Ｍｅｆ２ｃ真核表达载体的构建及其在
ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中的表达
温见燕１．于长安１，杨鹏１．阴彬２，李耿１，柯元南１，廖文强１’
（１中日友好医院全国中西医结合心血管病中心，北京１０００２９；
２中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室）
［摘要］目的构建小鼠Ｍｅｆ２ｃ基因真核表达质粒并转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞。方法采用ＲＴ?ＰＣＲ方法从小鼠心脏组织的总ｃＤＮＡ中扩增出小鼠的Ｍｅｆ２ｃ的基因，采用基因重组技术将Ｍｅｆ２ｃ的ｃＤＮＡ片段插入真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋），构建小鼠Ｍｅｆ２ｅ真核表达质粒，脂质体转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞进行表达。结果酶切和测序结果证实Ｍｅ亿ｃ真核表达质粒构建成功，经脂质体转染２９３Ｔ细胞后，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证明Ｍｅｅｃ蛋白在真核细胞中成功表达。结论成功构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一Ｍｅｆ２ｅ，为进一步研究小鼠Ｍｅ岔ｃ在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础。
［关键词］ＭＥＦ２；基因表达；载体构建
［中图分类号］Ｑ７８６［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２－２６６Ｘ（２００９）０４－００１５－０３
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅＣｌｏｒｆｏｒＭｅｆ２ｃａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓ
ＷＥＮＪｉａｎ—ｙａｎｌ，ＹＵＣｈａｎｇ—ａｎ，ＹＡＮＧＰｅ增，ＹＩＮＢｉｎ，
ＬＩＧｅｎ，ＫＥＹｕａｎ．ｎａｎ．皿４Ｄ耽凡．ｑｉａｎｇ
（１ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｈｉｎａ－１ａｐａｒｔ
ＦｒｉｅｎｄｓｈｉｐＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｈａｒａｅｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔⅡ舢ｓｅＭｅ岔ｃｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃ：ｔＦＩＥＫ２９３Ｔｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈ－ｏｄｓＴｈｅＭｄ２ｃｗ日８ａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰｅＲ）ｆｒｏｍｍｏｕｓｅｈｅａｒｔｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄｔｈｅＭｅｆ２ｃｇｅｎｅｗ娼ｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｃＤＮＡ３．１－Ｍｅｆ２ｃｐｌａｓｍｉｄｓＷｄｌ＂ｅｔｒａｍｆｅｃｔｃｄｉｎｔｏＨＥＫ２９３ＴｅｅＵｓｕｓｉｎｇＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＭｄ２ｃｅｕｋａｒｙｏｔｉｅｖｅｃｔｏｒｗ∞ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｉｇｅｓ－ｔｉｏｎａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｅｆ２ｃｐｒｏｔｅｉｎＷａＳｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｉｔｃｏｕｌｄｂｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
ｃｅｌｌｓ．Ｃｏ山ｍｉｏｍＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｄａｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆＭｅｔ２ｃｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
肌细胞增强子２（ＭＥＦ２）家族的转录因子有四个成员，包括ＭＥＦ２Ａ，一Ｂ，一Ｃ，．Ｄ¨’２Ｊ。ＭＥＦ２Ｃ在心脏发育中表达并且作为心脏特异的转录因子，参与心脏发育的各个过程，调节着心脏特异基因的表达。为了进一步研究ＭＥＦ２Ｃ调节心脏特异基因表达的机制，本研究克隆了小鼠的ＭｅｌＥｅ基因，并构建了其真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＭｅｌＥｅ，利用脂质体转染实现了在ＨＥＫ２９３细胞的表达，为进一步研究ＭＥＦ２Ｃ在心脏发育过程中的作用及对心脏相关基因表达调控的机制创造了条件。
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０７００３２３）。
?通讯作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｐｃｒ＠１６３．ＣＯＩｌｌ１材料与方法
１．１材料人胚肾细胞ＨＥＫ２９３Ｔ，大肠杆菌感受态Ｅ．ｃｏｌｉＤｌ－１５ａ。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）均由本实验室保存。Ｔｒ－ｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＬ２０００均购自大连宝生物工程有限公司。ＤＮＡＭａｒｋｅｒｐＢＲ３２２／Ｈｉｎｆｌ为中国协和医科大学产品。质粒提纯试剂盒、ＤＮＡ凝胶回收纯化试剂盒分别购自北京天为时代及博大泰克公司。引物由Ｉｎｖｉｔｍｇｅｎ公司合成。脂质体为威格拉斯公司产品，ＭＥＦ２Ｃ抗体为ＳａｎｔａＣｒｕｚ产品．１３－ａｃｔｉｎ为Ｓｉｇｍａ公司产品。
１．２方法
１．２．１ＭｅｌＥｅ基因的ＲＴ—ＰｅＲ扩增根据已知的小
１５
万方数据
