重庆医科大学
本科生毕业论文
论文题目Cobas4800和Linner array 检测HPV 的方法学比较作者姓名陈奎
论文答辩年月2015年6月
2015年6月
指导教师姓名（职称、单位名称）郭晓磊
主管广州金域
目录
中文摘要 (3)
英文摘要 (3)
论文正文：（实验） (4)
前言 (4)
1研究对象及标本采集 (4)
1.1研究对象 (4)
1.2样本采集 (4)
2实验材料级实验步骤 (5)
2.1罗氏cobas4800检测材料 (5)
2.2罗氏cobas4800实验步骤 (5)
2.3Linear array杂交实验材料 (6)
2.4Linear array杂交实验材料 (6)
2.5检测范围 (6)
3结果 (7)
4讨论 (8)
参考文献 (9)
致谢 (11)
Cobas4800和linear array检测HPV的方法学比较
摘要
目的对PreservCyt保存液收集样本进行cobasHPV检测和linear array方法检测，探究两种方法的符合率方法对样本基于cobas4800进行荧光探针定性型别分析和基于linear array探针捕获信号扩大原理进行样本分型结果101人中检测结果表明，在101例样本中，结果一致的样本为98例，结果不一致的为3例。在不一致的例样本中，除1例样本Cobas4800HPV试剂检测结果为阴性，而Linear Array HPV分型试剂检测结果为阳性，该样本出现不一致的原因暂时无法评估；其余例出现不一致的原因为样本中某个HPV型别的病毒含量较低引起（Ct>35.0）。讨论综上所述，Linear Array HPV分型试剂与Cobas 4800HPV试剂的结果符合性为97.03%，两种方法具有较好的符合率。
关键词：cobasHPV检测linear array符合率
Cobas4800and linear array Detection of HPV
methodology comparison
ABSTRACT
Objective:For Thinprep samples,Cobas4800and linear array detection methods to detect explore the coincidence rate of two methods Methods:Type fluorescent probe was carried out on the samples based on cobas4800and based on the linear array probe capture and signal expanding principle to classify samples Results:in101cases of samples,the results consistent with the sample of98cases,inconsistent results for 3cases.Samples are inconsistent in3cases,except for1case sample Cobas4800HPV reagent test results were negative,and the Linear Array HPV types reagent test result is positive and inconsistent reasons temporarily is unable to evaluation,The rest cases appear inconsistent reasons are some HPV types virus content in the sample is low （Ct>35.0）.To sum up,the coincidence rate of the Linear Array of HPV type reagent and Cobas4800HPV reagent is97.03%.
key word：Cobas4800detection linear array coincidence rate
前言
宫颈病变是女性最常见的疾患之一，宫颈癌是最严重的宫颈病变，在妇女癌瘤中的发生率仅次于乳腺癌，位居第二。在发达国家，由于宫颈癌前病变的早期诊断和治疗，其发生率已明显下降，在发展中国家，宫颈癌的发生率为发达国家6倍，并且其中80%的患者确诊时已是浸润癌。世界范围内统计（2000年）每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例
其中80％的病例发生在发展中国家，50％的病例发生在亚洲，中国每年有新发病例15万左右。8万人死于子宫颈癌。而现在普遍认识HPV感染，尤其是高危型别持续感染是宫颈癌发病的重要依据。人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）是一种感染皮肤和粘膜鳞状上皮细胞的小DNA病毒，病毒外层为衣壳蛋白组成的外壳，内部包裹着病毒核酸。HPV大家族，超过100个亚型，与宫颈癌相关的约30多种。
根据与宫颈癌相关性的高低进行分类。可分为低危型与高危型。
低危型：6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、cp6108等
高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68型等其中HPV感染途1性接触传播2直接皮肤接触3母婴传播
现在针对宫颈癌的临床检测主要有液基细胞学检测TCT对宫颈细胞做出描述性的TBS报告及进一步的阴道镜检查，HPV DNA的检测有美国FDA批准的HC2免疫信号放大法，Cervista酶切信号检测法，以及流式荧光探针检测法，因此为了检测高危型别各个亚型，本文用了两种检测检测HPV DNA的罗氏诊断方法即cobas4800HPV和linear array方法来检测101例Thinprep样本，并对两种方法进行符合率探究。
1、研究对象及样本采集
