生物分离与纯化技术
主编邱玉华
副主编杨洪元贺立虎
参编魏秋红孟泉科
孟祥斌廖威
前言
迅猛发展的现代生物技术是当代新技术革命的重要力量，正逐步实现产业化，且已渗透到医药、化工、环保、能源等行业，其产品——生物物质对人类生活的影响日益突出，应用越来越广泛。生物物质的生产包括上游工程和下游加工过程，下游加工过程即生物物质的分离纯化过程，其中涉及的技术统称为生物分离与纯化技术。生物分离与纯化技术是相关产业中使用最普遍的技术，是从事生物物质生产必须掌握的基本技术。作为高职高专生物技术、生物制药专业的学生，将是生产实践中生物技术的具体实施者和应用者，熟练掌握生物分离与纯化技术的原理和关键技术是非常重要的。生物分离与纯化技术是高职生物技术、生物制药专业的专业必修课程之一。
为了适应高职高专教学的特点，本书的理论部分坚持“够用、适度、实用”的原则，以生物物质的基本制备过程为主线，阐述了离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出分离技术、色谱（层析）技术、膜分离技术和浓缩干燥技术等分离纯化技术的基本原理，在结合生产实践的基础上讲解了技术的应用以及相关设备的使用，并及时吸收了有关的新知识、新技术、新方法和新工艺。
为了适应生物技术产业发展需要，为了使学生对各项技术实现“学得好、用得上、用得好”，本书专门安排了生物分离与纯化技术的实训内容。其中单元操作实验主要对学生进行各项分离纯化技术的单项训练，要求学生熟悉分离纯化实训的目的和基本要求，掌握各仪器设备和分离方法的操作过程和技术要领，培养学生的动手能力、分析解决问题的能力。在此基础上，学生通过部分生物物质的制备综合实训，能熟练地综合应用破碎、过滤、层析、超滤膜、离子交换等技术进行生物物质的分离纯化，能够设计生物产品分离纯化的简单工艺流程和控制要点，具备分离纯化技术的实践应用能力，从而加深理论知识的理解和对行业的了解，为从事生物产品的分离纯化工作打下良好的基础。实训项目参考了教育部高等学校高职高专药品类专业教学指导委员会制定的高等职业教育生物制药技术专业实训项目与设备配置推荐方案，并进行了一定的综合和创新，使其符合各级各类院校的实际情况和教学要求。
本书由常州工程职业技术学院的邱玉华、孟祥斌老师，广西职业技术学院的杨洪元、廖威老师，杨凌职业技术学院的贺立虎老师，漯河职业技术学院的魏秋红老师，三门峡职业技术学院的孟泉科老师结合自身的教学经验和实践应用知识共同编写完成。有关职业院校生物技术类专业的教师对本书的编写提出了宝贵的建议和意见，我们也得到了化学工业出版社的大力支持和帮助，在此表示衷心的感谢。由于编者能力和水平有限，难免有错误和不妥之处，敬请广大读者和同仁批评指正。
目录前言
第一篇技术理论篇
第1章绪论
第1节概述
一、生物物质及其来源
二、生物分离纯化技术
三、分离纯化基本原理
第2节分离纯化策略
一、分离纯化的特点
二、分离纯化方法选择的原则
三、分离纯化的原材料选择与成品保存
四、分离纯化的准备工作
五、分离纯化的基本步骤
六、分离纯化技术的综合运用与工艺优化
七、分离纯化工艺的中试放大
八、生物药品生产工艺的验证
第3节分离纯化技术的发展
一、生物分离纯化技术的发展历史
二、分离纯化技术的发展趋势
第2章预处理技术
第1节概述
一、预处理
二、生物材料的预处理过程
第2节发酵液过滤特性的改变与相对纯化
一、发酵液过滤特性的改变
二、发酵液的相对纯化
第3节凝聚和絮凝技术
一、凝聚
二、絮凝
三、混凝
第4节细胞破碎技术
一、细胞壁的结构及特点
二、细胞壁的结构和细胞的破碎
三、细胞破碎效果的检查
四、细胞破碎的方法
五、选择破碎方法的依据
六、破碎技术的研究方向
第5节离心技术
一、离心分离的基本原理
二、有关离心分离的基本知识
三、影响离心效果的因素
四、离心分离纯化的方法
五、常用离心分离设备
第3章固相析出分离技术
