一、填充题：
1.液相色谱仪的流动相常用的脱气方法有：超声波脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、吹氦脱气法、和在线真空脱气法几种。
2.JJG705-2002检定规程规定，用重铬酸钾高氯酸溶液检定紫外-可见光检测器的波长示值误差和重复性，用萘、甲醇溶液检定荧光检测器的波长示值误差和重复性。
3.JJG705-2002检定规程规定，检定可调波长荧光检测器的波长示值误差和波长重复性时，激发波长为 345nm ，发射波长为455nm 。
4.液相色谱仪是利用试样中各组分在色谱柱内固定相和流动相间分配或吸附特性的差异，将试样中各组份进行分离的。
5.在反相键合色谱体系中，键合固定相的极性小于流动相的极性。
6.JJG705-2002检定规程规定，荧光检测器波长示值误差优于±5nm ，波长重复性误差优于2nm 。
7.色谱柱柱效下降，则色谱峰保留时间变长，色谱峰峰宽变大。
8. 当被分析的样品浓度足够低时，荧光强度与入射光强度、量子效率及样品浓度
呈线性关系。
9.示差折光率检测器受温度和流量波动影响较大，一般不能进行梯度洗脱。
10.JJG705-2002检定规程规定，用萘/甲醇溶液检定紫外-可见光检测器的最小检测浓度，用丙甲醇/水溶液检定示差折光率检测器的最小检测浓度。
11.JJG705-2002检定规程规定，检定荧光检测器的最小检测浓度时，激发波长为345nm，发射波长为 455nm 。
12.JJG705-2002检定规程规定，紫外-可见光检测器波长示值误差不超过±2nm，波长重复性误差优于2nm 。
13.反相色谱体系中，常用的流动相有水、甲醇、乙腈。
14.液相色谱仪是依据被测样品中各组份的保留时间和响应值（峰面积或峰高）进行定性
和定量分析的。
15. JJG705-2002检定规程规定，示差折光检测器的基线噪声应不超过5×10－7RIU，基线漂移应不超过5×10－6RIU/h 。
16.在线性范围内，紫外-可见光检测器测得的吸光度与被测组分的摩尔吸收系数、摩尔浓度及样品池光路长度成正比。
17. JJG705-2002检定规程规定，紫外-可见光检测器的基线噪声应不超过5×10－4AU，基
线漂移应不超过 5×10－3AU/h。
18.JJG705-2002检定规程适用于配有紫外-可见光检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器和示差折光率检测器的液相色谱仪。
19.用作液相色谱仪流动相的溶剂，在进入色谱系统前，必须经过过滤和脱气。
20.液相色谱仪由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和数据记录处理装置等几部分组成。
二、选择题：
1.JJG705-2002检定规程规定，紫外可见光检测器的基线噪声应不超过 A 。
A.5×10-4 AU
B.5×10-3 AU
C.5×10-5AU
2.JJG705-2002检定规程中‘线性范围的检定’的条款中，检测下限c L的测量方法
为 A 。
A.采用最小检测浓度的测量方法，用丙酮的最小检测浓度为检测下限c L。
B.在测量线性范围工作曲线中，取响应值为两倍噪声处相对应的浓度为检测下限c L
C. 在测量线性范围工作曲线中，取响应值与噪声相等处相对应的浓度为检测下限c L
3.荧光检测器属于 B 。
A.通用型检测器
B.选择性检测器
C. 两者都不是
4．对多组份混合物的分离，色谱柱越长分离 B 。
A.越差
B. 越好
C. 越快
5.检定可调波长荧光检测器波长示值误差和波长重复性时，所用的波长标准为： A 。
A.萘的甲醇溶液
B.硫酸奎宁溶液
C.重铬酸钾溶液
6.检定紫外-可见光检测器的最小检测浓度时，流动相为 B 。
A.90%乙腈
B.100%甲醇
C.HPLC水
7.JJG705-2002检定规程规定，流量为1.00mi/min时，泵流量设定值误差S S应小于： B 。
A.2%
B.3%
C.5%
8.JJG705-2002检定规程规定，示差折光率检测器的基线噪声应不超过 B 。
A.5×10-6 RIU
B.5×10-7 RIU
C.5×10-8RIU
9.JJG705-2002检定规程规定，荧光检测器的波长示值误差应不超过 C 。
A.±2nm
B. ±3nm
C. ±5nm
10.JJG705-2002检定规程中,检定紫外-可见光检测器波长示值误差和重复性的标准波长
为 C 。
A.257nm和320nm
B.254nm和300nm
C.257nm和350nm
11.JJG705-2002检定规程规定，用硫酸奎宁硫酸水溶液测得的荧光检测器的最小检测浓度应不超过 B 。
A.1×10-8 g/ml
B.1×10-9 g/ml
C.1×10-10g/ml
12.检定液相色谱仪的环境条件为：室温 A 。
A.15～30℃
B.15～35℃
C. 10～30℃
13.检定紫外-可见光检测器波长示值误差和波长重复性时，所用的波长标准为： C 。
A.萘的甲醇溶液
B.硫酸奎宁溶液
C.重铬酸钾溶液
14.液相色谱仪除按检定周期检定外，有下列情况的应随时检定： A 。
A.仪器经修理后
B.更换色谱柱后
C.更换记录仪后
15.JJG705-2002检定规程规定，流量为0.5mi/min时，泵流量设定值误差S S应小于： C 。
A.2%
B.3%
C.5%
16.配有 C 的液相色谱仪不能采用梯度洗脱。
A. 紫外-可见光检测器
B. 荧光检测器
C. 示差折光率检测器
17.荧光检测器的工作原理是： A 。
A.化合物分子的光致发光现象
B.某些合物分子会发荧光
C. 化合物分子对光有吸收18．目前使用的液相色谱仪的流动相含有pH缓冲盐，要将流动相转换为纯甲醇，应当 B 。
A.直接将贮液瓶内的流动相换成甲醇
B.先用水冲洗输液系统，将管路冲净后再将流动相换为甲醇
C.以上方法都可以
19.十八烷基键合相属于 B 固定相。
A.液-液分配色谱
B.液-固吸附色谱
C.离子交换色谱
20.为了使未完全分开的色谱峰更好地分离，一般采用 A 的方法：
