高中生物蛋白质的提取和分离2019年3月21日
（考试总分：100 分考试时长： 120 分钟）
一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分）
1、（5分）红细胞含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是
A．血红蛋白的提取和分离一般按照“样品处理→粗提取→纯化→纯度鉴定→处理”
B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液
C．粗分离时透析的目的是去除相对分子质量较小的杂质
D．可经SDS﹣聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定
2、（5分）如表为某培养基的配方，有关叙述正确的是
B．能在此培养基上生长的是大肠杆菌
C．此培养基上生长的菌落不一定是黑紫色
D．此培养基可以用来检测自来水中细菌含量是否符合饮用水标准
3、（5分）根据以下腐乳制作的流程图，判断下列说法中错误的是
豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
A．毛霉为好氧菌，为避免其无氧呼吸，码放豆腐时要注意留出一定的缝隙
B．加盐腌制可以析出豆腐中的水分使之变硬，同时也能抑制微生物的生长
C．加卤汤、密封腌制过程中，毛霉不断增殖，并产生大量的酶，分解蛋白质
D．用胶条密封瓶口时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染
4、（5分）为了保证结果准确，一般选择菌落数在何种范围的平板进行计数
A．30～100 B．30～200
C．30～300 D．30～600
5、（5分）在制作泡菜时，乳酸菌产生的乳酸可以抑制异种微生物的生长，但乳酸积累到一定程度时，又会抑制乳酸菌自身的增殖．这些现象中包括
A．竞争和种内斗争 B．捕食、竞争
C．竞争和寄生 D．互利共生和竞争
6、（5分）下列有关生物技术实践的叙述，不正确的是
A．制果酒时瓶口先通气后密封，而制果醋时需要通入氧气
B．使用加酶洗衣粉时用温水洗涤效果比用冷水洗涤效果好
C．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法
D．制备单克隆抗体所涉及到的生物技术包括动物细胞融合、动物细胞培养和胚胎移植7、（5分）下列关于植物组织培养中植物激素使用的说法，不正确的是
A．植物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素
B．同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向
C．先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化
D．先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂和分化
8、（5分）高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
D．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
9、（5分）下表为某微生物培养基的配方，相关说法错误的是
B．该培养基属于固体培养，选择培养基
C．该培养基可以用来培养异养型微生物
D．该培养基除去（CH2O），加入纤维素粉即可用来培养纤维素分解菌
10、（5分）在果酒的制作过程中，下列说法正确的是
A．为避免污染，在处理葡萄时应先除去枝梗再冲洗
B．红葡萄酒中的红色是红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的
C．果酒制作所需要的酵母菌属于异养厌氧型微生物
D．果酒暴露在空气中容易产生酸味主要是因为产生了乳酸
11、（5分）细胞破碎后，各种蛋白质就会释放出来，再根据蛋白质的不同特性进行提取。下列关于蛋白质抽提的措施中，不正确的是
A．酸性蛋白质可用稀碱性溶液抽提
B．水溶性蛋白质可用透析液(中性缓冲液)抽提
C．脂溶性蛋白质可用有机溶剂抽提
D．碱性蛋白质可用强酸性溶液抽提
12、（5分）植物组织培养技术可以实现优良品种的快速繁殖，保持遗传性状的一致。下列叙述正确的是
A．菊花茎段组织培养中，需对外植体进行灭菌处理
B．菊花茎段组织培养中，必须添加植物激素
C．月季花药培养中，一般从略微开放的花中选择单核期花药
D．选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期
13、（5分）关于测定亚硝酸盐含量的试验，叙述错误的是
A．发生重氮化反应需在盐酸酸化条件下进行
B．提取剂配制好后需要用浓盐酸调节pH至1
C．用比色法可精确算出泡菜中亚硝酸盐的含量
D．振荡提取时加入NaOH是为了中和酸性物质
14、（5分）植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性因素。在植物组织培养过程中，如何使用这两种激素更有利于胚状体的形成
A．先使用生长素，后使用细胞分裂素
B．先使用细胞分裂素，后使用生长素
C．同时使用
D．都不使用