第1节概述
第2节盐析法
一、基本原理
二、盐析常用的盐类及其选择
三、影响盐析的因素
四、盐析操作过程及其注意事项第3节有机溶剂沉淀法
一、基本原理
二、常用的有机溶剂及其选择
三、影响有机溶剂沉淀的因素
第4节其它沉淀技术
一、等电点沉淀法
二、选择性变性沉淀法
三、有机聚合物沉淀法
第5节结晶技术
一、基本原理
二、结晶的过程
三、影响结晶析出的主要条件
四、结晶操作
五、结晶设备
第4章色谱技术
第1节概述
一、色谱分离技术的概念
二、色谱分离系统的组成
三、色谱分离技术的分类
四、色谱分离技术的特点
五、色谱分离技术的应用
第2节吸附色谱分离技术
一、吸附色谱分离技术
二、吸附色谱分离操作及其设备
三、吸附色谱技术的应用
第3节离子交换色谱技术
一、离子交换色谱分离技术
二、离子交换色谱操作及设备
三、离子交换色谱技术的应用
第4节凝胶色谱分离技术
一、凝胶色谱技术
二、凝胶色谱分离操作
三、凝胶色谱技术的应用
第5节亲和色谱分离技术
一、亲和色谱技术
二、亲和色谱分离操作
三、亲和色谱的应用
第6节高效液相色谱分离技术
一、高效液相色谱技术
二、高效液相色谱技术分离操作及设备
三、高效液相色谱技术的应用
第5章过滤与膜分离技术
第1节概述
第2节过滤技术
一、基本原理
二、过滤介质
三、过滤装置
四、常用的过滤方法
五、过滤的影响因素
第3节膜与膜组件
一、膜的分类和性能
二、膜的组件
第4节微滤技术
一、微滤的基本原理
二、微滤膜的特性
三、微滤膜分离系统及工艺流程
四、微滤膜的污染与防治
第5节超滤技术
一、基本原理
二、超滤膜的特性
三、超滤的特点和影响因素
四、超滤前的准备
五、超滤膜分离系统及工艺流程
五、超滤设备
第6节透析技术
一、基本原理
二、透析膜和膜组件
三、透析设备及其流程
四、透析技术的主要用途
第7节其他技术
一、反渗透技术
二、电渗透技术
三、纳滤技术
四、膜蒸馏技术
第6章萃取技术
第1节概述
一、萃取的概念
二、萃取的分类
三、萃取的特点
第2节溶剂萃取技术
一、理论基础
二、萃取操作流程
三、影响萃取的主要因素
四、萃取设备
第3节双水相萃取技术
一、双水相萃取的基础理论
二、影响双水相萃取的因素
三、双水相萃取的工艺流程
四、双水相萃取技术的应用
第4节超临界流体萃取
一、超临界流体萃取的原理
二、超临界流体萃取工艺
三、超临界流体萃取的特点
四、超临界流体萃取设备
五、超临界流体萃取技术的应用第5节其他萃取技术
一、反胶团（胶束）萃取技术
二、固体浸取技术
三、液膜萃取技术
第7章浓缩干燥技术
第1节浓缩技术
一、基本原理
二、常用浓缩技术
三、浓缩设备及操作
四、超滤设备的工艺与设备验证
第2节干燥技术
一、概述
二、热干燥技术
三、冷冻干燥技术
第二篇技术实训篇
第1章概述
一、实验实训内容和目的要求
二、生物产品分离纯化实训条件
三、实训室学生守则
四、实训室安全
五、教学方法和手段建议
六、实验记录与实验报告
第2章单元操作实验
实验一酵母细胞的破碎及破碎率的测定
实验二细胞核与线粒体的分级分离
实验三胰凝乳蛋白酶的制备
实验四牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备实验五大蒜细胞SOD酶的提取和分离
实验六凝胶通透层析法分离蛋白质
实验七离子交换层析分离氨基酸
实验八青霉素的萃取与萃取率的计算
实验九蛋白质的透析
实验十蛋白质的真空浓缩
实验十一蛋白质的冷冻干燥
第3章综合实训
实训一 L-精氨酸的分离纯化
实训二木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测
实训三生物碱的分离纯化
实训四土霉素提取与分离
实训五黄酮类物质的分离纯化
实训六多糖的分离纯化
第一篇技术理论篇
第1章绪论
第1节概述
学习目标：
1．熟悉生物物质的概念、种类和来源