A.改变流动相极性
B. 改变流速
C. 改变柱温
三、问答题：
1．梯度洗脱的作用是什么？试述梯度误差的检定方法及计算公式？
答：梯度洗脱的作用是使溶剂强度在色谱过程中逐渐增加。梯度误差的检定方法：由梯度控制装置设置阶梯式的梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为含0.1%丙酮的水溶液，B经由五个阶梯从0变到100％，输液泵和检测器连接（不接色谱柱）开机后用啊溶剂冲洗系统，基线平稳后开始执行梯度程序，画出梯度变化曲线。求出阿A、B溶剂不同比例时的输出信号值（或记录仪读数），重复测量二次，计算平均值。从B溶剂的含量及对应的输出信号值（或记录仪读数）计算梯度误差Gci，取Gci最大者作为仪器梯度误差。其公式是：
Gci=(Li-Lm)/Lm×100％
2.为什么用作液相色谱仪流动相的溶剂，在使用前必须经过脱气？常用的脱气方法有哪些？答：流动相进行脱气是为了除去其中溶解的气体（如O2），以防止洗脱过程中流动相由色谱柱流至检测器时因压力降低而产生气泡。在低死体积检测池中，存在气泡会增加基线噪声，甚至造成分析灵敏度下降。此外，溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响检测，还会导致样品中某些组分氧化使柱中固定相降解而改变柱的分离性能。
常用脱气方法有五种：1、加热回流法；2、抽真空脱气法；3、吹氦脱气法；4、超声波脱气法；5、在线真空脱气法。
3.检定液相色谱仪的计量性能应做的检定项目包括哪些？
答：液相色谱仪计量性能检定项目包括四部分：
1、泵耐压、泵流量设定值误差、泵流量稳定性误差和梯度误差；
2、柱箱温度设定误差、柱箱温度稳定性；
3、检测器基线噪声、基线漂移、最小检测浓度、波长示值误差和重复性、线性范围和换挡误差；
4、整机定性定量重复性。
4.叙述紫外-可见光检测器的工作原理，最小检测浓度的检定方法步骤及计算公式。
A、答：紫外-可见光检测器的原理是基于郎伯－比尔定律，通过测定样品在检测池中吸收紫外－可见光的大小来确定样品的含量。
最小检测浓度的检定：采用测量基线噪声的色谱条件、方法测量基线噪声。然后，在相同色谱条件下用微量注射器从进样口注入10－20μl标样，记录色谱图，由色谱峰高和基线噪声峰－峰高，计算最小检测浓度。
公式：C L=2N d C×V/H×20
B、答：物质分子吸收紫外辐射是由于分子体系中外层电子激发到较高能态引起的，这一过程遵从郎伯－比尔定律，紫外检测器是利用上述原理。以恰当光路、电路设计，输出与样品浓度成正比的光吸收值信号。在样品池光路长度一定时，样品摩尔吸收系数越大，灵敏度越高。摩尔吸收系数大小与波长和样品的性质有关，它表明物质分子对特定波长辐射的吸收能力。在波长一定时，样品摩尔吸收系数由分子截面和跃迁几率决定。
最小检测浓度的检定：选用C18色谱柱，以100％甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长为254nm,开机预热，待仪器稳定后记录基线30min, 然后，在相同色谱条件下用微量注射器从进样口注入10－20μl标样，记录色谱图，由色谱峰高和基线噪声峰－峰高，计算最小检测浓度。
公式：C L=2N d C×V/H×20
5．简述荧光检测器的工作原理，及荧光检测器的线性范围的检定方法。
答：因为许多化合物存在光致发光现象，即它们可被入射光（激发光）所激发并再发出波长相同的共振辐射或波长较长的特征辐射。荧光检测器就是基于测量这种波长较长的特征辐射的强度。当被分析的样品浓度足够低时，荧光强度与入射光强度，量子效率及样品浓度呈线性关系。
检测荧光检测器的线性范围时检测器的激发波长为345，发射波长为455，。仪器稳定后，
用注射器向检测池中注入0.05mol/L的高氯酸水溶液，冲洗检测池至仪器读数不变，记下读数。然后依次注入1×10－5，2×10－5，3×10－5，――1×10－4g/ml的硫酸奎宁/高氯酸水溶液，记下对应读数，重复测量三遍，取平均值。取含量1×10－5g/mL～5×10－5g/mL 的五个样品的读数作标准曲线，在曲线上找出样品含量大于1×10－5g/mL的各点读数与测量值比较，测量值与曲线读数差5％时的样品含量为检测上限。检测上限与最小检测浓度（即检测下限之比值即为检测器的线性范围。
6.使用配有示差折光率检测器应注意什么？
答：因为示差折光检测器对环境条件如温度、流量波动等要求较严，故一般不能用梯度洗脱操作。
四、计算题：
1.检定某一台岛津公司生产的SPD-10A液相色谱仪紫外检测器，使用满量程为1mV的积分仪，在测量基线时，信号从10mVFS端输出，检测器的测量范围(RANGE)为0.0005AUFS,积分仪的衰减ATT=20,从积分仪上测得基线噪声为0.16mV,1小时内基线漂移为0.40mV/h ，测量最小检测浓度时，用微量注射器从进样口注入10μl浓度为1.00× 10-7g/ml的萘/甲醇溶液，信号从1V端输出,且1V =0.5AU,RANGE为0.1AUFS,积分仪的衰减为ATT=20，从积分仪上测得样品峰的峰高为0.42mV(测量前已校零)，求：基线噪声，基线漂移和最小检测浓度。
解：基线噪声 N d=KB
最小检测浓度 C L=2N d C×V/H×20
ATT＝20 10mv＝0.0005AU 1mv＝0.00005AU＝5×10-5AU
基线噪声 Nd＝0.16×5×10-5＝1.6×5×10-6＝8×10-6AU
基线漂移 D＝0.40×5×10-5＝2×10-5AU/h
ATT＝20 1V=0.5AU 0.42MV＝0.00042V＝4.2×10-4V
峰高H＝4.2×10-4×0.5＝2.1×10-4AU
最小检测浓度 CL＝2NdC×V/H×20＝2×8×10-6×1×10-7×10/2.1×10-4×20＝3.81×10-9g/ml
2．检定某一台WATERS公司生产的2410型液相色谱仪示差折光率检测器，色谱条件按检定规程设定，信号从Recorder Out端输出，用满量程为1 mV的积分仪记录信号（积分仪衰减为20）。此时输出信号（mV）与检测器折光率的变化Δn（RIU）的关系为：输出信号(mV)=2000×SF×S×Δn（RIU）