鼠Ｍｅ￡２ｃ（ＮＭ＿０２５２８２）的基因编码序列和所用的载体进行引物设计，在上游引物和下游引物中分别引入ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ的酶切位点，序列为５’一ＣＧＧ－ＧＡＴＣＣＡＣＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴｒＣＡＧ－３’和５’一ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ７Ｉ、Ｇ’Ｉ’ｒＧＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡ＿３’。以Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取小鼠心脏的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ．ＰＣＲ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃３０８，５８ｏＣ３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，共３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．２．２重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１一Ｍｅｆ２ｃ的构建用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ双酶切ＰＣＲ产物，亚克隆到同样经过ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ双酶切的ｐｃＤＮＡ３．１（＋）质粒。转化大肠杆菌ＤＨ５０ｔ，ＰＣＲ鉴定阳性克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定为阳性的送国家人类基因组北方研究中心测序，测序完全正确的克隆命名为ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｍｅｆ２ｃ。
１．２．３脂质体转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞选择对数增长期生长状态良好的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，用胰蛋白酶进行消化，用含有１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基培养２４ｈ，待细胞生长达到６０％～８０％融合时，进行转染。转染前２ｈ给细胞换液，按照脂质体试剂说明书进行转染。转染后继续培养２４～４８ｈ收集细胞。１．２．４Ｍｅｆ２ｃ表达的检测参照文献进行∞Ｊ，其中蛋白裂解液包含５０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７．５的Ｔｆｉｓ—ＨＣＩ、１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｌｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＦ、１ｍｍｏｌ／ＬＮａＶＯ，、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｌ％ＮＰ－４０、２肛ｇ／ｍｌａｐｒｏｔｉｎｉｎ、２斗ｇ／ｍｌｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２ｔＬｇ／ｍｌｐｅｐｓｔａｔｉｎ和２斗ｇ／ｍｌＰＭＳＦ。将裂解的蛋白行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后，半干法电转移至硝酸纤维素膜，５％脱脂奶粉封闭，一抗４℃轻摇过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温轻摇１—２ｈ，洗涤后加强化学发光法（ＥＣＬ）显色。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ中，Ｍｅｔ２ｃ多克隆抗体使用比例为ｌ：６００。１３－ａｃｔｉｎ单克隆抗体使用比例１：５０００，二抗使用比例为ｌ：４０００。
２结果
２．１Ｍｅｆ２ｃ基因的扩增将小鼠心脏进行研磨，提取总ＲＮＡ，并进行逆转录反应。经过ＰＣＲ扩增后，得到大小约１．３ｋｂ的扩增产物，与理论值１３０３ｂｐ的大小吻合（图１）。
２．２重组质粒ｐｅＤＮＡ３．１（＋）一Ｍｅｆ２ｃ的鉴定将ＲＴ．ＰＣＲ产物与ｐｅＤＮＡ３．１（＋）线性质粒连接后，用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ进行双酶切鉴定，载体和目的片段与理论值大小相符（图２）。测序结果表明，ＭｅＯｅ成功的构建到ｐｃＤＮＡ３．１（＋）载体中，碱基序列完全正确，目的片段插入方向正确。
】６
出丕医垫兰塑竺生箜兰竺鲞筮堡塑
２．３Ｍｅｆ２ｃ在ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中的表达将ｐｃＤ—ＮＡ３．１（＋）一Ｍｅｔ２ｃ重组表达质粒转染２９３Ｔ细胞２４—４８ｈ后．取转染重组质粒的细胞裂解液，进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测，得到大小约５０ｋＤａ的条带，与Ｍｅｆ２ｃ翻译后产物的理论值５１．２ｋＤａ大小相符（图３），而作为对照的转染ｐｃＤＮＡ３．１（＋）空载体的细胞裂解液没有相应大小的条带，表明ＭｅＯｃ基因在ＨＥｌ（２９３Ｔ细胞中得到了表达。
图１Ｍｅｆ２ｃ基因ＲＴ．卢℃Ｒ产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定注：１为ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；２为Ｔａｑ酶扩增Ｍｅｔ２ｅ结果
图２重组质粒ｏｃＤＮＡ３．１?Ｍｅｆ２ｃ酶切鉴定注：１为ｐＢＲ３２２／ＨｉｎｆＩＭａｒｋｅｒ；２为ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ双酶切的重组质粒ｐｅＤＮＡ３．１（＋）一Ｍｅｔ２ｅ
图３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测转染ｏｅＤＮＡ３．１（＋）空质粒和ｐｃＤＮＡ．３．１（＋）?Ｍｅｌ２ｅ后细胞裂解液注：１为ＨＥＫ２９３Ｔ转染空质粒；２为ＨＥＫ２９３Ｔ表达Ｍｅｔ２ｃ的结
果；１３－ａｃｔｉｎ作为内参
万方数据
山东医药２００９年第４９卷第４期
３讨论
ＭＥＦ２家族的蛋白是一类具有调节功能的蛋白，它们分布比较广泛。ＭＥＦ２Ｃ与其他成员相比，其表达组织特异性比较明显。ＭＥＦ２Ｃ分布在骨骼肌和脑，尤其是大脑皮层的神经元。近年来的研究发现ＭＥＦ２Ｃ在心脏分布并具有重要的作用。Ｍｅｆ２ｃ基因敲除小鼠心脏和血管的发育缺陷在胚胎９．５ｄ死亡１４，５Ｊ，Ｍｅｌ２ｃ基因无义突变的小鼠胚胎发育过程中，小鼠的心管不能形成心曲，心间质发育紊乱不能形成右心室，并且与之相关的心脏特异性基因如肌球蛋白轻链（ＭＬＣｌＡ）和心肌的仅．ａｃｔｉｎ不表达【５Ｊ，心钠素（ＡＮＦ），肌球蛋白重链（ＭＨＣ）等基因的表达也出现下调Ｍｊ，说明Ｍｅｔ２ｃ在心脏发育过程中发挥重要作用。Ｍｅ亿ｃ转基因小鼠发生扩张性心肌病，肌小结结构紊乱一Ｊ。随着人们对心脏发育机制和相关信号通路研究的深入，人们发现ＭＥＦ２Ｃ，Ｃｓｘ／Ｎｋｘ－２．５和ＧＡＴＡ－４等转录因子可以作为心肌分化过程中特异性的标志。研究已经证实，Ｎｋｘ－２．５是心肌发育过程中起决定性作用的基因，ＭＥＦ２Ｃ与Ｎｋｘ－２．５之间的相互作用对心脏发育尤其是心室的发育至关重要哺Ｊ。在小鼠畸胎瘤来源的Ｐ１９细胞系中，它们能相互上调各自基因的表达，从而使Ｐ１９细胞向心肌细胞分化旧Ｊ。我们前期用Ｐ１９ＣＬ６细胞作为体外研究心肌细胞分化的模型，在研究中发现ＭＥＦ２Ｃ，Ｃｓｘ／Ｎｋｘ－２．５和ＧＡＴＡ－４在ｍＲＮＡ表达水平显著增高¨０｜。这些研究结果说明ＭＥＦ２Ｃ和其它心肌特异性的转录因子的相互作用在心肌分化过程中起重要作用，但是关于ＭＥＦ２Ｃ在心肌定向分化中的作用及其调控机制尚有待深入探讨，含有ＭＥＦ２Ｃ基因的高表达的真核载体是深人研究的工作基础。
