临床免疫组化意义
1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标志全套4项：P-gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67。
2、乳腺癌免疫组化耐药预后标志全套7项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，C-erbB-2。
3、意义：标志物作用阳性部位临床意义
(1)、多药耐药基因蛋白（P-Gp）药泵作用胞膜/胞浆，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。(2)、谷光甘肽S转移酶（GSTπ）解毒作用胞浆，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。
(3)、拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）靶点作用胞核，阳性率越高，对下列药物越无效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其无效。
(4)、雌激素受体（ER）性激素作用胞核，阳性率越高，肿瘤对内分泌医治越无效，预后越好。
(5)、孕激素受体(PR) 性激素作用胞核，阳性率越高，肿瘤对内分泌医治越无效，预后越好。
(6)、C-erbB-2癌基因产物，胞浆阳性率越高，肿瘤恶性水平越高。ER、PR阳性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺医治效果不好。
(7)、Ki-67细胞增殖标志,胞核阳性率越高肿瘤增殖越快，恶性水平越高。
Ki-67为细胞增值的一种标志，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化水平、浸润、转移、预后亲密相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。
(8)、CEA 少数腺癌表达CEA
(9)、Rb (retinoblastoma 视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调理细胞周期。
(10)、P53在免疫组化中均为渐变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短
(11)、Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。目前已被普遍使用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。简直一切的研讨都标明，nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率绝对较低，存活期绝对较长。
(12)、E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘轮作用的跨膜糖蛋白，其功用丧失惹起细胞之间衔接的毁坏，次要用于肿瘤侵袭和转移方面的研讨。
(13)、PS2（雌激素调理蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌医治和预后判别的目标之一。
(14)、CK18 低分子量角蛋白，主要标志各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。
(15)、CK19 散布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应。
(16)、Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。
(17)、CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。
(18)、CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。
(19)、Villin绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾本质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有分明腺样构造的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的能够性极低。乳腺癌也常常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别扫除的一种疾病。由于在转移癌组织上察看到分明的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不能够为乳腺来源。其他villin免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也常常
为villin阴性表达，因而在一些状况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌运用抗体的一种。
但是也有一些非胃肠道来源的肿瘤可表达villin，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌和小局部肺癌。也有一些专家报道Villin在局部宫颈内膜腺癌病例中表达。
肝癌的诊断
Villin免疫组化染色可以显示出毛细胆管构造，因而它也能够在表达局部肝癌的管状构造上很有用。多克隆CEA是用于此目的的第一种试剂，而且CD10(CALLA)在表达肝癌的该构造上也十分有用。多克隆CEA、villin和CD10(CALLA)在肝癌病例上的表达，互相之间并没有任何的抵触，因而假如疑心肝癌的能够性，建议将这三种抗体共同运用以协助疑问病例的诊断。Villin在神经内分泌肿瘤上的使用
Villin在神经内分泌肿瘤的研讨上也很有协助。众所周知，类癌和胰腺的胰岛细胞肿瘤具有相类似的形状学特征，仅在形状学上区分这两种肿瘤简直是不能够的。Villin在这种状况下特别有用，由于据文献报道在85%的胃肠道类癌病例中有villin的表达，但在胰岛细胞肿瘤上未见阳性表达报道。Villin在类癌上的表达通常为胞膜阳性。另外，有一些证据标明villin 在胃和下消化道的小细胞癌上的表达率比在其他部位的小细胞癌上要高。如：肺、食道、膀胱或前列腺等。据文献报道，大约有40%的肺类癌病例villin阳性，在其他一些神经内分泌肿瘤上，如甲状腺髓样癌和多数的美克尔细胞瘤上也有villin的表达。
MRP1多药耐药相关蛋白1，影响化疗敏理性，和预后相关。
MDR 多药耐药基因
TS胸苷分解酶，是5-FU重要作用靶点，假如其高表达，阳性反映++以上，提示肿瘤细胞对5FU耐药。
Syn 突触素神经组织标志
S-100神经组织标志，存在于神经组织，垂体、颈动脉体，肾上腺髓质、唾液腺、多数间叶组织，常用于神经鞘瘤、恶黑、脂肪肉瘤、软骨肿瘤诊断。
NSE主要用于神经内分泌肿瘤诊断
Chr,嗜铬素，肾上腺髓质含量很高，鉴别肾上腺髓质和皮质，用于神经内分泌肿瘤诊断。CKH 高分子角蛋白，主要标志鳞状细胞肿瘤
CKL 低分之角蛋白，主要标志单层上皮、腺上皮
EMA 上皮膜抗原，糖蛋白，普遍散布各种上皮及其肿瘤
Vim 波形蛋白，间叶组织标志
P504 甲酰基辅酶A消旋酶检测诊断前列腺癌的敏理性为97％，特异性为100％。