先将检测器参数设为S=64、SF=80，记录基线，测得基线噪声为0.205 mV,半小时内基线漂移为0.755 mV。再将检测器参数设为S=16、SF=20，用微量注射器从进样器注入10μl
1.00× 10-5g/ml的丙三醇标准溶液，从积分仪上得到相应的色谱峰峰高为203785μV。求：基线噪声，基线漂移和最小检测浓度。
解：基线噪声 N d=KB
最小检测浓度 C L=2N d C×V/H×20
ATT＝20 1MV=2000×80×64×Δn
基线噪声: Nd＝0.205/2000×80×64＝2×10-8RIU
基线漂移: D＝2×0.755/2000×80×64＝1.5×10-7RIU/h
203785μV＝203.785mv
峰高:H＝203.785/2000×20×16＝3.2×10-4RIU
最小检测浓度:
CL ＝2NdC ×V/H ×20＝2×2×10-8×1×10-5×10/3.2×10-4
×20
＝0.629×10-9g/ml ＝6.3×10-10g/ml
3．按照JJG705-2002检定规程用丙三醇标准溶液对某台配有示差折光率检测器进行的液相色谱仪进行线性范围检定。用静态法重复测量三次，取平均值，得到与丙三醇浓度(g/ml)相应的检测器读数(RIU)（见表）：
l 围。
解：最小检测浓度 C L =2N d C ×V/H ×20
按照检定规程的计算方法，取其前5组数据，用最小二乘法计算：
设方程为：Y=a+bX
-X=ΣX i /5=3 -Y=ΣY i /5=13.06 n=5
Σ(X i --X)(Y i --Y)=(1-3)*(4.1-13.06)+(2-3)*(8.9-13.06)+(3-3)*(13.7-13.06)+(4-3)*(16.9-13.06)+ (5-3)*(21.7-13.06)=17.92+4.16+3.84+17.28=43.2
Σ(X i --X)2=(1-3)2+(2-3)2+(3-3)2+(4-3)2+(5-3)2=10 b=4.32 a=-Y-b -X=13.06-12.96=0.1
得到一线性方程：Y = 4.32X + 0.1 。
将第6点至第10点的浓度代入线性方程，计算理论响应值Ys 及测得值与理论值的偏差： 第6点Ys= 4.32×6.0+ 0.1=26.02 (Y-Ys)/ Ys ×100％=(24.9-26.02)/26.02×100％=-4.3%<-5%
第7点Ys= 4.32×7.0+ 0.1=30.34 (Y-Ys)/ Ys ×100％=(28.1-30.34)/30.34×100％=-7.4%>-5%
∴检测上限ＣH =7.0×10-3g/ml,
该检测器的线性范围 = ＣH /Ｃl =7.0×10-3/5.0× 10-8=1.4×105
4.检定某一液相色谱仪的泵性能，设定泵流量为1ml/min ，连续测量泵流量Fm 三次，测得数据为：1.0075ml/min,1.0087ml/min,1.0091ml/min 。求：泵流量设定值误差S S 和泵流量稳定性误差S R ：
解：Ss=(Fm-Fs)/Fs ×100％
S R =(Fmax-Fmin)/Fm ×100％
-Fm=(1.0075+1.0087+1.0091)/3=1.0084
Ss=(-Fm-Fs)/Fs×100％=(1.0084-1)/1×100%=0.84%
SR=(Fmax-Fmin)/-Fm×100％=(1.0091-1.0075)/1.0084×100%=0.16%
5．按照JJG705-2002检定规程的方法对某台液相色谱仪进行梯度误差检定，得到如下实验数据：
请按照检定规程中梯度误差的计算方法将表格填写完整。
解：G Ci=（L i-L m）/L m×100％
GCi=（-Li--Lm）/-Lm×100％=(0.018-0.0184)/0.0184×100%=-2.17%
6．检定液相色谱仪定性、定量重复性(共测6次)，得到数据如下表所示：
求：.液相色谱仪的定性、定量重复性误差。
解：
RSD6=√∑(Xi-X)2/(6-1)×1/X×100％
-t=(1.796+1.794+1.796+1.794+1.790+1.793)/6=1.794
-A=(3.716+3.740+3.734+3.752+3.739+3.760)/6=3.74
RSD定性=√∑(ti--t)2/(6-1)/-t×100％=0.125%
RSD定量=√∑(Ai--A)2/(6-1)/-A×100％=0.406%
高效液相色谱法习题 一、选择题 1.液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2.HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（） A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相粘度较大 D 柱温低 3.分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS 柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 4.在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 5.在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（
A 减小填料粒度 B 适当升高柱温 C 降低流动相的流速 D 增大流动相的流速 6．如果样品比较复杂，相邻两峰间距离太近或操作条件不易控制稳定，要准确测量保留值有一定困难时，可选择以下方法（）定性。 A 利用相对保留值定性 B 加人已知物增加峰高的办法定性 利用文献保留值数据定性D 与化学方法配合进行定性 7．液相色谱中通用型检测器是（） A 紫外吸收检测器 B 示差折光检测器 C 热导池检测器 D 荧光检测器 8．离子色谱的主要特点是（） A 高压、高效、高速、高分辨率、高灵敏度 B 采用柱后抑制技术和电导检测，特别适合离子分析 C 采用了阴离子专用检测器，对阴离子分析有高灵敏度 D 采用紫外检测器合柱压衍生装置，对离子分析有高效 9．高压、高效、高速是现代液相色谱的特点，采用高压主要是由于（） A 可加快流速，缩短分析时间 B 高压可使分离效率显着提高