2．掌握分离纯化技术及其基本原理
突飞猛进、日趋成熟的现代生物技术，正在成为推动世界新技术革命的重要力量，其产业化发展必将对未来的人类社会、经济发展和生活方式产生越来越大的影响。生物技术产业主要制备具有生物活性的生物物质并使其商品化，利用专门的设备和技术将生物物质从生物原料中分离纯化出来并保持其活性，其工艺复杂，周期长，影响因素多。分离纯化技术是现代生物技术产业下游工艺工程的核心，是决定产品的安全、效力、收率和成本的技术基础，在生物技术产业中起着越来越重要的作用。
一、生物物质及其来源
（一）生物物质
生物物质这个词汇是在20世纪末随着生物技术的发展才逐渐进入人们的词汇之中，它指的是来源于生物中天然的或利用现代生物工程技术以生物为载体合成的，从氨基酸、多肽等低分子化合物到病毒、微生物活体制剂等具有复杂结构和构成成分的生物组织的一类物质，它们存在于生物体内直接参与生物机体新陈代谢过程，并能与生物各种机能产生生物活化效应，因此也称为生物活性物质，而产业中生物物质的制成品也称为生物产品。其种类繁多，分布很广，按照其化学本质和特性来分常见的有如下一些类型：
1．氨基酸及其衍生物类
主要包括有天然氨基酸及其衍生物，这是一类结构简单、分子最小、易制备的生物物质，约有60多种。目前主要生产的品种有谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氦酸、苏氨酸和色氨酸等，其中谷氨酸的产量最大，约占氨基酸总产量的80％左右。
2．活性多肽类
活性多肽是由多种氨基酸按一定顺序连接起来的多肽链化合物，相对分子质量一般较小，多数无特定空间构象。多肽在生物体内浓度很低，但活性很强，对机体生理功能的凋节起着非常重要的作用。主要有多肽类激素，目前已应用于临床的多肽药物达20种以上。
3．蛋白质类
这类生物物质主要有简单蛋白和结合蛋白（包括糖蛋白、脂蛋白、色蛋白等）。简单蛋白又称为单纯蛋白，这类蛋白质只由氨基酸组成肽链,不含其它成分，如清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白、
硬蛋白、干扰素、胰岛素、生长素、催乳素等。结合蛋白质是由简单蛋白与其它非蛋白成分如核酸、脂质、糖、血红素等辅基结合而成，如促甲状腺素、绒膜激素、垂体促性激素等糖蛋白激素，尿抑胃素、胃膜素、硫酸糖肽等粘性糖蛋白类，血浆糖蛋白及纤维蛋白原、丙种球蛋白等其他糖蛋白类。
另外，特异免疫球蛋白制剂和细胞生长因子是近年来十分引人注目的蛋白质类产品，如丙种球蛋白A、丙种球蛋白M、抗淋巴细胞球蛋白等已广泛用于原发性免疫球蛋白缺陷和一些病毒病的临床治疗。细胞生长因子是在体内对动物细胞的生长具有调节作用，并在靶细胞上具有特异受体的一类物质，它不是细胞的营养生长因子，目前已经应用于临床的有如神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(PGF)、集落细胞刺激因子(CSF)、红细胞生成素(EPO)以及淋巴细胞生长因子等。
4．酶类
酶是一种生物催化剂，是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，随着近年来现代生物技术的发展，作为商品的酶制剂已经广泛应用于食品工业、医药、化工、纺织、环保和能源等方面等行业。它主要包括工业用酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、果胶酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等，医疗用酶如消化酶、抗炎酶、循环酶、抗癌酶、酶诊断试剂等，基因工程工具酶如各种限制性内切酶、外切酶等。
5．核酸及其降解物类
主要包括有核酸碱基及其衍生物、腺苷及其衍生物、核苷酸及其衍生物和多核苷酸等，约有60多种。