本研究成功构建了真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．Ｍｅ亿ｃ，并在２９３Ｔ细胞内获得瞬时表达。用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测了Ｍｅ亿ｃ的表达，结果发现Ｍｅ亿ｃ在２９３Ｔ细胞内可以表达。本实验为下一步在体外研究Ｍｅｆ２ｃ在心脏发育、心肌分化中的作用
及其与其他转录因子相互之间协同对心肌分化调控机制奠定了实验基础。
［参考文献］
［１］ＢｌａｃｋＢＬ，ＯｌｓｏｎＥＮ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｍｙｏｅｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ－２（ＭＥＦ２）ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．山［ｎｌｕＢｅｙ、ＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ，１９９８，１４：１６７—１９６．
［２］ＭｃＫｉｎｓｅｙＴＡ，ＺｈａｎｇＣＬ，ＯｌｓｏｎＥＮ．ＭＥＦ２：ａｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｃｅｌｌｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｄｅａｔｈ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏ－ｔｈｅｍＳｃｉ，２００２，２７（１）：４０４７．
［３］ＺｈｏｕＹ，ＤｕＧ，Ｈｕｘ，ｅｔ日１．Ｎｅｃｔｉｎ?ｌｉｋｅｍｏｌｅｃｕｌｅ１ｉｓａ叫ｅｉｎ４．ＩＮａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｒｅｃｒｕｉｔｓｐｍｔｅｉｎ４．１Ｎｆｒｏｍｃｙｔｏｐｌａｓｍｔｏ
ｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２００５，１６６９（２）：１４２—１５４．
［４］ＥｄｍｏｎｄｓｏｎＤＧ，ＬｙｏｎｓＧＥ，ＭａｒｔｉｎＪＦ，ｅ１．ａ１．ＭｅＥ２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍａｒｋｓｔｈｅｃａｒｄｉａｃａｎｄｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｌｉｎｅａｇｅｓｄｕｒｉｎｇｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙ－ｎｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４，１２０（５）：１２５１—１２６３．
［５］ＬｉｎＱ，ＳｃｈｗａｒｚＪ，ＢｕｅａｎａＣ，ｅｔａ１．ＣｏｎｔｒｏｌｏｆｍＯＵＳｅｃａｒｄｉａｃｍｏｔ－ｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＭＥＦ２Ｃ［Ｊ］．Ｓｃｉ—ｅｎｅｅ，１９９７，２７６（５３１７）：１４０４—１４０７．
［６］ＬｉｕＺＰ，ＮａｋａｇａｗａＯ，ＮａｋａｇａｗａＭ，ｅｔａ１．ＣＨＡＭＰ，ａｎｏｖｅｌｅａｒｄｉ－
ａｃ－ｓｐｅｃｔｆｉｃｈｅｌｉｃｎｓｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＭＥＦ２Ｃ［Ｊ］．ＤｅｖＢｉｏｌ，２００１，２３４（２）：４９７－５０９．
［７］ｘｕＪ，ＧｏｎｇＮＬ．ＢｅｄｉＩ，ｅｔａ１．Ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒｓ２Ａａｎｄ２Ｃ
ｉｎｄｕｃｅｄｉｌａｔｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｅｍｉｃｅ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００６，２８１（１４）：９１５２－９１６２．
［８］ＶｉｎｃｅｎｔｚＪＷ，ＢａｒｎｅｓＲＭ，ＦｉｍｌｌｉＢＡ，ｅｔａ１．ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＮｋｘ２．５ａｎｄＭｅｌ２ｃｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｄｕｒｉｎｇｈｅａｒｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｍ［Ｊ］．ＤｅｖＤｙｎ，２００８，２３７（１２）：３８０９－３８１９．
［９］ＳｋｅｒｊａｎｃＩＳ，ＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓＨ，ＲｉｄｇｅｗａｙＡＧ．ｅｔ８１．Ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２ＣａｎｄＮｋｘ２－５ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｅａｃｈｏｔｈｅｒ’８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｎｉｔｉ－ａｔｅｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｕｎｅｓｉｓｉｎＰ１９ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９８，２７３（５２）：３４９０４－３４９１０．
［１０】ＷｅｎＪ，ＸｉａＱ，ＬｕＣ。ｅｔａ１．ＰｒｏｔｅｏｍｉｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｍｏｌｌｓｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃａｒｃｉｎｏｌｎａＰ１９ＣＩ－６ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００７。ｉ０２（１）：１４９－１６０．
（收稿日期：２００８—１２－０３）
《山东医药》征稿启事
?告读者?