C 采用了细粒度固定相所致 D 采用了填充毛细管柱 10. 与气相色谱相比，在液相色谱中（）。 A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 11．在液相色谱中，下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上，同时获得被分离组分的三维彩色图形的是（）。 A 光电二极管阵列检测器 B 示差折光检测器 C 荧光检测器 D 电化学检测器 12．不同类型的有机物，在极性吸附剂上的保留顺序是（）。 A 饱和烃、烯烃、芳烃、醚 B 醚、烯烃、芳烃、饱和烃 C 烯烃、醚、饱和烃、芳烃 D 醚、芳烃、烯烃、饱和烃 13．液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。 A 涡流扩散项 B 分子扩散项 C 传质扩散项 D 柱压效应 14．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（
高效液相色谱习题及参考答案 一、单项选择题 1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（）。 A、分配色谱法 B、排阻色谱法 C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。 A、检测器 B、记录器 C、色谱柱 D、进样器 3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？ A、0.5μm B、0.45μm C、0.6μm D、0.55μm 4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？ A、改变流动相的种类或柱子 B、改变固定相的种类或柱长 C、改变固定相的种类和流动相的种类 D、改变填料的粒度和柱长 5. 一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（） A、甲醇/水（83/17） B、甲醇/水（57/43） C、正庚烷/异丙醇（93/7） D、乙腈/水（1.5/98.5） 6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 7. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（）范围内。 A 、10～30cm B、20～50m C 、1～2m D、2～5m 8. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（） A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分
9. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（）的操作 A、改变柱长 B、改变填料粒度 C、改变流动相或固定相种类 D、改变流动相的流速 10. 液相色谱中通用型检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、示差折光检测器 C、热导池检测器 D、氢焰检测器 11. 在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用下述哪种检波器 A、荧光检测器 B、示差折光检测器 C、电导检测器 D、紫外吸收检测器 12. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（） A、提高柱温 B、降低板高 C、降低流动相流速 D、减小填料粒度 13. 在液相色谱中，不会显著影响分离效果的是（） A、改变固定相种类 B、改变流动相流速 C、改变流动相配比 D、改变流动相种类 14. 不是高液相色谱仪中的检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、红外检测器 C、差示折光检测 D、电导检测器 15. 高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（） A、恒温箱 B、进样装置 C、程序升温 D、梯度淋洗装置 16. 在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是（） A、贮液器 B、输液泵 C、检测器 D、温控装置 17. 高效液相色谱、原子吸收分析用标准溶液的配制一般使用（）水
Agilent1200液相色谱仪A验证报告文件编码：REC-JYYQ-B001-01-00
目录 1．概述 2．验证目的 3．验证依据及验证范围 4．验证工作小组 5．验证方案审批 5.1验证方案起草 5.2验证方案会签 5.3验证方案批准 5.4验证方案实施 6.验证内容 6.1安装确认 6.1.1 文件资料 6.1.2售后服务 6.1.3 消耗性备品备件 6.1.4安装检查 6.1.5安装确认结论及批准 6.2 运行确认 6.2.1 灵敏度及稳定性测试 6.2.2运行确认结论及批准 6.3性能确认 6.3.1 系统适用性试验： 6.3.2定量重复性试验 6.3.3性能确认结论及批准 7.验证结论 8.最终批准