15、（5分）取9个洁净培养皿，均分为三组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），各组分别加入等量的不同培养基，每个平板均接种0.1mL大肠杆菌菌液，37℃培养36小时后，统计菌落数（见表），以下相关叙述错误的是
B．Ⅱ组和Ⅲ组说明大肠杆菌正常生长需要葡萄糖
C．三组实验均采用了稀释涂布平板法，以便菌落计数
D．三组实验所使用的培养基均需62℃、30min灭菌
16、（5分）下列实验中，需保持细胞生理活性的有
A．花生种子中脂肪的鉴定
B．观察洋葱鳞片叶内表皮细胞中DNA的分布
C．探究酵母菌的呼吸方式
D．红细胞中血红蛋白的提取和分离
17、（5分）下列关于花药离体培养，认识错误的是
A．对一般植物而言，单核期的花药培养成功率最高
B．培养形成的胚状体可继续在原培养基中分化形成植株
C．确定花药发育时期最常用的方法是醋酸洋红法
D．培养基的组成是影响花药培养的主要因素之一
18、（5分）红细胞中含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白．下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是
A．血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定”的顺序进行
B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液
C．样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白
D．可经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定19、（5分）在下列选项中，没有采用植物组织培养技术的一项是A．利用花药离体培养得到单倍体植株
B．利用基因工程培育抗棉铃虫的棉花植株
C．利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，得到多倍体植株D．利用细胞工程培育“番茄-马铃薯”杂种植株
20、（5分）下列关于植物组织培养中灭菌操作，错误的是A．外植体可以用酒精杀菌
B．镊子等器械需酒精灭菌
C．操作前手需酒精消毒
D．培养基需高压蒸汽灭菌
一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分）
1、（5分）【答案】B
【解析】血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理→粗提取→纯化→纯度鉴定→处理，A正确；纯化过程中要用缓冲液充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液，B错误；血红蛋白溶液的粗分离采用的方法是透析，即将凝集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，去掉分子量较小的杂质，C正确；通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后可经SDS﹣聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，D正确。
2、（5分）【答案】C
【解析】此培养基是鉴别培养基，另外此培养基中含有青霉素，还具有选择作用，因此也属于选择培养基，A错误；不是所有的大肠杆菌都能在此培养基上生长，只有能抗青霉素的大肠杆菌及其他抗青霉素的微生物才能在此培养基上生长，B错误；由B的分析可知，在此培养基生长的除了抗青霉素的大肠杆菌以外，还有抗青霉素的其他微生物，因此此培养基上生长的菌落不一定是黑紫色，C正确；由于此培养基中加入了青霉素，绝大多数细菌不能在此培养基上生长，因此此培养基不可以用来检测自来水中细菌含量是否符合饮用水标准，D错误。
3、（5分）【答案】C
【解析】毛霉为好氧菌，为避免其无氧呼吸，码放豆腐时要注意留出一定的缝隙，A正确；加盐腌制一方面可以析出豆腐中的水分使之变硬，同时也能抑制微生物的生长，B正确；加卤汤、密封腌制，具有防腐杀菌的作用，同时使腐乳具有一定的香味，在此条件下毛霉不能生长增殖，C错误；用胶条密封瓶口时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，以防止瓶口被杂菌污染，D正确。
4、（5分）【答案】C
【解析】当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30～300 内进行计数，C正确。
5、（5分）【答案】A
【解析】在制作泡菜时，乳酸菌产生的乳酸可以抑制异种微生物的生长，异种微生物和乳酸菌之间属于种间关系，为竞争关系；根据题干信息分析，乳酸积累到一定程度时，又会抑制乳酸菌自身的增殖，因此到了后期由于营养物质等资源的缺乏，导致种内发生斗争，故选A。
6、（5分）【答案】D
【解析】制果酒时菌种是酵母菌，瓶口先通气是为了菌种大量繁殖，后密封是为了产酒精；制果醋时菌种是醋酸菌，需要通入氧气保证其有氧呼吸，A正确；温度能影响酶的活性，使用加酶洗衣粉时用温水洗涤效果比用冷水洗涤效果好，B正确；凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，C正确；制备单克隆抗体所涉及到的生物技术包括动物细胞融合、动物细胞培养，不涉及胚胎移植，D 错误。