1.1研究对象：广州金域基因实验室收集的101例兴安县疾病预防控制中心样本。
1.2样本采集
1.2.1采样耗材：扫帚状取样器和PreservCyt保存瓶（新柏式）。
采样：先用阴道窥器保证宫颈完全暴露，擦净白带，使视野清晰。再将扫帚状取样器的中央刷毛伸入宫颈管内，周边刷毛到达子宫颈，同向旋转5-10圈。注意：手法宜轻柔，避免来回旋转。
漂洗：在PreservCyt保存瓶内漂洗扫帚状取样器。上下反复地将扫帚状取样器推入瓶底，迫使刷毛全部分散开来，共10次；最后，在溶液中快速地转动扫帚状取样器以进一步的将细胞标本保存下来，丢弃取样器。
存放：拧紧瓶盖，直到瓶盖与瓶体突出圆环密合。
1.2.2样本拒收的标准
样品管破损或管盖敞开，怀疑污染的样本拒收。溶血样本拒收。
1.2.3样本的稳定性（Specimen Stability）
1.2.4PreservCyt保存瓶样本必须保存在2-30℃的环境中，从收集之日开始保存6个月的时间。
1.2.5TBS报告：对上述采集样本进行超博液基细胞学检测（TCT),对所得到的TBS结果进行分类，即：宫颈炎症，CIN1，CIN2，CIN3，宫颈癌四大类。
2、实验材料及实验步骤
2.1罗氏cobas4800检测材料
2.1.1人乳头状瘤病毒（HPV）样本处理试剂盒240次测试
(cobas4800System Liquid Cytology Preparation Kit240T)
cobas4800系统蛋白酶K）10*0.9ml
SDS（cobas4800系统十二烷基硫酸钠试剂）10*3ml
LYS（cobas4800系统裂解缓冲液）
2.1.2人乳头状瘤病毒（HPV）样本提取试剂盒240次测试
(cobas4800System Sample Preparation Kit240T)
MGP（cobas4800系统磁性玻璃颗粒）10*4.5ml
EB（cobas4800系统洗脱缓冲液）
2.1.3人乳头状瘤病毒（HPV）检测试剂盒（PCR-荧光法）240次测试
(cobas4800HPV Amplification/Detection Kit240T)
HPV MMX（cobas4800HPV主要混合物）10*0.5ml
HPV Mg/Mn（cobas4800Mg/Mn溶质）
2.2罗氏cobas4800检测步骤
罗氏cobas4800对分类样本进行罗氏cobas4800上机，自动对样本提取、扩增、信号检测,Cobas4800HPV测试是以两个主要的过程为基础：（1）为了提取细胞的HPV的DNA自动化的样本制备；（2）运用HPV和β-球蛋白特异性的引物以及分别荧光标记的HPV和β-球蛋白特异性的寡聚核苷酸检测探针，实时PCR技
术检测靶点DNA序列。Cobas4800HPV测试中对β-球蛋白的共同提取、扩增和检测监视了整个测试过程。
2.3Linear array杂交实验材料
试剂名称(Name of the reagent):
Amplilute liquid media extraction kit（提取）
Linear array HPV genotyping test（扩增）
Linear array HPV detection kit（杂交）
2.4Linear array杂交实验步骤
检测方法(Method)：Linear probe hybridization（线性探针杂交技术）,以下操作在严格无菌且在熟练人员下操作完成。
提取：向250ul样本提取试剂依次加入ATL、PK、AL、无水乙醇、AW2、无水乙醇且用吸痰器吸走废液后加入AVE液进行洗脱出DNA。
扩增：向样本中加入HPVMMX扩增试剂，设置好扩增程序反应结束后加入DN 试剂进行变形，在此过程中试剂中有亲和素标记到变性DNA中。
杂交：配置好Working Hybridization Buffer加入到LINEAR ARRAY HPV Genotyping Strips再加入样本进行杂交、Working Ambient Wash Buffer、Working Stringent Wash Buffer反复洗脱及加入Working Conjugate进行酶标再用Working Ambient Wash Buffer反复洗脱最后加入Working Substrate
检测：加入底物进行定性检测
2.5检测范围
检测试剂HPV型别检测范围
Roche cobas4800Kit16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68
Roche Linear Array Kit 6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84、cp6108、IS39
3、实验结果
3.1cobas4800的检测结果检测在cobas4800检测HPV过程中84例中总HPV DNA的阳性率51.49%，其中NILM组中HPV DNA阳性数41例，阳性率46.59%;6例ASCUS组中HPV DNA阳性数5例，阳性率83.33%；7例LISL组中HPV DNA阳性数6例，阳性率85.71%。数据如下所示
cobas4800检测各型别阳性数及阳性率
TBS型别型别例数16型别18型别12种其他型别HPV阳性
NILM88533641（46.59%）ASCUS60145（83.33%）
LSIL71066（85.71%）
合计101644652（51.49%)
3.2linear array的检测结果在linear array检测HPV过程中84例总HPV DNA阳性率55.45%84例NILM组中阳性数44例，阳性率50%；在6例ASCUS 组别中阳性数5例阳性率83.33%；在7例LISL中7例阳性数，阳性率100%。数据如下所示：
Linear array检测各型别阳性数及阳性率
TBS型别型别例数16型别18型别12种其他型别HPV阳性
NILM88633741(46.59%) ASCUS60145(83.33%) LSIL71077(100.00%)
合计101744853(52.48%）
