2020版药典
抗生素微生物检定法
本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备
枯草芽泡杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽抱杆菌〔CMCC（B）63 501〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus）悬液取短小芽砲杆菌〔CMCC（B）63 202〕的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Szaphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或〔ATCC29 213〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌〔CMCC（B）28 001〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液取啤酒酵母菌〔ATCC 9763〕的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于IV号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）悬液取肺炎克雷伯菌〔CMCC（B）46 117〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。
支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）悬液取支气管炎博德特菌〔CMCC（B）58 403〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32～35℃培养24小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。
标准品溶液的制备标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
供试品溶液的制备精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。
双碟的制备取直径约90mm，高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（表1）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量(能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm)，摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管(内径为
6.0mm±0.1mm，高为10.0mm±0.1mm，外径为
7.8mm±0.1mm)4个(二剂量法)或6个(三剂量法)，用陶瓦圆盖覆盖备用。
检定法
二剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2∶1或4∶1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径(或面积)，照生物检定统计法(通则1431)中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。
三剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度(S3)、中浓度(S2)及低浓度(S1)的标准品溶液，其余3个小管中分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为1∶0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径(或面积)，照生物检定统计法(通则1431)中的(3.3)法进行可靠性测验及效价计算。
注：①两性霉素B双碟的制备，用菌层15ml代替两层。
②乙酰螺旋霉素，抗II检定培养基制备时，调节pH值使灭菌后为8.0～8.2。
③含3%氯化钠。
④加0.3%葡萄糖。
第二法浊度法
本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液制备
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液取金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26 003〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠埃希菌(Escherichia coli)悬液取大肠埃希菌〔CMCC(B)44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
白色念珠菌(Candida albicans)悬液取白色念珠菌〔CMCC(F)98 001〕的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10ml培养基Ⅸ中，置35～37℃培养8小时，再用培养基IX稀释至适宜浓度，备用。
标准品溶液的制备标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表3的规定进行稀释。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
供试品溶液的制备精密称(或量)取供试品适量，照各品种项下规定进行供试品溶液的配制。
含试验菌液体培养基的制备临用前，取规定的试验菌悬液适量（35～37℃培养3～4小时后测定的吸光度在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。
已接种试验菌的液体培养基应立即使用。
检定法
标准曲线法除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各品种项下规定的剂量-反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1∶1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1→3）0.5ml以终止微生物生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。