7、（5分）【答案】D
【解析】植物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素，被称为“激素杠杆”，A正确；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向，生长素用量比细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织的生长，B正确；先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化，C正确；先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化，D错误。
8、（5分）【答案】D
【解析】果酒制作过程缺氧、酸性环境使多数微生物不能生存，所以不进行严格的灭菌影响不大，A错误；腐乳制作时放入酒精、盐和香辛料等，具有杀菌作用，所以不进行严格灭菌影响不大，B错误；选择培养基是根据筛选的微生物代谢特点配置的，除待筛选的微生物外，其它杂菌不能生存，所以不进行严格灭菌影响不大，C错误；植物组织培养要求严格的无菌环境，如果灭菌不彻底，会造成细胞分裂分化缓慢甚至死亡，从而导致失败，D正确。
9、（5分）【答案】D
【解析】调节pH时可能污染培养基，则配制该培养基时，要先进行pH调整再灭菌，A正确；该培养基中加入琼脂，则属于固体培养基，青霉素可抑制细菌等原核生物的生长繁殖，属于选择培养基，B正确；该培养基中加入（CH2O）作为碳源，可用来培养异养型微生物，C正确；纤维素分解菌属于异养型微生物，则除去（CH2O），纤维素分解菌不能生长繁殖，D错误。
10、（5分）【答案】B
【解析】为避免污染，在处理葡萄时应先冲洗再除去枝梗，A错误；红葡萄酒中的红色是红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的，B正确；制作果酒的微生物是酵母菌，属于兼性厌氧性生物，C错误；果酒暴露在空气中，由于氧气充足，空气中醋酸菌容易将酒精转化为醋酸而产生酸味，D错误。
11、（5分）【答案】D
【解析】酸性蛋白质可以用稀碱性溶液提取，A正确；水溶性蛋白质可用中性缓冲液提取，B正确；脂溶性蛋白质可用有机溶剂提取，C正确；强酸、强碱都会使蛋白质变性而沉淀，所以不可用强酸性溶液提取，D错误。
12、（5分）【答案】D
【解析】植物组织培养的时候是对外植体进行消毒处理，A错误；植物组织培养中可以添加人工合成的化学物质，B错误；月季的花药培养一般选择单核靠边期的花药培养成功率最高，C错误；选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期，D正确。
13、（5分）【答案】C
【解析】亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，需在盐酸酸化条件下进行，A正确；配制溶液所用的提取剂为氯化镉与氯化钡，各50g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至1，B正确；将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量，C错误；振荡提取时加入Na OH是为了中和酸性物质，D正确。
14、（5分）【答案】C
【解析】对于植物胚状体的形成是两种激素同时使用，只有形成根或芽时的配比不同，所以C选项正确。
15、（5分）【答案】D
【解析】Ⅰ组和Ⅱ组培养基成分的差异是有无维生素，结果可以说明维生素可以促进大肠杆菌生长繁殖，A 正确。Ⅱ组和Ⅲ组的差异是有无葡萄糖，结果说明没有葡萄糖大肠杆菌不能正常生长，B正确。稀释涂布平板法培养大肠杆菌便于菌落计数，C正确。对培养基加热到62℃不能彻底灭菌，应采用高压蒸汽灭菌，D错误。
16、（5分）【答案】C
【解析】花生种子中脂肪的鉴定实验中，用的是组织样液，不需要有活性，A错误；观察洋葱鳞片叶内表皮细胞中DNA的分布实验中，经过盐酸水解后，细胞已经死亡，B错误；探究酵母菌的呼吸方式实验中，需要保持酵母菌的活性才能进行细胞呼吸，C正确；红细胞中血红蛋白的提取和分离实验中，需要将红细胞破裂才能提取到血红蛋白，因此细胞已经死亡，D错误。
17、（5分）【答案】B
【解析】一般来说，在单核时期细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高，A正确；在组织培养过程中，花药离体培养形成愈伤组织时必须转移至分化培养基上才能得到幼小植株，B错误；确定花粉发育时期的最常用方法是醋酸洋红法，这种方法能将花粉细胞核染成红色，C正确；影响花药培养成功率的因素有很多，如材料和培养条件等，D正确。
18、（5分）【答案】B
【解析】血红蛋白提取和分离一般按照“样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定”的顺序进行，A正确；纯化过程中要缓冲溶液充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液，B错误；样品处理过程中用蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破释放出血红蛋白，C正确；可经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，D正确。