3.3linear array范围内的检测结果linear array的检测范围更为广泛，因
此决定了总阳性率的不同，在101例中，linear array实验总的符合率是56例，增加的三例是61、62、5462，型别。且都存在NILM组中。
Linear array检测范围内NILM型别的阳性率
TBS型别型别例数16型别18型别其他型别HPV阳性
NILM88634044(50.00%)
3.4符合率在对101例标本检测中且按照cobas4800检测范围来判定，两种
方法对样本检测的HPV阳性率阳性率不同也存在相同，他们在某个TBS型别中的阳性率表现不同存在灵敏度等差异导致不符合，也有可能在各个亚型特异性不同，但也导致了相同HPV的阳性率，所以对各型别的符合率的对比。
两种方法检测各型别的的符合率
TBS型别例数cobas4800和linear array符合数符合率
NILM888697.73%
ASCUS66100.00%
LSIL7685.71%
合计1019897.03%
4、讨论
人乳头状瘤病毒（HPV）检测试剂盒（PCR荧光法）cobas4800HPV Amplification/Detection Kit用于体外定性检测患者宫颈细胞样本中的人乳头状瘤病毒。这项检测通过多聚酶链反应（PCR）和核酸杂交技术扩增靶点DNA，可在一个单独的测试中检测14种高危型HPV。这项检测可以特异性的鉴别HPV16和HPV18亚型，同时在临床相关感染水平上检测其他的高危亚型（31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68b）
，对于30岁及以上的女性，cobas4800HPV Test可被用于评估是否存在HPV16和18两个基因型。这个信息，联合大夫对细胞学病史的评估，其他危险因子以及专业的指导方针可被用于指导患者的治疗。同时cobas4800HPV Test用于ASC-US子宫颈细胞学结果，用于评估是否存在HPV16和18两个基因型。这个信息，联合大夫对细胞学病史的评估，其他危险因子以及专业的指导方针可被用于指导患者的治疗。通过对HPV-16和(或)HPV-18进行检测和基因分型(联合或不联合应用液基细胞学检测)是一种经济有效且安全的筛查方法。由于cobas HPV检测法除了可用于检测HPV-16和HPV-18之外，还可同时检测其他致癌HPV基因型，因此与细胞学检测法相比能更有效率地分拣出需接受阴道镜检查的HPV阳性女性。此外，对无HPV-16或HPV-18基因型的HPV 阳性女性患者进行细胞学检测且只有在检出LSIL或HSIL或更严重病变的情况下才建议其进行阴道镜检查的策略，可将检出≥3级CIN的敏感性提高至超过HPV-16和HPV-18检测所能达到的水平，而且阳性预测值也较高。然而，未来尚需开展进一步研究，通过比较性能和成本效益来明确最佳的策略。本次验证使用Linear Array HPV分型试剂对101例Cobas HPV检测后的TCT样本进行检测。检测结果表明，在101例样本中，结果一致的样本为98例，结果不一致的为3例。在不一致的3例样本中，除1例样本Cobas4800HPV试剂检测结果为阴性，而Linear Array HPV分型试剂检测结果为阳性，该样本出现不一致的原因暂时无法评估；其余2例出现不一致的原因初步解释为样本中某个HPV 型别的病毒含量较低引起（Ct>35.0）。综上所述，Linear Array HPV分型试剂与Cobas4800HPV试剂的结果符合性为97.03%（98/101）在各个型别中的符合率，在NILM型别中两种的符合率是97.73%(86/88),在ASCUS中符合率100%（6/6）在LSIL型别中符合率是85.71%（6/7）。对此实验结果，符合率还是比较高，事后对于不符合的标本重新进行cobas实时荧光实验实验和linear array 杂交信号放大，结果发现原本HPV-16亚型阴性变成了阳性，符合了前次linear array HPV-16阳性的结果，其次linear array的检测范围更为广泛，因此决定了总阳性率的不同，在101例中，linear array实验总的符合率是56例，增加的三例是61、62、5462，型别。且都存在NILM组别中。在临床检测HPV过程中，罗氏荧光PCR显示出了较好的HPV各型别的检测,适合临床大规模的应用，适合临床上配合细胞学报告联合亚型分析，指导HPV感染的诊断及预后治疗方案的评估，在个别标本中，对于不明显的甚至宫颈轻微炎症检测无法检测，而监测范围更广的罗氏线性杂交法显示出较高阳性率，并且有很好的符合率。通过相关研究文献得知，线性杂交更利于确证，但手工操作繁琐，人员要求高，没有荧光PCR全封闭操作减少相关干扰等局限，至于方法应用如何选择，由于本次测试实验标本数量较少，不能更好的得到更多有效的资料信息，再者需考虑到科室的人员配置，硬件要求以及社会检测成本等综合因素。因此对于此方法的探究，还得等待以后大量实验认证。
5、参考文献
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致谢
本人的学位论文是在我的导师郭老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到项目的最终完成，郭老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在此谨向郭老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。
在此，我还要感谢在一起愉快的度过大学生活的每个可爱的同学们和尊敬的老师们，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。
在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!谢谢你们!我的母校重庆医科大学，在母校四年学到了很多也收获了很多，这里的人文环境和一草一木都将给予我走向成功的力量，谢谢母校给予我人生最美好的时光和留下最美好的回忆。