为了加速不断涌现的医学科技新理论、新技术、新成果的传播，给广大医务工作者提供更广阔的学习和交流的阵地，《山东医药》自２００７年５月设立北京编辑部。北京编辑部将继续发挥《山东医药》专业覆盖性广的特点，保持杂志的科学性；更要充分发挥各医学专业知名学者在办刊工作中的学术主导作用，提高杂志的学术权威性，增强杂志的指导性和前瞻性。《山东医药》设有论著、基础研究、临床研究、综述、护理园地、医院管理、新药开发等栏目，多层次、多视角地反映医学专业发展动态，欢迎广大作者踊跃投稿。投稿信箱：ｓｈａｎｄｏｎｇｙｉｙａ０２００７＠１６３．ｃｏｍ；联系电话：０１０—８４９４８１６５。
１７万方数据
Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达
作者：温见燕， 于长安， 杨鹏， 阴彬， 李耿， 柯元南， 廖文强， WEN Jian-yan， YU
Chang-an， YANG Peng， YIN Bin， LI Gen， KE Yuan-nan， LIAO Wen-qiang
作者单位：温见燕,于长安,杨鹏,李耿,柯元南,廖文强,WEN Jian-yan,YU Chang-an,YANG Peng,LI
Gen,KE Yuan-nan,LIAO Wen-qiang(中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京
100029)， 阴彬,YIN Bin(中国医学科学院,北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学
国家重点实验室)
刊名：
山东医药
英文刊名：SHANDONG MEDICAL JOURNAL
年，卷(期)：2009，49(4)
被引用次数：0次
参考文献(10条)
1.Black BL.Olson EN Transcriptional control of muscle development by myocyte enhancer factor-2 (MEF2) proteins 1998
2.McKinsey TA.Zhang CL.Olson EN MEF2:a calcium-dependent regulator of cell division,differentiation and death 2002(01)
3.Zhou Y.Du G.Hu X Nectin-like molecule 1 is a protein
4.1N associated protein and recruits protein
4.1N from cytoplasm to the plasma membrane 2005(02)
4.Edmondson DG.Lyons GE.Martin JF Mef2 gene expression marks the cardiac and skeletal muscle lineages during mouse embryogenesis 1994(05)
5.Lin Q.Schwarz J.Bucana C Control of mouse cardiac morphogenesis and myogenesis by transcription factor MEF2C 1997(5317)
6.Liu ZP.Nakagawa O.Nakagawa M CHAMP,a novel cardiac-specific helicase regulated by MEF2C 2001(02)
7.Xu J.Gong NL.Bodi I Myocyte enhancer factors 2A and 2C induce dilated cardiomyopathy in transgenic mice 2006(14)
8.Vincentz JW.Barnes RM.Firulli BA Cooperative interaction of Nkx2.5 and Mef2c transcription factors during heart development 2008(12)
9.Skerjanc IS.Petropoulos H.Ridgeway AG Myocyte enhancer factor 2C and Nkx2-5 up-regulate each
other's expression and initiate cardiomyogenesis in P19 cells 1998(52)
10.Wen J.Xia Q.Lu C Proteomic analysis of cardiomyocytes differentiation in mouse embryonic carcinoma P19CL6 cells 2007(01)
相似文献(10条)
1.外文期刊Lyons GE.Micales BK.Schwarz J.Martin JF.Olson EN Expression of mef2 genes in the mouse
central nervous system suggests a role in neuronal maturation.
Members of the myocyte enhancer factor 2 (MEF2) gene family are expressed in a dynamic pattern during development of the CNS of pre- and postnatal mice. The four MEF2 genes, Mef2A, -B, -C, -D, encode transcription factors belonging to the MADS (MCM1-agamous-deficiens-serum response factor) superfamily of DNA binding proteins. MEF2 factors have previously been shown to be positive regulators of gene expression in terminally differentiated muscle cells. To begin to determine the role of MEF2 factors in CNS development, we used in situ hybridization with gene-specific cRNA probes to define the expression patterns of each of the four Mef2 mRNAs in the developing and mature mouse CNS. Mef2C mRNA was first detected in a ventral portion of the telencephalon at 11.5 d postcoitum (p.c.). By 13.5 d p.c., each of the four Mef2 genes were expressed in overlapping yet distinct patterns in regions of the frontal cortex, midbrain, thalamus, hippocampus, and hindbrain. Temporal and spatial patterns of embryonic Mef2 gene expression appeared to follow gradients of neuron maturation and suggested that the onset of Mef2 gene expression coincides with withdrawal from the cell cycle and initiation of neuronal differentiation. This correlation is particularly striking for Purkinje cells in the cerebellum. Since the molecular mechanisms that regulate neuron differentiation are unknown, we propose that the MEF2 factors are likely to play an important role in this process.
2.外文期刊Lin X.Shah S.Bulleit RF The expression of MEF2 genes is implicated in CNS neuronal
differentiation.