19、（5分）【答案】C
【解析】利用化药离体培养得到单倍体植株过程中需要用到植物组织培养，A错误。利用基因工程培育抗虫棉用到脱分化、再分化的植物组织培养，B错误。利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，得到多倍体植株，不需要用植物组织培养，C正确。利用细胞工程培育杂种植株，也涉及脱分化、再分化的植物组织培养，D错误。
20、（5分）【答案】B
【解析】植物组织培养需要严格的无菌操作，包括：外植体应在酒精浸泡6-7s，再用无菌水清洗，A正确；整个操作过程在酒精灯火焰旁进行，同时每次使用后，对镊子等器械应进行火焰灼烧灭菌，B错误；操作前手需用酒精消毒，C正确；培养基需要用高压蒸汽灭菌，D正确。
工艺与设备 中草药中生物碱的提取与分离 蔡艳华赵红卫钟本和 (四川大学化工学院,成都,610051) 摘要 生物碱是许多中草药的有效成分。因其具有广泛的生理功能,引起了人们的关注。本文综述了近年来不同的提取和分离方法在生物碱中的应用原理。指出了各方法的优缺点及其今后发展的方向。 关键词:中草药生物碱提取纯化 1前言 生物碱是动植物中一类具有碱性的含氮物质。它们大多是极有价值的药物。中草药含有很多种生物碱,中草药的疗效大多是由所含的生物碱而来。 近年来生物碱作为中草药中的有效成分之一成为研究的热点。提取工艺是生物碱工业化生产的首要环节,特别是其提取和分离操作[1]。传统的生物碱提取分离方法能耗、物耗大,杂质多,效率低。针对这种情况,众多学者从不同角度对中药材中生物碱的提取分离进行了优化和改进[3)22]。本文就生物碱的提取分离技术,特别是几种新兴技术进行了综述。 2生物碱的提取方法 211传统提取方法 绝大多数生物碱是利用溶剂提取法进行提取。生物碱在溶剂中的溶解符合/相似相溶0的规律。极性强的生物碱亲水性较强,易溶于极性溶剂;弱极性生物碱亲脂性较强,易溶于弱极性溶剂。游离的生物碱大多亲脂性较强,而生物碱盐一般亲水性较强。按极性强弱可将生物碱提取溶剂分为极性溶剂、半极性溶剂和非极性溶剂[2]。 21111极性溶剂 极性溶剂有水、甘油、二甲亚砜等。水是最常用的强极性溶剂。具有碱性的生物碱在植物体中多以盐的形式存在,可直接以水作为提取溶剂。而弱碱性或中性生物碱则以不稳定的盐或游离的形式存在,这部分生物碱的亲水性比较弱,为增加其溶解度,可以采用酸水为提取液,使生物碱与酸生成盐而溶出。水提取物不易稳定,易染菌,此外含果胶,黏液质类成分的水提物难于过滤,影响分离操作。 21112半极性溶剂 半极性溶剂有乙醇、丙酮、丙二醇等。乙醇是最常用溶剂,游离的生物碱及盐类一般都能溶于乙醇。它可与水、甘油、丙二醇以任意比例混溶提取生物碱。有时也可采用醇酸溶液作提取剂。 21113非极性溶剂 非极性溶剂有乙醚、石油醚,氯仿、脂肪油、乙酸乙酯、液体石蜡等。以盐的形式存在于植物细胞中的生物碱采用非极性溶剂提取时,必须先使生物碱转变成游离碱后再用溶剂提取。非极性溶剂提出的总生物碱一般只含有亲脂性生物碱,不含水溶性生物碱。这种方法得到的生物碱杂质较少,易于进一步纯化。但溶剂渗入能力较弱,需反复提取。 溶剂提取法按具体操作可分为浸渍法、渗漉法、煎煮法、热回流法和连续回流法(索氏提取法)。21114浸渍法 浸渍法是将处理过的药材用适当的溶剂在常温
蛋白质的提取和分离专题训练 一．选择题 1．下列有关蛋白质的提取和分离的操作，其中排序正确的是()。 A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 2．下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作不正确的是()。 A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐 B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面 C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱 3．在蛋白质的提取和分离中，下列对样品处理过程的分析正确的是()。 A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的结果 C．洗涤过程选用质量分数0.1%的NaCl溶液(生理盐水) D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 4．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是()。 A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞 C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 5．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列叙述不正确的是()。 