1.概述 液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产（检测器为紫外检测器，色谱柱有C18柱，可以进行含量、有关物质和聚合物的定量或定性分析。我司在购买前对该产品的性能、价格、外观和售后服务进行了广泛地调查研究，在同类产品中价格适中、性能稳定、美观且售后服务好。 2、验证目的 为了确保使用该仪器检测数据真实可靠，也为了确认该仪器的各项指标能达到该仪器所设计的性能指标，对该仪器进行验证。 2.验证依据及适用范围 参照国家技术监督局“实验室液相色谱仪检定规程”及中国药典2008版附录V D液相色谱法起草本验证方案。本验证方案适用于实验室液相色谱仪的验证。 4.验证工作小组 成立由组成的验证工作小组，担任验证工作小组组长。 5.验证方案审批 6.验证内容 6.1安装确认 6.1.1 文件资料
检查人日期 检查人日期 检查人日期6.1.4安装检查 对照使用说明书要求安装，确认环境、电源等符合要求。 检查人日期6.1.5安装确认结论及批准 6.2 运行确认(见计量局计量证书) 证书号： 运行确认结论及批准：
高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
色谱试题 一.选择题: 1. 在液相色谱中,梯度洗脱用于分离（ 4 ） (1) 几何异构体(2) 沸点相近,官能团相同的试样 (3) 沸点相差大的试样(4) 分配比变化范围宽的试样 2. 在色谱分析中通常可通过下列何种方式来提高理论塔板数（ 1 ） (1) 加长色谱柱(2) 流速加快(3) 增大色谱柱的直径(4) 进样量增加 3. 一般气相色谱法适用于（ 4 ） (1) 任何气体的测定 (2) 任何有机和无机化合物的分离、测定 (3) 无腐蚀性气体与在汽化温度下可以汽化的液体的分离与测定 (4) 任何无腐蚀性气体与易挥发的液体、固体的分离与鉴定 4. 对于一对较难分离的组分现分离不理想,为了提高它们的分离效率,最好采用的措施为（ 2 ） (1) 改变载气速度(2) 改变固定液 (3) 改变担体(4) 改变载气性质 5. 为测定某组分的保留指数,气相色谱法一般采用的基准物是（ 3 ） (1) 苯(2) 正庚烷(3) 正构烷烃(4) 正丁烷和丁二烯 6. 选出用气相色谱氢火焰离子化检测器时,与相对校正因子有关的因素是（ 4 ） (1) 固定液的极性(2) 载气的种类 (3) 载气的流速(4) 标准物的选用 7.欲使色谱峰宽减小,可以采取（2, 3 ） (1) 降低柱温(2) 减少固定液含量 (3) 增加柱长(4) 增加载体粒度 8.在用低固定液含量色谱柱的情况下,为了使柱效能提高,可选用（ 4 ） (1) 提高柱温(2) 增加固定液含量 (3) 增大载体颗粒直径(4) 增加柱长 9.在柱温一定时,要使相对保留值增加,可以采取（ 3 ） (1) 更细的载体(2) 最佳线速 (3) 高选择性固定相(4) 增加柱长 10.在气相色谱分析中,要使分配比增加,可以采取（ 1 ） (1) 增加柱长(2) 减小流动相速度 (3) 降低柱温(4) 增加柱温 11.涉及色谱过程热力学和动力学两方面的因素是( 2 ) (1) 保留值(2) 分离度(3) 理论塔板数(4) 峰面积 12. 在色谱流出曲线上,两峰间距离决定于相应两组分在两相间的( 1 ) (1) 分配比(2) 分配系数(3) 扩散速度(4) 理论塔板数 13. 气液色谱中,保留值实际上反映下列( 3 )物质分子间相互作用力 (1) 组分和载气(2) 载气和固定液 (3) 组分和固定液(4) 组分和载气、固定液 14.在以下因素中,不属动力学因素的是( 2 ) (1) 液膜厚度(2) 分配系数(3) 扩散速度(4) 载体粒度 15.根据范第姆特方程式,在高流速情况下,影响柱效的因素是( 1 )
高效液相色谱法习题 一、思考题 1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？ 16．以液相色谱进行制备有什么优点？ 17．在毛细管中实现电泳分离有什么优点？ 18．试述CZE的基本原理 19．试述CGE的基本原理 20．试述MECC的基本原理 二、选择题 1．液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相钻度较小 D 柱温低 3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 10．在高效液相色谱中，采用254 nm紫外控制器，下述溶剂的使用极限为（）。 A 甲醇210 nm B 乙酸乙醋260 nm C 丙酮330 nm 11吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（）。 A 液一液色谱法 B 液一固色谱法
高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。 一、使用试管的问题 1、试管的洁净问题。高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。 2、塑料试管的溶解问题。近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。 3、被测样品在试管壁上的吸附问题。这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TD
M)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0. 5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。 二、操作进样阀的问题 目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。 1、进样量的控制。用进样阀来进样时，阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)，由于进样时，注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此，要想使样品环中充满样品溶液，从而使用进样阀来准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量，则最大只能注射样品环体积1/2的量，这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。 2、进样阀的清洁问题。如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品，为防止这种现象的发生，应按下列步骤操作：a.进样阀有2个位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时，以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次用量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至