The myocyte enhancer factor-2 (MEF2) proteins are transcription factors required for muscle differentiation. In the present study we examined MEF2 expression in developing cerebellar granule neurons. In the developing postnatal cerebellum, RNA blot analysis revealed that MEF2A and MEF2D RNA levels increase after birth. The majority of this increase occurs around postnatal day 9 reaching a peak at postnatal day 15-18 which is maintained in adults. This time course of expression coincides with the expression of GABA(A) receptor alpha6 subunit RNA, a marker for the differentiation of the mature cerebellar granule neurons. We further observed, using the polyclonal antibody generated against an MEF2A peptide, that MEF2 protein expression occurs primarily in the internal granule
cell layer of the developing cerebellum. Thus, MEF2 expression increases as granule neurons differentiate and mature. Experiments also indicated that MEF2 expression not only occurs in the cerebellum but also in other regions of the CNS. In adult mice, expression of RNA for the MEF2 isoforms A, C and D occurs throughout the CNS. MEF2A and D expression occurs at highest levels in the olfactory bulb, hippocampus and cerebellum. The expression of MEF2C differs with low levels of expression in the cerebellum and hindbrain. Using the MEF2A polyclonal antibody, we observed a similar adult pattern of expression for the MEF2 protein with high level of expression in the olfactory bulb, cortex, hippocampus, thalamus and cerebellum. These observations suggest that MEF2 molecules may be an important factor involved in CNS neuron differentiation similar to their role in muscle differentiation.
3.会议论文王静.王继文MEF2蛋白活性调控机理的研究进展2009
肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor2，MEF2)是一种特定的转录因子，在脊椎动物中该家族包括：MEF2A，ME2B，MEF2C和MEF2D四个成员
，它们对细胞增殖、分化、存活、凋亡过程中相关的基因表达进行调控。本文重点对MEF2蛋白活性调控进行综述。
4.外文期刊Cohen.TJ.Barrientos.T.Hartman.ZC.Garvey.SM.Cox.GA.Yao.TP The deacetylase HDAC4 controls
myocyte enhancing factor-2-dependent structural gene expression in response to neural activity.
Histone deacetylase 4 (HDAC4) binds and inhibits activation of the critical muscle transcription factor myocyte enhancer factor-2 (MEF2). However, the physiological significance of the HDAC4-MEF2 complex in skeletal muscle has not been established. Here we show that in skeletal muscle, HDAC4 is a critical modulator of MEF2-dependent structural and contractile gene expression in response to neural activity. We present evidence that loss of neural input leads to concomitant nuclear accumulation of HDAC4 and transcriptional reduction of MEF2-regulated gene expression. Cell-based assays show that HDAC4 represses structural gene expression via direct binding to AT-rich MEF2 response elements. Notably, using both surgical denervation and the neuromuscular disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) model, we found that elevated levels of HDAC4 are required for efficient repression of MEF2-dependent structural gene expression, indicating a link between the pathological induction of HDAC4 and subsequent MEF2 target gene suppression. Supporting
this supposition, we show that ectopic expression of HDAC4 in muscle fibers is sufficient to induce muscle damage in mice. Our study identifies HDAC4 as an activity-dependent regulator of MEF2 function and suggests that activation of HDAC4 in response to chronically reduced neural activity suppresses MEF2-dependent gene expression and contributes to progressive muscle dysfunction observed in neuromuscular diseases.
5.期刊论文杨勇.韩雅玲.YANG Yong.HAN Ya-ling MEF2转录因子家族与心脏发育及心血管系统相关疾病的关系-
国际病理科学与临床杂志2007,27(2)
肌细胞增强因子-2(MEF2A)是心肌细胞特异性基因表达和转录的中心调控因素.通过与基因启动子中特异序列结合,从而发挥对肌细胞特异性基因表达、转录的调控作用.近期研究表明,冠心病易感基因MEF2A的突变会影响其转录产物MEF2A蛋白的空间构象,减弱其在肌细胞信号介导的转录激活效能,进而导致血管内皮发育不良、单核细胞浸润,启动动脉粥样硬化斑块的形成.