AMACR的优点在于它是癌症特异性，只存在于癌症组织。Rubin称，AMACR亦可用作其他癌症的诊断标志物。对各种癌症细胞停止反省后发现，结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤都过度表达AMACR，以结肠直肠癌和前列腺癌表达最高。
CD117 胃肠间质瘤
CD10作为共同急性淋巴母细胞型白血病抗原，次要表达于未成熟淋巴细胞，在Burkitt淋巴癌，慢性髓性白血病等造血零碎疾病的诊断中具有使用价值。近几年来发现该抗原在造血零碎外的某些肿瘤中有表达，如子宫内膜间质肉瘤、恶性黑色素瘤等。抗体在对肾细胞癌停止诊断和鉴别时有一定的参考价值。
CD15是一种细胞粘附分子，因其对霍奇金淋巴瘤(HD）中的R-S细胞具有良好的标志作用，被以为是HD的重要标志物。除HD的鉴别诊断外，对胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤CD15的表达研讨发现，CD15表达随癌细胞分化水平下降、淋巴结转移和临床分期增高而分明增高。以为CDl5的表达是判别肿瘤的开展、预测淋巴结转移和预后的良好目标。免疫电镜察看显示，CD15抗原次要散布于大肠癌细胞浆的界膜、内质网、高尔基体及近细胞核膜
处，CD15能够是经过对所结合的铺基构型改动影响和参与肿瘤的构成和转移进程。
SMA 平滑肌肌动蛋白，标志平滑肌
CD56为神经细胞黏附分子，次要散布于大少数神经外胚层来源细胞，常用于星型细胞瘤、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤诊断，也是NK细胞瘤的重要标志，也标志小细胞肺癌
Des 结蛋白，普遍散布于平滑肌、心肌、骨骼肌细胞和肌上皮细胞，高分化高表达、低分化低表达。
MSA 肌特异性肌动蛋白，普遍散布于简直一切肌型细胞中
CD68 存在于骨髓和各神经组织的巨噬细胞用于粒细胞白血病、各种单核细胞来源肿瘤、包括恶性纤维组织细胞瘤诊断（首选）。
CD34表达于晚期淋巴造血干细胞、祖细胞、内皮细胞、胚胎纤维母细胞和某些神经组织细胞，多用于标志血管内皮细胞，血管源性肿瘤的诊断，GIST80-90%.CD31也标志血管内皮。
CD44是一种散布普遍的跨膜糖蛋白分子，分CD44s和CD44v两大类。CD44s次要作为通明质酸受体，结合通明质酸后影响肿瘤的生长和转移。而CD44v则次要表达于转
移的肿瘤细胞。李道明等用免疫组化LSAB法检测了42例食管鳞癌CD44v4／5的表达，后果发现，淋巴结转移组的阳性表达率为76．19％(16／21)，而非转移组的阳性率为42．86％(9／12)，两组间有明显性差别。癌巢周边的癌细胞、肌间浸润的癌细胞、有核分裂的癌细胞和癌栓中的癌细胞及浸润脉管壁的癌细胞均呈强阳性表达。张成武等检测了20例正常胃粘膜上皮、43例异型增生和85例胃癌组织CD44v6的表达，后果正常胃粘膜无表达，而异型增生和胃癌组织阳性率辨别为30．2％和74．1％，其表达强度与胃癌浸润深度、淋巴结转移、肿瘤生长方式、静脉和淋巴管侵袭及远处转移亲密相关。以上后果均标明，CD44v的高表达构成了肿瘤细胞的侵袭性与易转移性。
NESTIN,神经干细胞中极为丰厚
Ost 成骨素，为骨化细胞分泌。
AAT 抗胰蛋白酶纤维组织细胞来源肿瘤 ACT抗糜蛋白酶
GFAP 胶质纤维酸性蛋白神经组织标志，多用于星形胶质瘤诊断
Tg 甲状腺球蛋白，甲状腺癌TG阳性。
CT 降钙素甲状腺髓样癌阳性。
PH 甲状旁腺素甲状旁腺肿瘤阳性
N-myc表达加强的小细胞肺癌和神经母细胞瘤对化疗缺乏反响并停顿疾速；
bcl-2：耐药机理为抗凋亡作用，高表达者对少数抗癌药物/放射医治耐受。
肿瘤相关抗原72 (TGA72)多种恶性上皮性肿瘤表达TGA72，尤其是乳腺癌、卵巢癌和结肠癌。正常上皮细胞、肉瘤、淋巴造血零碎肿瘤通常TGA72阴性。TGA72抗体用于乳腺癌的研讨较多，其高表达通常与肿瘤体积大、淋巴结转移瘤细胞分化差及高增殖活性有关。
肿瘤相关抗原(GA733)编码上皮糖蛋白40，是一种上皮细胞黏附分子(EP-CAM)，对上皮细胞的生长与分化起着重要作用。多种肿瘤可有GA733表达，尤其是乳腺癌、结肠癌及肺癌等。Kubuschok等采用GA733对非小细胞肺癌手术切除淋巴结中藏匿性微转移灶停止检测，发现藏匿灶的检出是判别总生活率的独立预后因子。结肠癌GA733表达方式与肿瘤预后有关，细胞膜及细胞浆的表达预后较基膜侧的表达为差。
TTF-1甲状腺转录因子-1，TTF-1表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。在肺肿瘤研讨中发现，大少数肺的小细胞癌、原发性和转移性肺腺癌、少局部大细胞未分化肺癌、大少数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化后果显示TTF-1阳性，而肺鳞癌及绝大少数典型类癌TTF-1阴性。在甲状腺乳头状腺癌中TTF-1亦阳性，而TTF在其它组织表达阴性。据此以为TTF-1可用来鉴别肺腺癌与鳞癌，并有助于与肺转移性腺癌的鉴别。
TTF-1在甲状腺及其肿瘤中的表达
TTF-1次要表达在甲状腺滤泡细胞中和甲状旁腺的主细胞中，
TTF-1为甲状腺分化和甲状腺球蛋白分泌调理的根底物质，可促进甲状腺过氧化物酶、碘/钠的转运，?TTF-1与血清TSH的活性有关，活性的TSH-R可加强TTF-1的表达。
TTF-1在良恶性甲状腺组织中表达不同，正常甲状腺和良性腺瘤表达多，甲状腺乳头状癌与滤泡癌中表达少，未分化癌中不表达，TTF-1在恶性甲状腺病变中的表达强度随年龄添加而加强，而且病变存瘤期长，复发机率高。
TTF-1在肺癌中的表达
75%的肺非小细胞癌（NSCLCs)阳性表达，腺癌(ACs)分明高于鳞癌(SCC)，90%以上的原发性小细胞肺癌(SCLC)表达阳性，TTF-1在非小细胞肺癌（NSCLCs)阳性表达强度与病人的预后成呈负相关，可作为一项独立的预后目标，
肺的典型性类癌(TCS)均为阴性，标明小细胞肺癌和非小细胞肺癌能够有一个不同于TCS的共同来源的实际。
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良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色
文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分 文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话： 是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是 项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。 如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。 1.对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。 2.定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