6．糖类
主要包括有单糖、低聚糖、聚糖和糖的衍生物，其中一些功能性的低聚糖如海藻糖和聚糖中的一些微生物粘多糖如香菇多糖在糖类中占有重要的地位，日益显示出较强的生化作用和较好的临床医疗效果。
7．脂质类
脂类具有相似的非水溶性，但其化学结构差异较大，生理功能较广泛，主要包括有磷脂类、多价不饱和脂肪酸、固醇、前列腺素、卟啉以及胆酸类等。
8．动物器官或组织制剂
这是一类对其化学结构、有效成分不完全清楚，但在临床上确有一定疗效的药物，俗称脏器制剂，截至目前已有近40来种，如动脉浸液、脾水解物、骨宁、眼宁等。
9．小动物制剂
主要有蜂王浆、蜂胶、地龙浸膏、水蛭素等。
10．菌体制剂
主要包括有活菌体、灭活菌体及其提取物制成的药物，如微生物肥料制剂、畜牧业饲用微生物制剂、污水处理微生物制剂以及用于医疗上的乳酶生、促菌生、酵母制剂等。
随着对各种生物物质的认识尤其是它们的生物功能越来越清楚，它们的应用越来越广泛，越来越深入，在医药、农林牧渔、环保等产业中都有涉及。
（二）生物物质来源
上述各种生物物质主要来自它们广泛存在的各种生物资源中，包括天然的生物体及其组织、器官与现代生物工程技术改造的生物体，目前普遍利用的有：
1．动物器官与组织
包括猪牛羊等的肝脏、胰腺、乳腺以及鸡胚胎等。从海洋生物的器官与组织获得生物活性物质是重要的流行的发展趋势。
2．植物器官与组织
含有很多药用活性成分，转基因植物又可产生大量以传统方式很难获得的生物物质。
3．微生物及其代谢产物
从细菌、放线菌、真菌和酵母菌的初级代谢产物中可获得氨基酸和维生素等，次级代谢产物中可获得青霉素和四环素等一些抗生素。基因工程的发展使得通过微生物培养获得大量其他生物物质成为可能。
4．细胞培养产物
细胞培养技术的发展使得从动物细胞、昆虫细胞中获得较高应用价值的生物物质成为可能，且发展迅速，应用越来越广泛，前景广阔。
5．血液、分泌物及其他代谢物
人和动物的血液、尿液、乳汁和胆汁、蛇毒等其他分泌物与代谢产物也是生物物质的重要来源。
二、生物分离纯化技术
生物物质是生物技术产业的主要产品，现代生物技术的主要目的是生物物质的高效生产，生产过程主要包括生物资源的上游加工过程和生物物质的下游加工过程，上游涉及微生物发酵技术、细胞培养技术、酶工程、基因工程、蛋白质工程、组织工程与转基因生物技术等；下游加工过程即生物物质的分离纯化过程，其中涉及的技术统称为分离纯化技术，主要有：离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出分离技术、色谱（层析）技术和膜分离技术等。
分离纯化技术是现代生物物质制造工艺的核心，是决定产品的安全、效力、收率和成本的技术基础。生物物质的分离纯化包括生物材料的预处理、初步纯化、高度纯化、成品加工等过程，由于
生物物质的特殊性、复杂性以及要求的严格性，生物分离纯化过程所产生的成本费用约占整个生产过程的70％，而纯度要求更高的药品如天动酰胺酶的分离纯化成本高达生产过程的85％。
生物分离纯化工作按照目标成分所要达到的规模和质量规格可以分为以下若干层次：
⑴实验室规模主要涉及基础或应用研究探索性的分离纯化工作，所提取的成分一般用于评价其潜在应用前景和等；
⑵小试或中试规模生物产品工艺开发中小量试验和中间试验生产规模的分离纯化工作，以摸索和优化工艺条件为目的，试生产的产品用于工艺评价、药效评审、活性试验；
⑶常规生产规模生物产品常规生产涉及的分离纯化工作，所生产的产品用于市场销售和实际应用。
三、分离纯化基本原理