抗生素微生物检定法标准曲线法的计算及统计学检验
标准曲线法的计算及可靠性检验
1.标准曲线的计算
将标准品的各浓度lg值及相对应的吸光度列成表4。
按公式（1）和（2）分别计算标准曲线的直线回归系数（即斜率）b和截距a从而得到相应标准曲线的直线回归方程(3):
回归系数：
截距：
直线回归方程：Y=bX+a（3）
2.回归系数的显著性测验
判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。
假设H0：b=0，在假设H0成立的条件下，按公式（4）～（6）计算t值。
估计标准差：
（4）
回归系数标准误：
（5）
式中yi为标准品的实际吸光度；
Y为估计吸光度〔由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到〕；
?y为标准品实际吸光度的均值；
xi为抗生素标准品实际浓度lg值;
?x为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。
对于相应自由度（2n-4）给定的显著性水平a（通常a =0.05），查表得ta∕2(n-2)，若|t|＞ta∕2(n-2)，则拒绝H0，认为回归效果显著，即Χ、Y具有直线回归关系；若|t|≤ta∕2(n-2)，则接受H0，认为回归效果不显著，即Χ、Y不具有直线回归关系。
3.测定结果的计算及可信限率估计
3.1 抗生素浓度lg值的计算当回归系数具有显著意义时，测得供试品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程（3），按方程（7）计算抗生素的浓度lg值。
抗生素的浓度lg值：
（7）
3.2 抗生素浓度（或数学转换值）可信限的计算按公式（4）和（8）计算得到的抗生素浓度lg值在95%置信水平（a=0.05）的可信限。
X0的可信限：
式中n为标准品的浓度数乘以平行测定数；
m为供试品的平行测定数；
X0为根据线性方程计算得到的抗生素的浓度lg值；
Y0为抗生素供试品吸光度的均值。
3.3 可信限率的计算按公式（9）计算得到的抗生素浓度（或数学转换值）的可信限率。
式中X0应以浓度为单位。
其可信限率除另有规定外，应不大于5%。
3.4 供试品含量的计算将计算得到的抗生素浓度（将lg值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。
二剂量法或三剂量法除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择适宜的高、（中、）低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，二剂量的剂距为2∶1或4∶1，三剂量的剂距为1∶0.8。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法和（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
培养基及其制备方法
培养基Ⅰ
胨5g 琼脂15～20g
牛肉浸出粉3g 水1000ml
磷酸氢二钾3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ
胨6g 葡萄糖1g
牛肉浸出粉 1.5g 琼脂15～20g
酵母浸出粉6g 水1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ
胨5g 磷酸氢二钾 3.68g
牛肉浸出粉 1.5g 磷酸二氢钾 1.32g
酵母浸出粉3g 葡萄糖1g
氯化钠 3.5g 水1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ
胨10g 葡萄糖10g
氯化钠10g 琼脂10g
枸椽酸钠10g 水1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH 值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基V
胨10g 琼脂20～30g
麦芽糖40g 水1000ml
除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅵ
胨8g 酵母浸出粉5g
牛肉浸出粉3g 磷酸二氢钾1g
氯化钠45g 琼脂15～20g
磷酸氢二钾 3.3g 水1000ml
葡萄糖 2.5g
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅶ
胨5g 枸椽酸钠10g
牛肉浸出粉3g 琼脂15～20g
磷酸氢二钾7g 水1000ml
磷酸二氢钾3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅷ
酵母浸出粉1g 琼脂15～20g
硫酸铵1g 磷酸盐缓冲液
葡萄糖5g (pH6.0) 1000ml
混合上述成分，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基IX
蛋白胨7.5g 氯化钠 5.0g
酵母膏 2.0g 葡萄糖10.0g
牛肉浸出粉 1.0g 水1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.5，在115℃灭菌30分钟。
营养肉汤培养基
胨10g 肉浸液?1000ml
氯化钠5g
取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值
使灭菌后为7.2±0.2，在115℃灭菌30分钟。
营养琼脂培养基
胨10g 琼脂15～20g
氯化钠5g 肉浸液?1000ml
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
改良马丁培养基
胨 5.0g 酵母浸出粉 2.0g
硫酸镁0.5g 琼脂15～20g
磷酸氢二钾l.0g 水1000ml
葡萄糖20.0g
除葡萄糖外，混合上述成分，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
多黏菌素B用培养基
蛋白胨 6.0g 酵母浸膏 3.0g
牛肉浸膏 1.5g 琼脂15～20g
胰消化酪素 4.0g 水1000ml