6.学位论文张颖酒精对胚胎发育的影响及文昌鱼、斑马鱼Mef2、MRLC和hadh2基因的研究2007
关于酒精对人类胎儿的发育毒性最初报道于1968年，孕妇饮酒会导致胎儿酒精综合症(FAS)。FAS的主要特征是发育延迟、心脏异常、中枢神经系统异常、颅面部特征异常及骨骼缺陷等。据估计，在一般人群中，新生儿的FAS发生率为1.2‰。中枢神经系统是酒精的作用靶标，酒精处理会导致神经管缺陷(neuraltube dcfcots，NTDs)，而NTD8是最普遍的先天性缺陷之一，发生率为0.5-12‰，但对其发病机制尚不清楚。斑马鱼属硬骨鱼，是发育生物学的模式生物之一，已被证明为人类疾病和药物毒性评价的理想动物模型。本研究以斑马鱼为模式动物，研究酒精对斑马鱼早期胚胎发育的影响，试图揭示酒精对胚胎发育的影响机制，以期为人类先天性神经管缺陷的防治提供理论依据，为孕妇杜绝饮酒和优生优育提供科学指导。
本研究首先用不同浓度的酒精处理不同发育时期的斑马鱼胚胎，通过系统观察发现，酒精对斑马鱼胚胎发育的影响存在明显的时期和浓度依赖性
，3﹪酒精于domo期开始处理胚胎3h对胚胎的体轴发育影响明显，极易引起轴裂(splitaxis)，即体轴后部出现分叉，但在近尾部区又合在一起。综合形态学、组织学观察及原位杂交结果发现，轴裂胚胎的体轴后部出现了2条脊索、神经管及2套体节，与人类的神经管缺陷脊柱裂的表型有相似性。通过分析推断，轴裂胚胎2条神经管和2套体节的形成可能是由裂开的脊索诱导的。实验还发现，酒精处理可明显地延迟胚胎的发育，从dome期开始处理3h后
，酒精处理胚胎仅处于50﹪下包期，而正常胚胎发育至接近70﹪下包，受精后大约11h酒精处理胚胎仍处于原肠胚期，而胚胎细胞的集中延伸运动是该时期的关键事件。为了进一步探寻酒精引起轴裂的致畸机制，利用原位杂交方法研究了酒精处理胚胎中几个发育相关重要基因的表达，结果发现，酒精处理对体轴发育相关基因ntl，MyoD，neurogeninl，tbx6和gsc的表达图式具有明显的影响，特别于受精后大约11h，酒精处理胚胎与正常胚胎上述5个基因的表达图式差异显著，ntl的表达区域在酒精处理胚胎的背部分为两部分，MyoD的表达区域变宽，neurogeninl在腹侧原神经细胞丛中的表达出现分叉
，tbx6的表达区域明显变大，且在预定体节板中的表达图式不规则，gsc的表达区域分为两部分，这些结果提示，酒精干扰神经外胚层和中胚层细胞的集中延伸运动，特别是ntl表达细胞不能集中到体轴中线处。而ntl已证明与斑马鱼胚胎的集中延伸运动存在密切关系，是脊索区集中的一个关键调节子
，与非经典的Wnt信号通路共同调节斑马鱼身体后部的形态发生。因此可以推断，酒精干扰胚胎细胞的集中延伸运动引起轴裂。文昌鱼是一种头索动物，被认为是现存的最接近于脊椎动物的无脊椎动物，具有许多脊椎动物发育相关基因的同源基因，是研究动物发育机制及脊椎动物起源与进化的典型材料。斑马鱼是研究脊椎动物发育机制的理想动物模型。随着分子水平研究的不断深入，对文昌鱼和斑马鱼发育机制的研究取得了较大进展，发现了一些重要的发育相关基因。但是，动物胚胎发育受动态的、网络化的基因调控，还需要做大量的深入、系统的研究。本研究首次克隆了文昌鱼发育相关基因Amphibfef2、Amphi-mMRLC和hadh2的全长cDNA，并对其进行了演绎蛋白特性分析、进化生物学分析及发育表达研究。为了进一步揭示在进化过程中基因功能的变化，我们又克隆了斑马鱼的Z-MRLC和hadh2基因，并与文昌鱼的同源基因进行了比较研究。本研究为揭示文昌鱼、斑马鱼的发育机制及阐明在生物进化过程中基因功能的变化提供了重要资料。
通过对青岛文昌鱼的cDNA文库进行大规模测序，发现了一个与其它物种的肌细胞增强因子2(Mef2)基因的3'端序列具有较高同源性的EST片段，通过设计兼并引物进行RT-PCR，获得了全长cDNA。演绎蛋白的的氨基酸序列分析结果表明，演绎蛋白具有高度保守的MADS和MEF结构域，与MADS家族的其它MEF2成员类似，这两个区域与其它物种的相应区域的氨基酸一致性在90﹪以上，因此，将该cDNA定名为AmphiMef2。进化生物学分析表明，该蛋白更接近于脊椎动物的同源蛋白，位于脊椎动物分支的基部。肌细胞增强因子2属转录因子MADS家族成员，它能控制脊椎动物肌肉特异基因的表达，但在无脊椎动物中，并非所有的Mef2基因都是肌肉发育所必需的。原位杂交结果显示，AmphiMef2具有明显的时空表达特异性，首先在早神经胚(大约受精后10h)的预定体节中胚层中表达，之后在体节和未分割的预定体节中胚层中表达。但从幼虫早期(24h)开始，前部体节中的表达水平开始下调。36h幼虫期，只在后部体节中检测到它的表达。至48h幼虫期，AmphiMef2在整个体节中的表达消失，其表达区域转移至口前窝(一个与脊椎动物腺垂体同源的器官)，且持续表达至72h幼虫期。实验结果提示，文昌鱼AmphiMef2可能不但参与肌肉发生，而且可能在口前窝的发育或功能发挥中起作用。AmphiMef2是否在文昌鱼生殖内分泌系统中起作用值得进一步研究证实。通过对青岛文昌鱼神经胚cDNA文库进行规模化测序，并借助于RT-PCR，获得了含有504 bp完整开放阅读框的Amphi-mMRLC cDNA序列，该序列编码167个氨基酸。根据GenBank的序列设计引物，利用RT-PCR获得含有519 bp完整开放阅读框的斑马鱼Z-
MRLC(Similiar to 19.9 KD myosin light ohainisoform 1)oDNA序列，该序列编码172个氨基酸。对这两个cDNA序列演绎蛋白的蛋白质特性分析比较发现，Amphi-mMRLc与Z-MRLC蛋白具有一定的相似性，均具有EF-hand结构域，蛋白质的等电点接近，二级结构中的无规则卷曲比例接近，但是这两个蛋白之间也存在明显的差异，如序列长度、氨基酸组成、磷酸化位点的数量等。序列比对结果表明，Amphi-mMRLC和Z-MRLC演绎蛋白的氨基酸一致性为
46﹪，与爪蟾、牛、鸡、人、褐家鼠及海绵同源蛋白的氨基酸一致性达46﹪-47﹪。在构建的系统发生进化树中，文昌鱼Amphi-mMRLc和斑马鱼Z-MRLC序列分别位于无脊椎动物和脊椎动物分支上，基本符合生物进化规律。整封原位杂交结果表明，文昌鱼和斑马鱼的MRLC基因的表达图式存在明显差异。Amphi-mMRLC首先在文昌鱼早神经胚期的预定体节中胚层中表达，随后限定在体节及肌刀中表达，并且这种表达模式持续至72h幼虫期。在文昌鱼整个发育过程中，在非肌刀肌肉组织中未检测到．Amphi-mMRLC的表达。但是，在斑马鱼的体节中并未检测到Z-MRLC的表达。Z-MRLC于体节期在心脏原基、头部中胚层中的表达较强，在分化中的内胚层中表达较弱。受精后72h，它的表达限定在心脏、背部主动脉、肠道上皮和耳泡中。由于文昌鱼Amphi-mMRLC与其它无脊椎动物的同源基因均在肌肉组织中表达，因此推断，无脊椎动物的MRLC可能参与肌肉发生。而脊椎动物的MRLC家族具有更多的成员及更广泛的功能。由此可见，MRLc家族成员在进化过程中发生了变化，出现了新的成员和新的功能。