生物物质在经过上游加工后通常是由一些生物细胞、细胞或组织外分泌物、细胞内代谢产物、残存底物以及其他组分组成的混合物，这些混合物有些是均相混合物，有些是非均相混合物。非均相混合物的分离主要靠质点运动与流体力学的原理进行分离，如过滤、沉降、离心分离等。均相混合物可以采用传质分离过程即在一定条件下，混合物中某一或某些组分由高浓度区移向低浓度区来实现分离混合物的操作过程，如萃取、蒸馏等。但无论是均相混合物还是非均相混合物，其分离的本质是有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化，因此，混合物中不同组分之间的理化、生物学性质是制定生物物质分离纯化技术和工艺的依据（见表1-1），这些性质包括以下几个方面。
1．物理性质
⑴分子形状、大小包括密度、几何尺寸和形状。利用这些性质差别，可采用差速离心与超离心、重力沉降、膜分离、凝胶过滤等分离纯化方法。
⑵溶解度、挥发性利用这些性质的分离方法很多如蒸馏、蒸发、萃取、沉淀与结晶、泡沫分离等。
⑶分子极性即电荷性质包括溶质的电荷特性、电荷分布、等电点等，生产中电色谱、离子交换、电渗析、电泳、等电点沉淀就是利用这些性质进行分离的。
⑷流动性包括粘度、在特定溶液中的扩散系数等。利用溶质的流动性差别直接进行分离纯化的操作较少，但它在很多分离纯化操作单元如萃取、离心中发挥重要作用。
2．化学性质
⑴分子间的相互作用包括分子间的范德华力、氢键、离子间的静电引力及疏水作用大小等。
如分离纯化中电渗析、离子交换色谱等就是依据这些性质进行的。
⑵分子识别即是通过目标产物与某些分离纯化介质上的活性中心、基团进行的专一性结合。如亲和色谱操作。
⑶化学反应利用化学反应来进行产品的分离在目前生化产品的生产例子比较多，如谷氨酸工业生产中的锌盐沉淀法、茶多酚生产中的铝盐沉淀法。这种性质在分离纯化操作中的应用主要是使目标产物通过与其它试剂发生特定的化学反应，使目标产物的理化性质、生物学性质发生改变而使目标产物易于采用其它方法从混合物中分离纯化出来。
3．生物学性质
生物学性质的应用是生物物质分离纯化所特有的，它的主要特征是生物大分子之间的分子识别和特异性结合。这种性质的利用主要在蛋白质、核酸、病毒等物质的亲和分离中见得比较多。
表1-1分离纯化基本原理
生物物质分离纯化就是根据目标产物与混合物中其他杂质之间的理化性质、生物学性质差异进行的，在实际分离纯化中有些操作仅是单一性质起作用，但更多的情况是多种性质共同发挥作用，因此在生物物质的实际分离纯化中，要达到产品的终极要求，往往需要利用基于目标产物与其他杂质的多种性质差异，采用多种手段、多步骤的分离纯化操作组合串联。
第2节分离纯化策略
学习目标
1．掌握分离纯化的特点与一般步骤
2．了解分离纯化的原料选择和成品保存方法
3．熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作
一、分离纯化的特点
生物物质主要包括氨基酸、多肽、蛋白质、酶、核酸、多糖、脂类以及它们的衍生物、生物制品等，这些物质大多具有生理活性和药理作用，其活性的大小直接与他们的终极应用目的密切相关，而其中很多生物大分子如蛋白质、核酸、病毒类基因治疗剂等对外界条件非常敏感，过酸、过碱、热、光、剧烈震荡等都有可能导致其丧失活性。因此，生物物质的分离纯化操作具有不同于其他物质的一些显著特点。
1．环境复杂、分离纯化困难
目标产物存在的环境复杂，分离纯化比较困难具体表现在两个方面：一是目标产物来源的生物材料中常含有成百上千种其它杂质，以谷氨酸发酵液为例，在发酵液中除了含有大量的微生物细胞、细胞碎片、残余培养基成分等杂质外，还含有核酸、蛋白质、多糖等大分子物质以及大量其它氨基酸、有机酸等低分子的中间代谢产物质，这些杂质有些是可溶性物质，有些是以胶体悬浮液和粒子形态存在。总之，混合物的组成相当复杂，即使是一个特定的体系，也不可能对它们进行精确地分离，何况某些组分的性质与目标产物具有很多理化方面的相似性；二是不同生物材料成份的差别导致分离纯化过程中处理对象理化性质的差别，比如赖氨酸可以采用发酵法和水解动植物蛋白质获取，同样是赖氨酸，因水解液和发酵液的组成成份差别决定了在赖氨酸的分离纯化中不可能采用相同的生产工艺。