A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离 B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质 C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质 6．凝胶色谱法分离蛋白质时使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(SephadexG—75)，其中G、75的含义分别是()。 A．G表示凝胶的使用量，75表示加75 g水 B．G表示凝胶的交联程度，75表示需加热75 ℃ C．G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7.5 g D．G表示凝胶的膨胀体积，75表示每克凝胶膨胀后体积可达75 cm3 7．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()。 A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快 8．下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()。 A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心 B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离 D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h 9．下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是()。 A．分子带电性质的差异B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度10．下列有关提取和分离血红蛋白的程序叙述错误的是()。 A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B．通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 11．下列有关蛋白质提取和分离的叙述中，错误的是()。 A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性 B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来 C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离 D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极移动
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。 由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后
实验六：咖 啡 因 的 提 取 【实验目的】 1、学习生物碱提取及其衍生物的制备方法； 2、学会升华操作； 【实验原理】 咖啡碱具有刺激心脏，兴奋大脑神经和利尿等作用。主要用作中枢神经兴奋药。它也是复方阿斯匹林（A. P. C ）等药物的组分之一。现代制药工业多用合成方法来制得咖啡碱。 茶叶中含有多种生物碱，其中咖啡碱（或称咖啡因,caffeine ）含量约1%-5%，丹宁酸（或称鞣酸）约占11%-12%，色素、纤维素、蛋白质等约占0.6%。咖啡因是弱碱性化合物，易溶于氯仿、水、热苯等。 咖啡碱为嘌呤的衍生物，化学名称是1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，其结构式与茶碱，可可碱类似。 嘌呤（Purine ） 咖啡因(Caffeine) 茶碱(Guanine) 可可碱(Adenine) 含结晶水的咖啡碱为白色针状结晶粉末，味苦。能溶于水、乙醇、丙酮、氯仿等。微溶于石油醚，在100℃时失去结晶水，开始升华。120℃时升华显著，178℃以上升华加快。无水咖啡因的熔点为238℃ 从茶叶中提取咖啡因，是用适当的溶剂（氯仿、乙醇、苯等）在脂肪提取器中连续抽提，浓缩得粗咖啡因。粗咖啡因中还含有一些其它的生物碱和杂质，可利用升华进一步提纯。咖啡因是弱碱性化合物，能与酸成盐。其水杨酸盐衍生物的熔点为138℃，可借此进一步验证其结构。 【操作过程和实验装置图】 N N NH N 12 3 67 9 CH 3 3 CH 3 N N O O N N N O O CH 3 NH N CH 3N N N CH 3 HN N O O 3
1、生物碱及其衍生物的提取与制备方法。 2、升华操作 流程 图2.8.2 常压升华装置 【实验关键和注意事项】 （1）滤纸套筒大小要合适，以既能紧贴器壁，又能方便取放为宜，其高度不得 超过虹吸管；要注意茶叶末不能掉出滤纸套筒，以免堵塞虹吸管；纸套上面折成凹形，以保证回流液均匀浸润被萃取物，也可以用塞棉花的方法代替滤纸套筒。用少量棉花轻轻阻住虹吸管口。 （2）瓶中乙醇不可蒸得太干，否则残液很粘，转移时损失较大。 （3）生石灰起吸水和中和作用，以除去部分酸性杂质。 （4）在萃取回流充分的情况下，升华操作是实验成败的关键。升华过程中，始 终都需用小火间接加热。如温度太高，会使产物发黄。注意温度计应放在合适的位置，使正确反映出升华的温度。 【主要试剂及产品物理常数】