动物病理组织免疫组化制片操作规程 1、取材选材部位以病灶与正常组织交界处的组织标本为好，取材要完整，要尽可能注意到整个器官的结构特点。大小一般是1cm×1 cm×0.5 cm为宜。 在夹取组织时不要用力压、挤、揉等以免损坏组织。 2、固定以10%中性福尔马林固定液（固定液的量应为组织块的10-20倍）固定时间24-36小时。组织长时间固定，固定液中的福尔马林含有的杂质会产生一种酸，影响核的染色，整个组织显得非常陈旧。 3、全自动脱水机：包括脱水、透明、浸蜡等步骤 3.1、脱水组织经固定后，内含大量水分，须除尽水分才利于透明、浸蜡。常用酒精为脱水剂，逐级提高酒精浓度，以防组织过度收缩、变脆或脱水不完全而影响制片效果。脱水一般在室温下进行，由60%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精I、100%酒精II组成。组织块在酒精中时间不宜过长，否则组织块容易变硬。 如切片后的蜡块中央呈灰白粗糙而不透亮，放置一段时间后蜡块中央出现一陷窝，此即表明组织脱水不够彻底，组织面暴露后水分蒸发，蜡块中央收缩形成陷窝，严重时难以切出完整切片。注意定时更换新的脱水剂，一般在使用到1500个脱水盒(含组织块)后即可考虑更换脱水液。 3.2、透明在室温下，组织块采用二甲苯或TO透明剂中进行透明。一般透明剂分为I、II两个试剂缸。组织在二甲苯或TO透明剂中贮留时间必须严格掌握，时间稍长，则组织脆硬易碎；时间过短，石蜡不易渗透进去，使浸蜡不完全。3.3、浸蜡恒温杯内温度应调至58-60℃为宜，使石蜡熔化完全。石蜡分为I、II两个缸。尽量控制组织块在石蜡中的浸泡时间，时间过长组织易碎；时间过短，石蜡未渗透进去，组织不能切片。
教你如何看懂花了好几千的免疫组化报告单 免疫组化是用标记的特异性抗原（抗体）对组织内抗体（抗原）的分布进行检测。免疫组化虽然价钱昂贵，却有不能替代的作用： ①恶性肿瘤的诊断和鉴别②确定转移性恶性肿瘤的原发部位③对某类肿瘤进行病理分型④明确软组织肿瘤的正确组织学分类，明确软组织的诊断⑤发现微小转移灶⑥为临床治疗方案提供支持虽然免疫组化有那么多作用，但是很多患友拿到手了根本就看不懂，都是些英文缩写，代表着什么意思呀，别着急，下面小编就按照字母顺序列张表，告诉大家各个代表什么意思： 项目临床意义Actin肌动蛋白，间叶组织来源标记，平滑肌、血管内皮、肌上皮组织表达。AE1/AE3细胞角蛋白 AE1/AE3，标记上皮及上皮来源的肿瘤，鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性，如胆管细胞阳性，肝细胞阴性，鉴别肝癌和胆管癌。AFP甲胎蛋白，肝癌细胞表达，胃和肝脏同时肿瘤时，胃肝样腺癌HepPar-1、AFP、CK19 和CDX-2等4 种不同程度阳性表达，而肝细胞癌CK19 和CDX-2不表达。ALK间变型淋巴瘤激酶，用于淋巴造血来源标记，间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和炎症性肌纤维母细胞瘤的诊断。AMACR甲基酰基辅酶A消旋酶，癌特异
性指标，只存在于癌症组织。结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤等过度表达，以结直肠癌和前列腺癌表达最高。Bax促进凋亡蛋白，同Fas/FasL。Bcl-2抑制细胞凋亡相关基因-2，肿瘤预后指标，高表达者对多数抗癌药物、放射治疗耐受，高表达者预后差。Bcl-6B淋巴细胞凋亡相关基因-6，抑制细胞凋亡作用，淋巴造血细胞来源标记，用于B淋巴瘤诊断。Bel-XL抑制细胞凋亡相关基因-XL，Bcl-2 抑制细胞凋亡基因家族成员之一，作用同Bcl-2 。Cam5.2人角蛋白抗原决定簇，正常分泌上皮表达，复层鳞状上皮不表达，用于鉴别腺癌和鳞癌。CD10分化簇10，间叶组织来源标记，未成熟淋巴细胞阳性表达，用于B细胞淋巴瘤、慢性髓性白血病等诊断，某些非造血肿瘤子宫内膜间质肉瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌也可阳性。CD117分化簇117，间叶组织来源标记，胃肠间质瘤细胞阳性表达，阳性者可用格列卫靶向治疗。某些肿瘤如黑色瘤、白血病、皮肤纤维瘤、血管肉瘤、尤文氏瘤、胶质瘤也可阳性。CD14脂多糖LPS受体，单核细胞、巨噬细胞等细胞表面分化抗原,用于单核细胞和组织细胞相关病的鉴别诊断。CD15半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原标记，成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等阳性表达。用于霍奇金淋巴瘤、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体的保存： 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。 组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。 一、动物的致死法及取材 (一)致死法 (1)空气栓塞法向动物静脉注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。 (2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。 (3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。 (4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。 (5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。 (二)取材注意事项 (1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。 (2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。 二、尸体解剖的取材 尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。 (1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。 (2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。 (3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。 (3)脾一块。 (4)胰一块。 (6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长 (7)膀胱一块。 (8)肾上腺左、右各取一块。 (9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。 (10)骨脊椎骨一块。 (11)胸腺一块。 (12)子宫宫颈和宫体数块。 (13)睾丸或卵巢各一块。 (14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。 (15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。 如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。 三、活检标本的取材 (一)常规活检标本的取材 应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了