葡萄糖 1.0g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.7，在115℃灭菌30分钟。
培养基可以釆用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
灭菌缓冲液
磷酸盐缓冲液(pH5.6) 取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH6.0) 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH7.8) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pHl0.5) 取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钠溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
?肉浸液也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代替。
千里马招标网https://www.doczj.com/doc/f116985128.html, 政府采购谈判 文件 采购编号：SZWK-XC-T-号 采购项目：全自动微生物鉴定及药敏分析系统采购单位：苏州市相城区第三人民医院 项目类别：医疗设备 苏州市卫康招投标咨询服务有限公司 二〇一八年八月
谈判邀请函 ： 受苏州市相城区第三人民医院的委托，苏州市卫康招投标咨询服务有限公司对其所需采购的全自动微生物鉴定及药敏分析系统在国内组织竞争性谈判采购。欢迎符合采购文件资格要求的供应商前来报名参加谈判。 一、采购编号：SZWK-XC-T-号 二、采购内容及数量：全自动微生物鉴定及药敏分析系统一套 三、采购预算：.元整 四、参加谈判的供应商资格要求： A、供应商的一般资格要求 、具有独立承担民事责任的能力； 、具有良好的商业信誉和健全的财务会计制度； 、具有履行合同所必需的设备和专业技术能力； 、有依法缴纳税收和社会保障资金的良好记录； 、参加招标活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录； 、法律、行政法规规定的其他条件。 B、供应商的特殊资格要求 、具有医疗器械生产（经营）企业许可证； 、具有所投产品的合法代理资格。 五、参加谈判报名及领取谈判采购文件时间：自公告发布之日起至月日每日：～：，：～：（节假日除外）； 参加谈判报名及领取谈判采购文件地点：苏州市干将西路号号楼四楼苏州市卫康招投标咨询服务有限公司； 领取谈判文件时请提供以下材料并加盖公章（复印件需提供原件现场核查）： 、企业法人营业执照副本复印件（三证合一）； 、法人授权委托书（报名经办人必须为投标单位正式员工，提供社保缴纳证明及劳动合同等材料）； 、医疗器械生产（经营）企业许可证复印件； 、所投产品的合法代理资格证明材料。 六、谈判时间、地点： 、递交谈判响应文件的时间：年月日：~：（北京时间） 地点：苏州市相城区庆元路号相城区市民服务中心三楼会议室 、递交谈判响应文件的截止时间：年月日：：（北京时间）
发布日 20070423 期 栏目 化药药物评价>>化药质量控制 标题 抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析 作者 审评三部 部门 正文容 审评三部审评五室英 摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液 浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。 关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性； ②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组 成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。 一、方法的建立 1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方
法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。 2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择 可参照中国药典建立，在此不再赘述。 3、检定方法的确定 可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。 4、抗生素溶液的稳定性 选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条 件。 二、方法的验证 验证的目的是证明采用的方法适合于检测的要求。 验证容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、专属性、适用性和线性。 在申报资料中常见的错误有：线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理；精密度的测定方法不正确；无专属性试验。下面就方法验证的容与常见的错误加以简述。 1、专属性考察杂质、辅料等对测定结果准确性的影响，可通过以下试验验证： (1) 用辅料等替代抗生素进行试验，应不产生抑菌作用。 (2) 采用回收率试验进行验证，至少有9对以上数据，并进行显著性检验。
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
A B C D 高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与 快速微生物检测鉴定技术 3.快速鉴定技术 4.法规与药典要求 第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高 新版GMP 无菌药品附录 以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表： 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数静态 ≥0.5μm ≥5.0μm A 级(1) 352020B 级352029C 级3520002900D 级 3520000 29000 洁净级别 浮游菌cfu/m 3 沉降菌（φ90mm ）cfu /4小时 表面微生物 接触cfu /碟（φ55m m ） 5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025 － D 级 200 100 50－ 洁净区微生物监测的动态标准 工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程 水系统空调系统氮气压缩 空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌
动态环境监测带来的新课题 １、大量数据的管理和分析 ２、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题？ 是QC 的OOS ？３、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how 革兰氏染色无法判定 无菌药品生产要求的大幅度提高 未污染 ？ 无菌药品生产要求的大幅度提高 无菌药品附录： 产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖 于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。 微生物检测技术的飞跃发展 快速检测技术（不需进行培养PAT ）快速鉴定技术（属种株）为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染，追溯污染源 案例： 爱吃桔子的员工 一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间
全自动微生物鉴定/药敏系统VITEK 2 COMPACT 30 1、设备的主要用途、功能及特点 该系统为完整的全自动细菌鉴定和药敏分析系统,细菌鉴定采用生化反应数码鉴定原理。可以以最少的实验人员及最短的准备和处理时间，提供最准确的测定结果。数据库应涵盖革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、芽胞菌、酵母菌、奈瑟氏菌及嗜血杆菌、厌氧菌；必需有生物反恐菌的鉴定能力（鼠疫杆菌、霍乱弧菌、吐拉菌等） 2、技术参数及指标 ①系统组成：电脑主机为国际知名品牌原装PC；另有比浊仪、充填系统、读数 孵育系统、数据处理系统、废弃物收集系统、打印机等； ②检测原理：采用生化反应数码鉴定原理，结合终点法、阈值法、特别是动态 分析法的检测原理，24小时连续自动检测，并时时出报告； ③充填处理量：每批可同时填充10个试剂卡。 ④充填方式:：利用真空原理进行试剂卡的填充。 ⑤菌液用量：3ml。 ⑥试卡密封方式：自动热切割掉试剂卡上的菌液传送小管，进行密封。 ⑦鉴定速度：每15分钟对同一卡片进行1次光学检测。细菌5小时内鉴定率达95%， 一般3-5小时，酵母菌≤18小时，芽孢菌≤14小时。 ⑧鉴定准确率：90% 的试验将报告单一的鉴定结果。 ⑨鉴定范围：鉴定细菌种类齐全，含概革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、芽孢 菌、奈瑟氏菌嗜血菌弯曲菌、厌氧菌，要求≥550种菌。 ⑩药敏功能：平均药敏检测时间7小时，专家规则同时符合美国CLSI、德国DIN、法国AFNOR标准。 ?自动化程序：自动接种、全封闭实验板、自动培养及判读、打印结果、自动收集废弃物。 ?试卡设计：试卡上有64微孔，内含有鉴定或药敏所用的生化或抗生素干燥底物； 实验过程中除需要从厂家购买鉴定卡和药敏卡之外无其他专用附加试剂和耗材，可
第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划（1学时） 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术
一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至
微生物制药的研究进展 姓名：李青嵘 班级：生工102 学号：1014200044
摘要 本文通过对历史文献的检索，从微生物生产维生素，微生物生产多价不饱和脂肪酸，微生物生产抗生素，微生物生产抗癌物质，微生物生产医用酶制剂等五个方面综述了微生物制药的研究进展。 关键词：微生物，制药，发酵工程 1.前言 随着生物技术的迅猛发展，在医药领域的许多方面取得了巨大的进展.，其中采用微生物制药，具有生产工艺简单，生产成本低廉，产品产量高，产品纯度高，可大规模工业化生产等优势，同样得到了巨大的发展。从传统工艺，如利用发酵工程生产抗生素、酶制剂以及B-胡萝卜素等；到现今的利用转基因技术生产干扰素、胰岛素、生长因子等几十种新药和疫苗。本文着重综述了微生物的发酵工程在医药研究和生产中应用的最近进展，主要包括生产维生素、多价不饱和脂肪酸、抗生素、抗癌物质医用酶制剂等五个方面。 2.研究内容 2.1.微生物生产维生素 维生素是六大生命要素之一, 为整个生命活动所必需。β-胡萝卜素、VC、VE是目前应用最为广泛，效果最为显著的三种维生素，它们的作用分别是：β-胡萝卜素是强力抗氧化剂, 有抑制癌细胞增殖和提高机体免疫力等作用。V C 和V E 均是抗氧化剂, 前者可阻止、破坏自由基形成，还具有激活免疫系统细胞的活力，刺激机体产生干扰素以抵御外来侵染因子。至于VE可产生抗体，增强机体免疫力。目前，上述的“三素”以实现了微生物工业化生产。 目前，β-胡萝卜素主要是由三孢布拉霉菌生产，在1998年，陈涛等[1]已经针对三孢布拉霉菌的特点，优化发酵工艺，在3M3的发酵罐中发酵120h，生产的β-胡萝卜素产量已达到1146.5mg/L。虽然，传统的工艺生产β-胡萝卜素的产量高，生产周期比较短，但是传统的工艺复杂，成本过高，不利于大规模工业化生产。故,目前许多课题组专注于开发新的生产β-胡萝卜素的菌种或改进传统工艺。据近年所发表的期刊文献，目前，采用红酵母发酵生产β-胡萝卜素是一种工艺简单，成本低廉的方法，虽然在产量方面较传统方法的低很多，但是该方法仍具有很大的发展潜力。何海燕等[2]采用粘红酵母R3-35摇瓶发酵84h，生产的β-胡萝