仪器分析练习题及答案 第2章气相色谱分析 一．选择题 1.在气相色谱分析中, 用于定性分析的参数是 ( ) A 保留值 B 峰面积 C 分离度 D 半峰宽 2. 在气相色谱分析中, 用于定量分析的参数是 ( ) A 保留时间 B 保留体积 C 半峰宽 D 峰面积 3. 使用热导池检测器时, 应选用下列哪种气体作载气, 其效果最好？ ( ) A H2 B He C Ar D N2 4. 热导池检测器是一种 ( ) A 浓度型检测器 B 质量型检测器 C 只对含碳、氢的有机化合物有响应的检测器 D 只对含硫、磷化合物有响应的检测器 5. 使用氢火焰离子化检测器, 选用下列哪种气体作载气最合适？ ( ) A H2 B He C Ar D N2 6、色谱法分离混合物的可能性决定于试样混合物在固定相中（）的差别。 A. 沸点差， B. 温度差， C. 吸光度， D. 分配系数。 7、选择固定液时，一般根据（）原则。 A. 沸点高低， B. 熔点高低， C. 相似相溶， D. 化学稳定性。 8、相对保留值是指某组分2与某组分1的（）。 A. 调整保留值之比， B. 死时间之比， C. 保留时间之比， D. 保留体积之比。 9、气相色谱定量分析时（）要求进样量特别准确。 A.内标法； B.外标法； C.面积归一法。 10、理论塔板数反映了（）。 A.分离度； B. 分配系数； C．保留值； D．柱的效能。 11、下列气相色谱仪的检测器中，属于质量型检测器的是（） A．热导池和氢焰离子化检测器；B．火焰光度和氢焰离子化检测器； C．热导池和电子捕获检测器； D．火焰光度和电子捕获检测器。 12、在气-液色谱中，为了改变色谱柱的选择性，主要可进行如下哪种（些）操作？（） A. 改变固定相的种类 B. 改变载气的种类和流速 C. 改变色谱柱的柱温 D. （A）、（B）和（C） 13、进行色谱分析时，进样时间过长会导致半峰宽（）。 A. 没有变化， B. 变宽， C. 变窄， D. 不成线性 14、在气液色谱中，色谱柱的使用上限温度取决于（） A.样品中沸点最高组分的沸点， B.样品中各组分沸点的平均值。 C.固定液的沸点。 D.固定液的最高使用温度 15、分配系数与下列哪些因素有关（） A.与温度有关； B.与柱压有关； C.与气液相体积有关； D.与组分、固定液的热力学性质有关。
第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点： 分析对象及范围流动相的选择操作条件 GC 能气化、热稳定性好、且沸 点较低的样品，占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰 性”气体，只起运载作用，对 组分作用小 加温常压操作 HPLC 溶解后能制成溶液的样品， 高沸点、高分子量、难气化、离 子型的稳定或不稳定化合物，占 有机物的80% 流动相为液体或各种液 体的混合。它除了起运载作用 外，还可通过溶剂来控制和改 进分离。 室温、高压下进行 2．何谓化学键合相常用的化学键合相有哪几种类型分别用于哪些液相色谱法中 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱什么叫反相色谱各适用于分离哪些化合物 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
高效液相色谱习题 一:选择题 1、在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径就是(D ) A、提高柱温 B、降低板高 C、降低流动相流速 D、减小填料粒度 2、在液相色谱中,为了改变柱子的选择性,可以进下列那种操作(C ) A、改变固定液的种类 B、改变栽气与固定液的种类 C、改变色谱柱温 D、改变固定液的种类与色谱柱温 3、在液相色谱中,范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略( B ) A、涡流扩散项 B、分子扩散项 C、流动区域的流动相传质阻力 D、停滞区域的流动相传质阻力 4、在高固定液含量色谱柱的情况下,为了使柱效能提高,可选用 (A ) A、适当提高柱温 B、增加固定液含量 C、增大载体颗粒直径 D、增加柱长 5、在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置就是 ( B ) A、高压泵 B、梯度淋洗 C、贮液器 D、加温 7、在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？( C ) A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相与固定相 D、组分与组分 8、在液相色谱中, 通用型检测器就是 (A ) A、示差折光检测器 B、极谱检测器 C、荧光检测器 D、电化学检测器 9、在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱就是 (A ) A、直形填充柱 B、毛细管柱 C、Ｕ形柱 D、螺旋形柱 10、纸色谱的分离原理, 与下列哪种方法相似？ ( B) A、毛细管扩散作用 B、萃取分离 C、液-液离子交换 D、液-固吸附 二:简答题 1、在液相色谱中,色谱柱能在室温下工作,不需恒温的原因就是什么？ 答:由于组分在液-液两相的分配系数随温度的变化较小,因此液相色谱柱不需恒温