2．含量低、工艺复杂
目标产物在生物材料中的含量一般都很低，有时甚至是极微量的，如胰腺中，脱氧核糖核酸酶的含量为0.004％，胰岛素含量为0.002％；从竹笋中提取几毫克的竹笋素需要消耗几吨的竹笋。因此，要从庞大体积的原料中分离纯化到目标产物，通常需要进行多次提取、高度浓缩提取液等处理，这是造成生物分离纯化成本增加的原因之一。
3．稳定性差、操作要求严格
生物物质的稳定性较差，易受周围环境及其他杂质的干扰，因此，通常需保持在特定的环境中，否则容易失活。生物物质的生理活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的，过酸、过碱、热、光、剧烈震荡以及某些化学药物存在等都可能使其生物活性降低甚至丧失。因此，对分离
纯化过程的操作条件有严格的限制，尤其是蛋白质、核酸、病毒类基因治疗剂等生物大分子，在分离纯化过程通常需要采用添加保护剂、采用缓冲系统等措施以保持其高的活性。
4．目标产物最终的质量要求很高
由于许多生物产品是医药、生物试剂或食品等精细产品，其质量的好坏与人们的生活、健康密切相关，因此，这类产品通常要求必须达到药典、试剂标推和食品规范的要求。如对于蛋白质药物，一般规定杂蛋白含量＜2％，而重组胰岛素中的杂蛋白应＜0.01％，不少产品还要求是稳定的无色晶体。
5．终极产品纯度均一性的证明与化学分离上纯度的概念并不完全相同
由于绝大多数生物产品对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂，应用途径多样化，故对其均一性的评定常常是有条件的，或者通过不同角度测定，最后综合得出相对的“均一性”结论。只凭一种方法所得纯度的结论往往是片面的，甚至是错误的。
二、分离纯化方法选择的原则
生物物质能否高效率低成本地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是目标产物与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。从生物物质分离纯化的特点可以看出，分离纯化方案必然是千变万化的。因此，要想使我们的目标产品尽可能达到低成本、高产量、高质量的生产目的就涉及到分离纯化策略的问题，这对于每一个从事分离纯化技术的工作者来说十分重要。S.D.Roe以蛋白质的分离纯化为例，提出制定蛋白质分离纯化工艺设计时应考虑的若干条原则：①技术路线、工艺流程尽量简单化；②尽可能采用低成本的材料与设备；③将完整工艺流程划分为不同的工序；④注意时效性，应优选可缩短各工序分离纯化时间的加工条件；⑤采用成熟技术和可靠设备；⑥分离纯化开始前编写、备好书面标准操作程序等技术文件，对分离纯化过程进行记录；⑦以适宜方法检测纯化过程的产物产量和活性，对纯化过程进行监控等。
尽管以上原则是从蛋白质分离纯化长期积累经验中总结出来的，但对于多糖、核酸及脂类等绝大多数生物物质的分离纯化工艺开发工作也有借鉴作用。
三、分离纯化的原材料选择与成品保存
1．原材料的选择
选取生物材料时需考虑其来源、目的物含量、杂质的种类、价格、材料的种属特性等，其原则是要选择富含所需目的物、易于获得、易于提取的无害生物材料。
⑴来源选材时应选用来源丰富的生物材料，做到尽量不与其他产品争原料，且最好能综合利用。如罗汉果和甜叶菊中都含有甜甙类物质，他们在甜度、用途、性质上十分接近，到底选用哪一
种原料来生产甜味剂，就必须根据原料市场、地域、产品用途等多种因素加以考虑。
⑵与目标产物含量相关的因素生物材料中目标产物含量的高低，直接关系到终产品的价格，在选择生物材料时需从以下几个方面加以考虑。
①合适的生物品种根据目标产物的分布，选择富含目标产物的生物品种是选材的关键。如制备催乳素，不能选用禽类、鱼类、微生物，应以哺乳动物为材料。