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质的提取与纯化 一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等
中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
蛋白质的提取和分离 【教学目标】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 3．尝试提取和检测牛奶中的酪蛋白。 4．尝试卵清蛋白的分离。 【教学重难点】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 【教学过程】 一、蛋白质分离提纯技术 1．将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到高纯度的、甚至是单一种类的蛋白质。 2．蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中，电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。 二、电泳技术及分离蛋白质的原理 1．电泳现象：带电粒子在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。电泳常用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶，由此而来的技术称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2．电泳技术分离蛋白质的原理： （1）蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。 （2）蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，则移动越快。 （3）不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。将这些带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离，则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。 三、血清蛋白的提取和分离 1．新鲜血液在体外凝固后，会析出清亮的淡黄色液体——血清。血清中含有丙种球蛋白、
凝集素等多种蛋白质。 2．过程： （1）点样：取新制血清与蔗糖溶液及溴酚蓝指示剂等体积混匀后，小心加到电泳样品槽的胶面上。 （2）电泳。 （3）染色：取出凝胶，放入质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液中。染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min。 （4）脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液浸泡漂洗数次，每隔1~2h更换脱色液，直至底色脱净，背景清晰。 （5）制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3~4h，然后放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。 四、其他蛋白质的提取与分离 1．牛奶中酪蛋白的提取与检测： 当pH=4.8时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。 酪蛋白中含有酪氨酸，能与米伦试剂起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成红色。 2．卵清蛋白质的分离： 选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜卵清做实验材料。采用电泳法分离卵清蛋白质。 自主思考： 可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变？ 提示：可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品，采用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变做出诊断。 探究一：蛋白质的分离原理 问题导引： 为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混在一起。要获得纯净的丙种球蛋白，就必须进行提取和分离。你能提供分离蛋白质的思路吗？ 提示：可根据蛋白质各种特性的差异，如分子的大小、所带电荷的性质和多少等来分离不同种类的蛋白质。 名师精讲： 蛋白质的分离方法：