MV_RR_CNG_0173 实验室液相色谱仪检定规程 1. 实验室液相色谱仪检定规程说明 编号 JJG705-1990 名称 （中文）实验室液相色谱仪检定规程 （英文）Verification Regulation for Liquid Chromatograph Used in Laboratory 归口单位 国家标准物质研究中心 起草单位 国家标准物质研究中心 主要起草人 赵 敏 (国家标准物质研究中心) 批准日期 1990年7月28日 实施日期 1991年1月1日 替代规程号 适用范围 本规程适用于新制造、使用中和修理后带有紫外-可见光(固定波 长或可调波长)、荧光(固定波长或可调波长)和差示折光检测器的实验室液相色谱仪的检定。 主要技术 要求 1 外观 2 输液系统 3 柱恒温箱温度设定值误差ΔT ：小于±2℃，控温稳定性误差T c ：小于或等于1℃(无柱箱仪器不检此项)。 4 定性、定量测量重复性 5 检测器性能 是否分级 否 检定周期（年） 2 附录数目 5 出版单位 中国计量出版社 检定用标准物质 相关技术文件 备注 2. 实验室液相色谱仪检定规程摘要 一 概 述 实验室液相色谱仪(以下简称仪器)是由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和数据记录 处理装置等几部分组成的分析仪器。图1是典型的液相色谱仪组成方框图。它利用样品中各组份在色谱柱中固定相和流动相间分配系数或吸附系数的差异，将各组份分离后进行检测，并根据各组份的保留时间和响应值进行定性、定量分析。
图1 液相色谱仪组成方框图 二 技术要求 1 外观 1.1 仪器应有下列标志：名称、型号、制造厂名、出厂日期、系列号(或编号)等。 1.2 仪器要成套、完整。 1.3 仪器各调节旋钮、按键、开关等能正常工作，无松动。指示灯灵敏。 1.4 电源线、信号电缆等插、接头与插座紧密配合。 1.5 输液管路应为不锈钢管，接头紧密、牢固，在规定的压力范围内无泄漏。 2 输液系统 2.1 泵流量设定值误差S S：小于±2％～5％；*流量稳定性误差S R，小于±2％～3％。 ：小于3％。 2.2 梯度准确度误差T c i 3 柱恒温箱温度设定值误差ΔT：小于±2℃，控温稳定性误差T c：小于或等于1℃(无柱箱仪器不检此项)。 4 定性、定量测量重复性 4.1 *定性测量重复性误差(8次测量)RSD定性：小于或等于1.5％。 4.2 *定量测量重复性误差(8次测量)RSD定量：小于或等于3.0％。 5 检测器性能 5.1 紫外－可见光检测器 5.1.1 固定波长紫外检测器波长示值误差：小于±2 nm。 5.1.2 可调波长紫外－可见光检测器波长示值误差：小于±2 nm；重复性误差：小于±1 nm。 5.1.3 *基线漂移：小于或等于5×10－3(AU/h)。 基线噪声：小于或等于5×10－4(AU)。 5.1.4 最小检测浓度(静态)：4×10－3g/mL(萘的甲醇溶液)。 5.1.5 线性范围：大于或等于103。 5.1.6 吸光度选择器换档误差：小于或等于2.0％。 5.2 荧光检测器 5.2.1 波长示值误差：小于±5 nm(固定和可调波长)。 5.2.2 *灵敏度：10－8g/mL硫酸奎宁溶液在记录仪上有满量程70％以上的响应(检测器范围档置最小，记录仪输入电压与检测器输出电压相同)。 5.2.3 *基线漂移：小于或等于±5×10－3(AU/h)。 基线噪声：小于或等于±5×10－4(AU)。 5.2.4 *最小检测浓度：5×10－10g/mL(硫酸奎宁的硫酸水溶液)。 5.2.5 线性范围：大于或等于103。 5.2.6 范围选择器换档误差：小于或等于2.0％。 5.3 差示折光检测器
液相色谱实用技术(一) HPLC定量原理及方法
液相色谱定量分析的基本原理 ?在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物 ?液相色谱定量是相对定量的方法: 即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量?液相色谱法定量的依据是: ?被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比 ?由已知量的标样可求得定量校正因子 ?定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量?测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量
液相色谱定量分析的基本步骤?开发一个适合定量分析的色谱方法: 确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5 确定被测组分色谱峰的一致性 确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围 ?用不同浓度的标准样品建立校正曲线 ?考查定量方法的准确度及精密度 ?用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果
鉴别需定量的色谱峰(定性) ?定性鉴别每个要定量的色谱峰 ?通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份 ?大多数情况下用与标样比较保留时间来定性 ?即所谓： ?保留时间相同，可能是同样的组份 ?保留时间不同，肯定不是同样的组份
用保留时间定性 ?用“标样”的保留值定出被测组份的位置 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.350.40 0.000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.507.00 AU Minutes Uracil Ethylparaben Propylparaben