②合适的组织器官不同组织器官所含目标产物的量与种类以及杂质的种类、含量都有所不同，只由选择合适的组织器官提取目标产物才能较好地排除杂质干扰，获得较高的收率，保证产品的质量。如制备胃蛋白酶只能选用胃为原料；免疫球蛋白只能从血液或富含血液的胎盘组织中提取。血管舒缓素虽可从猪胰腺和猪颚下腺中提取，两者获得的血管舒缓素并无生物学功能的差别，但考虑提取时目标产物酌稳定性却以猪颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。
③生物材料的种属特异性由于生物体间存在着种属特性关系，因而，使许多内源性生理活性物质的应用受到了限制。如用人脑垂体分泌的生长素治疗侏儒症有特效，但用猪脑垂体制备的生长素则对人体无效；牛胰中提取的牛胰岛素活性单位比猪胰岛素高，牛为40000IU／kg，猪为3000IU ／kg，但在抗原性方面猪胰岛素比牛胰岛素低。
④合适的生长发育阶段生物在不同的生长、发育期合成不同的生化成分，所以生物的生长期对目标产物的含量影响很大。如提取胸腺素，因幼年动物的胸腺比较发达，而老龄后胸腺逐渐萎缩，因此脑腺原料必须来自幼龄动物。
⑤合适的生理状态生物在不同生理状态时所含生化成分也有差异，如动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但因胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对收集胆汁则不利；从鸽肝中提取乙酰氧化酶时，先将鸽饥饿后取材可减少肝糖原的含量，以减少其对纯化操作的干扰。
2．天然生物材料的采后处理
天然生物材料采集后能及时投料最好，否则应采用一定的方式处理，其原因有三：①组织器官离体后其细胞易破裂并释放多种水解酶，引起细胞自溶导致目标产物失活或降解；②生物材料离体后易受微生物污染导致目标产物失活或降解；③生物材料离体后易受光照、氧气等的作用导致其分子结构发生改变。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降；胆汁在空气中久置，会造成胆红素氧化。因此，天然生物材料采集后需经过一些采后处理措施，一般植物材料需进行适当的干燥后再保存，动物材料需经清洗后速冻、有机溶剂脱水或制成丙酮粉在低温下保存。
3．生物产品的保存
生物物质制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，
使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。
⑴影响生物大分子样品保存的主要因素有：
①空气：空气中微生物的污染可使样品腐败变质，样品吸湿后会引起潮解变性，同时也为微生物污染提供了有利的条件。某些样品与空气中的氧接触会自发引起游离基链式反应，还原性强的样品易氧化变质和失活，如维生素C、巯基酶等。
②温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应、酶促反应进行的可能性大大增加。因此通常绝大多数样品都是低温保存，以抑制氧化、水解等化学反应和微生物的繁殖。
③水份：包括样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合，加速氧化、聚合、离解和霉变。
④光线：某些生物物质可以吸收一定波长的光，发生光催化反应如变色、氧化和分解等，尤其日光中的紫外线能量大，对生物物质影响最大。因此生物物质制成品通常都要避光保存。
⑤pH：保存液态生物物质制成品时注意其稳定的pH范围，通常可从文献和手册中查得或通过试验求得，因此正确选择保存液态生物物质制成品的缓冲剂包括种类、浓度十分重要。
⑥时间：生物物质和绝大多数商品一样都有一定的保存期限，不同的物质其有效期不同。因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。