蛋白质提取与制备具体操作方法 1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间 隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的 也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局 部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损 失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
Dictamnine 白鲜碱；Skimmianine 茵芋碱； Fagarine 青椒碱；Robustine ； <分子式> C12H9NO2 <相对分子质量> 199 <性状>棱柱粉末。又称白鲜胺，白藓碱。棱柱结晶(由乙醇中结晶)，熔点133℃。溶于热乙醇和氯仿，微溶于乙醚，难溶于水。其盐酸盐为针状结晶(由乙醇中结晶)，熔点170℃(分解)。其苦味酸盐为黄色棱晶(由乙醇中结晶)，熔点1.63℃。存在于芸香科植物白鲜(Dictamnus dasycarpus Turcz.)的根。 芸香科植物白鲜的根；芸香科植物欧白鲜；芸香科植物花椒属竹叶椒的根；芸香科植物阿诺梯花椒的茎；芸香科植物得卡瑞花椒的茎皮；芸香科植物刺异叶花椒的根；芸香科植物蚬壳花椒的茎；芸香科植物乔木状花椒的叶；芸香科植物崖椒的茎皮；芸香科植物两面针；芸香科植物松风草的地上部分；芸香科花椒属植物梅宇崖椒的树皮；芸香科植物的树皮；芸香科植物似番樱桃叶芸香草地上的部分；芸香科植物火山生芸香草的全草；芸香科植物的茎；芸香科植物的根和茎；芸香科的叶；芸香料的树皮 <生物活性>强心和对平滑肌的作用；松弛血管的作用；抗真菌和DNA光毒性作用；皮肤光损害作用；抗血小板聚集作用；昆虫拒食作用。 防己提取物 【英文或拉丁名】：Stephania Tetrandra extract 【产品规格】：Tetrandrine12% Fangchinoline6% 【包装规格】：25kg/paper drum 【产品介绍】：药材为防己科植物石蟾蜍Stephania tetrandra S. Moore的根。棕色粉末。
【化学成分】：含多种异喹啉生物碱，主要有粉防己碱(tetrandrine )、防己诺林碱(fangchinoline)、轮环藤酚碱(cyclanoline)、二甲基粉防己碱(dimethyltetrandrine) 以及小檗胺(berbamine)等。 【功能主治】：利水消肿，祛风止痛。用于水肿脚气、小便不利、风湿痹痛、湿疹疮毒、高血压症。 【备注】： 植物形态多年生落叶缠绕藤本。茎纤细，有纵条纹。叶互生，宽三角状卵形，先端钝，具小突尖，基部截形或略心形，两面均被短柔毛，全缘，掌状脉5条；叶柄盾状着生。花小，单性，雌雄异株；雄花序为头状聚伞花序，排成总状，萼片4，花瓣4，雄蕊4，花丝连成柱状体，上部盘状，花药着生其上；雌花萼片、花瓣与雄花同，心皮1。核果球形，熟时红色。花期5-6月，果期7-9月。 生于山坡、丘陵地带的草丛及灌木林缘。主产浙江、安徽、湖北、湖南。 采制秋季采挖，除去粗皮，晒至半干，切段或纵剖，干燥。 性状根不规则圆柱形，或剖切成半圆柱形或块状，常弯曲，弯曲处有深陷横沟而呈结节状，长5-15cm，直径1-5cm。表面灰黄色，有细皱纹及横向突起的皮孔。质坚重，断面平坦，灰白色，粉性。气微，味苦。
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
优选精品资源欢迎下载选用 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
第一节蛋白质的提取和分离 一、蛋白质分离提纯技术 常用的蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。 二、电泳技术分离蛋白质的原理 1．蛋白质中含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。 2．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。 3．蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，移动越快。 三、结果分析 不同蛋白质的混合溶液经过同一电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹，每种带纹可能就是一种蛋白质。 四、“血清蛋白的提取和分离”活动程序 1．点样：取新制血清5微升、质量浓度为0.4克/毫升的蔗糖溶液和质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂等体积混匀后，用微量加样器吸取5 μL样品加到电泳样品槽的胶面上。 2．电泳。 3．染色：用质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液对凝胶进行染色。 4．脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液对凝胶板进行浸泡漂洗，至底色脱净。 5．制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3 h～4 h后，放在两层透气的玻璃纸中间自然干燥。 预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中 问题1 问题2 问题3 问题4