高效液相色谱基础知识测试 一、填空题 1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 。高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。 2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。 3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱，最高工作压力为400 bar。 4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。 5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟，。 7、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。 二、选择题 1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ） A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( A )
A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是( A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器 5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是（B ）。(1)光源；(2)气路系统；(3)单色器系统；(4)进样系统；(5)分离系统；(6)吸收系统；(7)电导池；(8)检测系统；(9)记录系统。 A 1-3-6-8-9 B 2-4-5-8-9 C 2-4-5-7-9 D 2-4-6-7-9 7.在气相色谱定性分析中，实验室之间可以通用的定性参数是（ D ）。 A 调整保留时间 B 校正保留时间C保留时间D相对保留值 三、判断题：（正确-----√；错误----×） 1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标（√） 2. 灵敏度是检测器的主要性能指标（√） 3. 检出限与噪音无关（×） 4. 要提高柱的分离效能，可以考虑增加柱长，增加色谱柱选择性，调节流动相的组成等措施（√） 5. 溶解于流动相中的气体在色谱分离的过程中不会影响流动相的流速和检测器的稳定性（×） 6. 分析一个复杂混合物，恒溶剂洗脱是不能令人满意的。可在分离的过程中连续改变流动相的组成，即所谓梯度洗脱( √)
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LC-10AD型高效液相色谱仪检定规程 1.适用范围 适用于岛津LC-10AD型高效液相色谱仪的检定。 2.职责 检验员：严格按照检定规程进行周期检定。 QC主管：监督检查检定规程执行情况。 3.检定项目和技术要求 3.1.输液系统 3.1.1.泵流量设定值误差：Ss＜±2%；流量稳定性误差：＜±2% 3.1.2.定性测量重复性误差（5次定量管进样）：RSD≤1.5% 3.1.3.定量测量重复性误差（5次定量管进样）：RSD≤1.5% 3.2.紫外检测器性能 3.2.1.可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差：＜±2nm；重复性误差：＜±1nm 3.2.2.基线漂移：≤5×10-3（AU/h）；基线噪声：≤5×10-4(AU) 3.2.3.最小检定浓度（静态）：4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液） 4.检定条件 4.1.环境温度为10～30℃，8小时内温度波动不超过±3℃，相对湿度低于65%。 4.2.电源电压：220±22V，电源频率：50±0.5Hz。 4.3.检定设备 4.3.1.秒表：分度值小于0.1s。 4.3.2.分析天平：最大称量200g，最小分度值0.1mg。 4.3.3.容量瓶 4.3.4.微量注射器 4.3. 5.标准物质和试剂 5.检定方法
5.1.泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的检定。 将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为液动相，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10～25分钟，称重，按下式计算Ss和S R。 Ss=（Fm—Fs）/Fs×100% S R=（Fmax—Fmin）/F×100% 式中Ss为流量设定值误差（%）； Fm=（W2—W1）ρt·t为流量实测值； W2：容量瓶+流动相的重量（g）； W1：容量瓶的重量（g）； Fs：流量设定值（ml/min）； ρt：实验温度下流动相的密度（g/cm3）； t：收集流动相的时间（min）； S R：流量稳定性误差（%）； Fmax：同一组测量中流量最大值（ml/min）； Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）； F：同一组测量中的算术平均值（ml/min）。 5.2.定性、定量测量重复性的检定 将仪器联接好，使之处于正常工作状态，用进样阀的定量管注入适当的标准溶液（萘或联苯）或稳定的待分析样品溶液，记录保留时间和峰面积，连续测量5次，按下式计算相对标准偏差RSD。 RSD= [Σ（Xi—X）2]/（n—1）×1/X×100% 式中，RSD为定性、定量重复性的相对标准偏差； Xi为第i次测得的保留时间或峰面积；
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。