羟酰基辅酶A脱氢酶II(hadh2)是一种多功能线粒酶，它具有多种生理功能，并与人类一些疾病特别是先天性出生缺陷存在密切关系。hadh2基因突变会造成MHBD(2-甲基-3羟基丁酰CoA脱氢酶)不足，而MHBD不足会引起一种异亮氨酸代谢先天性出生缺陷。通过对青岛文昌鱼oDNA文库进行规模化测序及借助于RT-PCR，我们首次获得了文昌鱼hadh2基因的全长oDNA。为了进一步研究hadh2在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育中的作用及其在进化过程中的功能变化
，我们根据GenBank中的斑马鱼hadh2序列设计特异引物进行RT-PCR，获得了斑马鱼hadh2片段。通过对文昌鱼和斑马鱼hadh2演绎蛋白的蛋白质特性分析比较发现，二者演绎蛋白的氨基酸序列长度相同，均为260个氨基酸，氨基酸组成略有差异，蛋白质的等电点和分子量几乎相等，均含有保守的结构域，即短链酒精脱氢酶(adh-short)结构域。进化生物学分析表明，文昌鱼hadh2与斑马鱼hadh2的氨基酸一致性达70﹪，文昌鱼的hadh2位于系统发生进化树脊椎动物分支的基部，与脊椎动物的同源蛋白具有较近的亲缘关系。胚胎整封原位杂交结果表明，文昌鱼hadh2首先于神经胚中期(受精后大约12h)分化中的内胚层和中胚层中表达，之后在内胚层、脏壁中胚层及后部神经管中表达，至30h幼虫期，其表达限定在肠道上皮和脏壁中胚层中，在神经管中的表达消失，至72h幼虫期，它的表达限定在肠道上皮中。与文昌鱼hadh2相比，斑马鱼的hadh2是一种母源性表达的基因，在原肠胚期表达下调，至晚体节期，hadh2在头部中胚层、内胚层及眼睛中的表达较强，在中枢神经系统中的表达较弱，但在后部神经管中未检测到hadh2的表达。由此可见，hadh2可能在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育过程中起重要作用，但是在进化过程中某些功能发生了变化。
7.期刊论文程震龙.朱大海.张志谦MEF2与肌肉发生-遗传2002,24(5)
MEF2属于MADS (MCM1,agamous,deficiens,serum response factor)框转录因子家族,在肌肉发生过程中起着重要的调节作用.本文综述了肌肉发生过程中MEF2基因的表达调控、MEF2蛋白活性调节及其激活靶基因表达等,着重阐述了MEF2在钙调素-钙调磷酸酶与TGF-β-Smad通路中的作用,并分析了
MEF2成为肌肉发生中承接信号分子与结构蛋白之间桥梁的原因.
8.期刊论文张文炜.徐列明转录因子MEF2对多种信号通路的调节及其生物学作用-中国生物化学与分子生物学报
2004,20(4)
肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF 2)是一种特定的转录因子.由于其涉及基因调节的不同环节及其多样的控制基因表达和功能的调节机制,正日益受到高度的重视.目前发现MEF2最突出的功能是控制肌细胞分化过程中的基因转录,其主要作用是在骨骼肌、心肌和平滑肌的发育过程中介导细胞的分化.MEF2作为钙依赖性调节因子,在神经系统的发育和分化中也发挥着重要的作用.近来实验发现,MEF2可能参与肝脏纤维化的形成过程,是肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)活化的转录调节因子.
9.外文期刊Hidaka K.Morisaki T.Byun SH.Hashido K.Toyama K.Mukai T The MEF2B homologue differentially
expressed in mouse embryonal carcinoma cells.
The MEF2 gene family encodes a MADS-box transcription factor which regulates expression of many muscle-specific genes. We examined the expression of the MEF2 genes in mouse embryonal carcinoma P19 cells before and after in vitro muscle differentiation induced by dimethyl sulfoxide (DMSO). At least three different MADS/MEF2 domains (MEF2A, 2B and 2D) were isolated from P19 cells with the MOPAC technique (mixed oligonucleotides primed amplification of cDNA). Although two of the MADS/MEF2 domain sequences were identical to those of human MEF2A and MEF2D, another domain sequence was similar but not identical to that of human MEF2B. While the transcription of MEF2A and MEF2D was up-regulated during differentiation of P19 cells, the MEF2B homologue was abundantly transcribed in undifferentiated P19, F9 and ES cells and down-regulated in adult heart, skeletal muscle or brain, suggesting that the murine
MEF2B homologue might have a function distinct from other members of the MEF2 gene family in embryogenesis and development.