过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用 生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。 在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧 化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行 显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相 似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤， 同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免 疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1. 标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位， 可避免单克隆抗体图2. SP 法原理示意图
免疫组化常见问题与回答集锦 一、石蜡切片和冰冻切片的比较？ 1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在 -80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到 4 μm 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 二、一抗的选择要点和技巧是什么？ 1.单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 2.应用范围的选择。有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 3.种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。 4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。 5.生产厂家的选择。如 santa Cruz 公司抗体一般 1 ml，价格 2100 元左右； 而 chemicon 公司一抗一般 100 μl，价格 2800 元左右。这两个厂家的同一种抗体，它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做 WB 效果还可以。
免疫组化操作步骤 一免疫组化（ LP 法）操作步骤： 1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 2. 缓冲液洗 3min/2 次。 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。 4. 缓冲液洗 5min/2 次。 5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。 （注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 6. 缓冲液洗 5min/2 次。 7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定） 8. 缓冲液洗 5min/2 次。 9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。 10 ．缓冲液洗 5min/2 次。 11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。 （注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。） 12 ．缓冲液洗 5min/2 次。 13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。） 14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。 二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤： （ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。 （ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 ℃孵育 1-2 小时或 4 ℃过夜。 （ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
免疫组化常见问题的处理 当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。 对照/标本无染色 ①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 ②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 ③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。 ④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 ⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。 ⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 ⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。 ⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 ⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。 弱阳性 如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑： ①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。 ②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。 ③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。 ④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。 ⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。 如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。 非特异性染色 ①是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。 2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。即抗原修复液 3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟； 10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