设备名称：全自动微生物鉴定及药敏分析系统 一、具体用途：对食品，环境中的微生物进行快速，全自动的鉴定及药物敏感性测试。 二、技术参数与性能要求： 1. 系统可同时处理》30个标本，系统具有扩容功能，至少可以两台联机； 2. 分析组件可对环境中和食品中的细菌进行全自动鉴定，种类包括革兰阴性菌、革兰阳性 球菌、革兰氏阳性杆菌、酵母样真菌、假丝酵母类真菌、苛养菌、厌氧菌及棒状杆菌等的 鉴定； 3. ★分析组件可对芽孢杆菌进行全自动鉴定； 4. ★大于500种可鉴定细菌，鉴定结果通过美国FDA认证，细菌鉴定采用GB推荐生化鉴定 显色法，药敏检测采用比浊法，并且鉴定方法原理可在GB4789中查询（提供具体细菌库）； 5. ^分析组件可自动进行革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母样真菌、肺炎链球菌等药敏试验， 以上所有药敏试验均得到美国FDA批准用于临床应用（提供FDA证明资料）； 6. ★在对标本的鉴定及药敏试验过程中，无需添加任何额外附加试剂； 7. 快速全自动对细菌进行鉴定和药敏试验，采用实时检测系统，系统每隔15分钟对试剂卡 进行一次扫描读数，一旦确认结果，可马上出报告； & ★细菌最快鉴定时间V 4个小时，平均鉴定时间不超过5小时； 9?最快药敏实验时间5小时，平均药敏实验时间不大于6小时； 10. ★系统可同时进行鉴定和药敏实验，并且可同时上机的鉴定试剂卡种类不少于4种，可 同时上机的药敏试剂卡的种类不少于6种； 11. ★系统自动填充悬浮液至试剂卡，自动密封拭卡，并自动将拭卡装载于设备内置读数系 统/孵育系统，测试结束时可自动丢弃拭卡，操作都在仪器内部自动进行，不需要额外设 备； 12. 卡片填充菌液后为封闭式卡片，不会造成污染； 13. ★鉴定卡和药敏卡必须独立包装； 14. 鉴定卡应至少提供3种不同试剂的SFDA注册证； 15. 药敏卡应至少提供5种不同试剂的SFDA注册证； 16. 测试完成后，经分析软件分析后得出结果并可自动打印报告，并保存结果； 17. 具备中文报告软件系统； 18?双向联网软件，可传输报告结果；
抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点 录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博 抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。 此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。 管碟法的操作步骤： 1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。 2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。 3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。 4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。 5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。 6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层
（生物科技行业）微生物常 规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同壹种的细菌在壹定条件下，培养特征却有壹定稳定性。，以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性仍是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如
青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）俩大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法和简单染色涂片相同。 （2）晾干：和简单染色法相同。 （3）固定，和简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。
微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤： (1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以1
00的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（） (4)在每个菌群中，再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T 值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按大小排序，将相邻两项的之比为R， 代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果≥80，参考T及R值可作出鉴定。 2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。 (2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释
BD PHOENIX 100 型全自动微生物分析仪仪器标准操作规程 一、概况和工作原理 1、概况是快速全自动细菌鉴定/药敏系统，能对于临床大多数的革兰氏需氧和苛养厌氧菌；大多数革兰氏阴性的需氧和苛养厌氧菌能进行快速鉴定和药敏实验。它一次能同时做100份鉴定和药敏。 2、细菌鉴定原理BDPHOENIX100的鉴定部分由51个孔组成，采用传统生化、酶一底物生化呈色反应和BD专利的荧光增强法相结合的原理。由一系列改良的发酵，氧化，降解，水解等反应的产物与各类指示剂（酸碱指示剂、酶联指示剂、荧光指示剂）反应，最后被实时仪器检测。 3、药敏试验原理BDPHOENIX100的药敏试验部分由85孔组成，其中84孔包被有抗生素，1孔为生长对照。试验采用微量肉汤二倍稀释法，采用传统比浊法及BD专利呈色反应（指示剂随细菌生长过程中的氧化还原反应而变色的反应）结合的双重检测。 4、BDPHOENIX100的专家系统能对以下的耐药机制进行监测：产ESBL 的肠杆菌科、万古霉素耐药（VRE）的肠球菌、高度的氨基糖肽类抗生素耐药（HLAR）的肠球菌、甲氧西林耐药（MRS）的葡萄球菌、产?-内酰氨酶（BL）的葡萄球菌。 二、基本结构 1、菌液配置CrystalSpec比浊仪、鉴定管4.5ml（2～25oC）、药敏管8ml（2～25oC）、药敏指示剂（2～8oC、启封后14 天内保持稳定）、鉴定或鉴定加药敏板。 2、孵箱由计算机控制下的孵箱，孵育箱内置可旋转的直立圆柱体，一次可置100份标本鉴定和药敏。 3、工作站由标本扫描装置、标本基本信息输入的键盘、液晶屏幕、快捷键组成。 三、操作步骤 1. 加样 1.1 将鉴定和药敏板放在加样盘上。注：手持板条时，不要触及板条的正面；鉴定/药敏板启封后应在2小时内使用。 1.2 标注实验室编号。注：标记不要影响到ID/AST检测孔的判读；请勿使用带有荧光的标记笔。 1.3 将肉汤试管放在加样盘上；鉴定管放在左边；药敏管放在右边。 1.4 用鉴定管配制0.5麦氏单位菌悬液。注：配好的菌液必须在60分钟内加样完成；请勿使用金属接种环加样。
VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备，并获美国药品食品管理局（FDA）认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性，还具有操作简便、检测速度快的特点，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。现将该系统的工作原理、主要结构、功能并结合我们使用后的一些体会介绍如下。 1工作原理 VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔，可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液，经充填机将菌悬液注入试卡内，封口后放入读数器/恒温培养箱，根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。 2VITEK系统的结构组成 2.1检测卡 目前VITEK系统的检测卡有14种，微生物常用的有7种，即：革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰氏阴性菌卡（GNI+）、非发酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厌氧菌卡（ANI）、芽胞杆菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡（NHI），以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本，检测卡为一次性消耗品。 2.2充填机将待测菌的菌悬液注入试卡内。 2.3读数器/恒温箱可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。 2.4电脑主机/显示器/键盘/打印机用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定，实验结果的自动显示报告和打印。 2.5电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。 3VITEK系统的功能
Biolog微生物鉴定步骤 一检测原理 Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。 二所需器材和消耗品： 培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。 三鉴定步骤：
第一步： 在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。 对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。 如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非
常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。 如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。 微生物的扩大培养应该用Biolog推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。 微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。 如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。 第二步： 首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。 在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。 按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。 调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。 将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。 第三步： 将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免
抗生素微生物检定标准操作规程 1 简述 抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。中国药典也采用这两种方法。 抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混均后，经培养，测量培养基浊度。此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。 抗生素效价以“单位（u）”或“微克（μg）”表示。 抗生素管碟测定法 2 仪器与用具 2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级～10，000级）
