分，并指出“UV”所表示的范围。紫外可见光谱区是在4-800nm的电磁波，其中4-400nm的电磁辐射称为紫外区，它又分为两段：4-200nm为远紫外区，200-400nm的电磁波为近紫外区，而波长在400-800nm的电磁波为可见光区。 4、简述紫外可见分光光度计的结构。光源：光源是提供入射光的装置。单色器：是一种把来自光源的复合光分解为单色光，并分离出所需要波段光束的装置。吸收池：又称样品池、参比池或比色皿。检测器：其作用是检测光信号，将光信号转变为电信号。信号显示系统：配有微机，可对光谱仪进行操作控制，并进行数据处理。 荧光分析技术 1、简述荧光分析法的特点，其中物质产生荧光所必须具备的条件。荧光法的主要特点是灵敏度高和选择性强。分子产生荧光必须具备两个条件：（1）物质分子必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构；（2）物质分子吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率。荧光效率大，