一、蛋白质分离提纯的方法 1．蛋白质分离的基本过程 破碎细胞―→抽提(粗制品)―→纯化蛋白质 2．破碎细胞的方法 在分离与纯化蛋白质之前，必须采用适当的方法使蛋白质呈溶解状态释放出来：通常先将生物组织进行机械破碎，再根据细胞的特点，选择不同的破碎细胞方法(常用的有研磨法、超声波法、酶解法)。 3．抽提 细胞破碎后，各种蛋白质被释放出来，再根据蛋白质的不同性质，选择不同的溶剂进行抽提。 4．纯化 (1)原理：纯化主要是指根据蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度大小、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在的差异进行的。 (2)方法：①透析法——分子大小 ②离心沉淀法——分子大小、密度大小 ③电泳——所带电荷多少 二、“血清蛋白质的分离”实验中应注意的问题 1．由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2.将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝R250染色液中染色30 min后，多次更换脱色液至背景清晰。脱色后，可将凝胶浸于保存液中，长期封装在塑料袋内使其不会降低染色强度。为保存永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。 电泳的原理及应用 如图为某些氨基酸在pH为6时进行电泳的结果，请回答：
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如
皂苷的提取分离 皂苷部分极性较大，首先应该附集皂苷部位，通常可用正丁醇萃取或是大孔树脂得到总皂苷部位。 对于具体皂苷的分离，若使用硅胶柱层析，一般以氯仿：甲醇：水进行洗脱，氯仿：甲醇：水一般为9：1：0.1，8：2：0.3，7：3：0.5，同时应注意要加大柱层析硅胶的装柱量，减少样品的上样量；另外也可使用反相柱。 此外有些皂苷类成分极性较大容易含有一些色素，不易结晶，可使用 Sephedex LH-20去除色素，进而使皂苷结晶。 类似物的hplc分离注意的问题 HPLC时生物碱对流动相的PH值很敏感。 三萜皂苷的提取与分离 （1）提取：三萜皂苷常用醇类溶剂提取，若皂苷含有羟基、羧基极性基团较多，亲水性强，用稀醇提取效果较好。提取物先用石油醚脱脂，然后再用正丁醇萃取，萃取物再经大孔吸附树脂，得粗皂苷。 （2）分离：采用分配柱色谱法要比吸附柱色谱法好，常用硅胶为支持剂，以氯仿-甲醇-水为或乙酸乙酯-乙醇-水为洗脱剂。 氨基酸的分离 将氨基酸分离成酸性氨基酸，碱性氨基酸，中性氨基酸和芳香族氨基酸。取酸水解氨基酸液适量通过阳离子交换的层析柱，碱性氨基酸就保留在层析柱上；而中性氨基酸和酸性氨基酸的混合液则进入滤液中。再将滤液通过阴离子交换的层析柱，一切酸性氨基酸就保留在层析柱上；而中性氨基酸就进入滤液中。吸附在阳离子交换层析柱上的氨基酸，用2 N HAc洗脱；吸附在阴离子交换层析柱上的氨基酸，用0.5 NNaOH洗脱。 黄酮类化合物的分离 黄酮类化合物在硅胶上的吸附较多，可以采取减压硅胶柱或者中压硅胶柱，上样量稍大一些（这样可以减小吸附量），将样品分段，然后采用sephadex LH－20进行细分。采用sephadex LH－20时，最好选择一个比较合适的水与甲醇的比例（样品不会毫无保留），进行等度洗脱。因为水甲醇梯度洗脱很容易产生气泡。个人认为经过硅胶和sephadex LH－20后，黄酮和多糖应该能够分开。 生物碱与生物酸分离方法 https://www.doczj.com/doc/f37984765.html,/bbs/post/view? ... sty=1&age=0#4271305 差向异构体的分离 https://www.doczj.com/doc/f37984765.html,/bbs/post/view? ... 1&sty=1&age=0#62893 生物碱的提取： 由于各种生物碱的结构不同，性质各异，提取分离方法也不尽相同，主要是根据生物碱的溶解度而定。生物碱大都能溶于氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂，除季铵碱和一些分子量较低或含极性基团较多的生物碱外，一般均不溶或难溶于水，而生物碱与酸结合成盐时则易溶于水和醇。基于这种特性，可用不同的溶剂将生物碱从中药中提出，常用的提取溶剂有下列3种： （1）非极性溶剂：样品先用10%氢氧化铵溶液湿润，使中草药中与酸结合成盐的生物碱呈游离状态，然后用氯仿或乙醚等提取，一些与酸结合比较稳定的生物碱盐类和鞣酸盐或碱性较强的生物碱盐等，氢氧化铵不能将其完全分解，可用碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙或氧化镁，甚至氢氧化钠碱化，这个方法的缺点是不能提出水溶性生物碱。 （2）极性溶剂：极性较大的生物碱可用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水（常
实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。