及空调设备，控制室温在20～25℃之间，达到无菌或半无菌状态。操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内抗生素污染。 2.2 双碟内径约90mm，高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。 碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。 用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，至150℃～160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。 2.3 陶瓦盖内径约103mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。 2.4 钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。每次使用后应置1:1000新洁尔溶液内，浸泡2小时以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150℃～160℃干热灭菌2小时，备用。 2.5 钢管放置器有6孔和4孔两种。放置于无菌或半无菌室的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。双碟升降平稳。应保持清洁，防止抗生素污染。可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。置钢管的玻璃管应定期干烤灭菌。 2.6 恒温培养箱以隔水式为宜，温度平稳，波动小。设置漂移温度为35～37℃或24～26℃，依各品种要求而定，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调整水平。 2.7 灭菌刻度吸管用于吸取菌液及培养基。使用后应立即置5%石
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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
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全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2操作规程 1、目的 规范操作程序，正确使用仪器，保证检测工作顺利进行，更好地维护保养仪器。 2、适用范围 适用于全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2的使用操作。 3、程序 3.1开机： 1 先开稳压电源，然后开UPS、打印机、终端、读数器，最后开电脑。 2 等待屏幕出现，输入用户名及密码，双击VITEK 2-compact软件进入主菜单。 3 点击Enter图标，进入试卡编辑菜单。 4 点击试卡图标，选中BAR CORD。 5 扫描试卡；载卡架信息：可以用条码扫描器输入，也可自下拉菜单选择。 6 输入实验号和菌株号保存。 3.2测试标本 1 标本的稀释：选取经纯培养18～24小时后，大小为3mm左右的待测菌落2～3个，置于装有3 mL 0.45 %生理盐水的试管中进行稀释，用标准比浊计测菌液浓度（如浊度高加生理盐水，浊度低加菌落）。最后的菌液浓度必须达到测试卡所要求相应标准度。将试管放到样品架上。 2 卡片标记：从冰箱中取出测试卡，放置2～3分钟，使温度与室温相同。 3 卡片充样：将测试卡放在载卡架上，输样管浸入装有待测菌液的标准管中。将载卡架放入仪器的填充仓，按START FILL触点开关，约70秒左右，填充完毕。 4 填充完毕后，待蓝色指示灯闪烁，将载卡架取出，在十分钟之内取出并放入
装载仓。 5 仪器自动扫描条码，审核所有输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡。操作完成后，待蓝色指示灯闪烁时才能打开装载仓门取出卡架。 3.3关机程序： 1 先将读数器状态窗口关闭，待系统接受，退出主菜单。 2 按下仪器上功能键，选择Maintainance键。 3 点击Shutdown键，关仪器。 4 依次关闭仪器电源、UPS、稳压电源。 5关机次序：先关电脑，再其他附件。
全自动微生物快速检测质谱仪 一设备名称：微生物快速质谱鉴定仪 二主要技术规格及系统概述： 1. 微生物快速鉴定仪主要由质谱仪主机和微生物数据库、计算机工作站、软件等组成。主要用微生物快速鉴定和分型。 2．技术规格与要求： 2.1 分子量范围:1-500KDa 2.2．灵敏度：大于250 fmol BSA（m/z66,000），信噪比50：1 2.3．质量准确度：蛋白混合物：< 200 ppm 2.4．激光器： 2.4.1 气态激光器 *2.4.2最大频率≥50Hz，且激光频率在其范围内任意连续可调。 2.4.3．激光照射次数≥60,000,000 shots 2.5．离子源及清洗方式：独立的自动清洗离子源装置，可软件控制，方便日常维护，确保仪器长期稳定运行。 2.6．检测器：检测器具有长寿命、宽的动态范围、高分辨和高质量精度。 2.7．真空泵：采用无油真空泵，运行噪音低保证科室工作环境安静，后期免维护，节约成本。 2.8．离子源：离子源电离处为无网格设计，提高仪器检测灵敏度。离子源具备红外激光自动清洗功能，无需泄真空，方便日常维护，确保仪器长期稳定运行。 2.9．稳定性：校准标准品为蛋白质混合物且校正能保持24小时 2.10. 自诊断系统：提供自动化的自诊断程序。
2.11. 远程监控：提供安全的ISDN点对点连接，实现远程服务。 2.12．软件： 2.12.1 基于Windows操作系统的仪器控制、数据采集、数据处理及分析的全套最新软件。 2.12.2 常规细菌，酵母菌，分枝杆菌、丝状真菌鉴定分析软件。 2.12.3 需要包含IVD和科研操作软件，科研库与临床库采用相同的建库原理和算法，以便确保自建库的可靠性。 3. 微生物数据库 *3.1 微生物数据库含标准配置的细菌、酵母菌数据库，同时配置分枝杆菌、丝状真菌菌库科研库。 3.2 数据库含有大于5600种以上微生物菌株的信息。每一张MSP（数据库内数据）都是平均20-24的平行实验图谱所得统计结果，保持更新。 *3.3 数据库中包括了不少于380个属、总计≥1046个菌种的特征指纹图谱。3.4 允许用户轻松自建微生物数据库，完成数据库的扩充和自定义，且数据库可共享。 4.配置要求 4.1. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪/一套，台式机以节约科室空间 4.2．计算机工作站/一套，激光打印机/一台，UPS电源/一台。 *4.3．不少于3块可重复使用靶板，以便降低检测成本。 4.4．仪器控制软件； 4.5．其它所必需的附件、专用工具和消耗品 4.6. LIS对接联网。