10.学位论文白雪莉肝星状细胞通过MEF2调控组蛋白乙酰化失衡在肝细胞肝癌发生中的作用研究2008
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第五大最常见的恶性肿瘤，每年约有100万以上的人新患此病和超过50万的人死于此病，占全球恶性肿瘤死亡原因的第3位，
基因和细胞生物学的研究表明，实质细胞和间质细胞的共同作用是癌症形成和发展的重要基础。间质细胞包括活化的(肌)成纤维细胞、炎症细胞、内皮细胞等，通过细胞因子、化学因子、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)或细胞间的直接接触等途径和实质细胞相互作用，与实质细胞癌变、肿瘤中新生血管及结缔组织生成、肿瘤免疫等有关，在肿瘤发生发展中扮演重要角色。
肝脏的间质细胞包括肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)和枯否细胞等。HSC又称为Ito细胞、贮脂细胞(1ipocyte)、窦周细胞(perisinusoidall ceil)，呈梭形或多边形，位于肝窦内皮与肝细胞之间的Disse间隙内，其特点是具有长的分枝状的细胞突起，并通过这些细胞突起与肝窦内皮细胞和肝细胞形成紧密接触，为HSC和肝细胞的相互作用奠定了生理解剖学基础。
MEF2家族成员的N端都包含MADS/MEF2S位点，可以调控和DNA的结合以及和基因的相互作用。通过MADS/MEF2S位点，MEF2可以募集Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)和/或乙酰基转移酶(histoneacetyltransferases，HATs)。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和乙酰基转移酶(HATs)是调控组蛋白乙酰化状态的两种功能相反的酶，前者主要是移去核心组蛋白(H2A，H2B，H3和H4)N端赖氨酸残基上的乙酰基，使组蛋白低乙酰化；后者则将乙酰辅酶A上的乙酰基转移到核心组蛋白分子N端赖氨酸的ε-氨基上，进行乙酰化修饰，使组蛋白高乙酰化。大量体外研究发现应用HDACs抑制剂可以阻滞肿瘤细胞周期，抑制其生长，诱导其分化和/或凋亡。HDACs抑制剂已被美国FDA批准用于白血病的治疗，在实体瘤治疗中的应用处于临床试验阶段。但是也有研究结果提示，HDAC基因的低表达状态与癌症的不良预后相关。如在乳腺癌中，HDAC6 mRNA和蛋白质水平在直径小于2cm、雌激素受体和孕激素受体阳性的肿瘤组织中呈高表达，其高表达状态与乳腺癌患者的无瘤生存率及内分泌治疗的有效性呈正相关。另外，有人报道Ⅱ型HDAC基因表达水平的下降与肺癌患者的不良预后显著相关，是一个独立的不良预后预测指标，尤其是HDAClO。依据这些研究结果，试图使用HDACs抑制剂作为抗癌药，通过提高细胞组蛋白的乙酰化水平来治疗乳腺癌和肺癌等实体肿瘤，前景不容乐观。迄今为止，国内外尚未对肝癌中HDACs/HATs的表达状态、组蛋白乙酰化水平进行系统、详尽的研究。人们直接尝试应用HATs抑制剂或HDACs抑制剂改变组蛋白乙酰化状态以治疗肝癌，结果体外研究发现两者都有潜在的抗癌作用。HATs抑制剂如姜黄素(Cur)，镍离子和1，10-二氮杂菲铜(1，10-phenanthroline-Cu2+)可下调抗凋亡基因表达、抑制肝癌细胞生长、导致肝癌细胞凋亡；另外的研究却支持HDACs抑制剂对肝癌细胞的抑制作用，其机制有：1)阻滞肝癌细胞周期，抑制细胞生长、增殖，上调抑制细胞周期的基因，诱导凋亡；2)恢复多个抑癌基因的表达；3)降低肝癌细胞的端粒酶活力，抑制肝癌细胞增殖；4)通过NK细胞介导的免疫反应，破坏肝癌细胞。互相矛盾的体外研究结果，促使我们有必要进一步了解：(1)肝癌组织中的组蛋白乙酰化水平及其调节酶的表达，以期为以改变组蛋白乙酰化状态为治疗靶点的新的抗癌药物在肝癌中的应用提供科学依据；(2)肝癌发生过程中组蛋白乙酰化异常是否与MEF2有关。
因此，本实验观察人正常肝组织、肝硬化和原发性HCC组织中HSC的活化情况、检测MEF2和Ⅱ型HDACs(HDAC4，-5，-6，-7，-9，-10)基因的表达、分析组蛋白乙酰化状态，致力于探索HCC发生过程中组蛋白乙酰化的异常变化，探讨活化的HSC通过MEF2，募集Ⅱ HDACs/HATs，调节组蛋白乙酰化修饰水平，从而在HCC发生中发挥重要作用的可能机制。
本文链接：https://www.doczj.com/doc/db15947866.html,/Periodical_shandyy200904006.aspx
授权使用：华中农业大学(hzny)，授权号：661e348f-0019-481e-a2a6-9e4d00b221c2
下载时间：2010年12月15日