⑵蛋白质和酶制品的保存方法
①低温下保存：多数蛋白质和酶对热敏感，通常超过35℃以上就会失活，冷藏于冰箱一般也只能保存1周左右，而且蛋白质和酶越纯越不稳定，溶液状态比固态更不稳定，因此通常要保存于－5℃～－20℃，如能在－70℃下保存则最为理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。还有少数酶对低温敏感，如过氧化氢酶要在0℃～4℃保存，冰冻则失活，羧肽酶反复冻融会失活等。
②制成干粉或结晶保存：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，－15℃下可保存8年。通常，酶与蛋白质含水量大于10％，室温低温下均易失活，含水量小于5％时，37℃活性会下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10％，抑制化学活性，含水量要小于3％。此外要特别注意酶在冻干时往往会部分失活。
③保存时添加保护剂：为了长期保存蛋白质和酶，常常要加入某些稳定剂：ⅰ惰性的生化或有机物质，如糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定的疏水环境；ⅱ中性盐，有一些蛋白质要求在高离子强度（1 mol/L～4mol/L或饱和的盐溶液）的极性环境中才能保持活性，
最常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)2SO4等，但使用时要脱盐；ⅲ巯基试剂，一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓慢氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。
总之，对生物产品的保存必须给以只够的重视，一些常用酶的保存条件可参见《生物化学制备技术》（苏拔贤主编）一书中的“一些酶保存的条件和稳定性”表，其他各种生物大分子和生物制剂的保存条件，可查阅有关的文献和酶学手册。
四、分离纯化的准备工作
对于某种生物物质的分离纯化工作，有时是以探索工艺技术路线和工艺开发为目的，主要是通过试验研究来找最佳分离纯化路线和筛选优化纯化工艺条件，其前期的准备工作主要是查阅有关文献，积累原材料和目标产物的理化、生物学性质特点等数据资料，设计试验方案，选择分离纯化适用的仪器设备、试剂和方法等；有时是在于为商业生产而提供大量合格的目标产物，其前期的准备工作主要是准备必要的操作文件、合格足量的原辅材料和工艺处理溶液、生产用器皿、容器、设备及其管道和对生产环境进行消毒灭菌处理等。因此，分离纯化的目的和任务不同，对准备工作的要求也有所差异。下面就其主要方面作一介绍。
1．软件条件的准备
⑴生产文件的准备在试验研究和工艺开发阶段，纯化前须起草书面的试验纯化步骤，纯化中详细记录纯化过程、各种参数和现象等；中试生产和常规生产必须准备包括各种操作指令、标准操作程序及配方、记录等技术文件，指令件文件须经有关责任人员签署批准。
⑵生产人员的培训各生产工序的操作人员必须经过培训，培训内容至少应包括纯化工艺涉及的基本原理、工艺流程、加工设备操作程序等。操作人员经过考核合格后方允许参加生产工作。
2．硬件条件的准备
⑴生产设施、仪器设备与器皿等①厂房与公用设施：包括生产用水、蒸汽、压缩空气及其输送管线、空气净化设施、层流罩与超净台等。②设备与器具：包括所使用的各种生物反应器如发酵罐、离心机、滤器、层析株、泵、容器、各类管线、塞盖、接头等辅助装置，检测用仪器、试剂、取样工具与样品瓶等。③凡厂房、公用设施与设备在生产开始前均应经过安装、运行与性能确认等验证程序，保证这些设施、设备与器具等在纯化工作开始前应处于良好的工作或备用状态。
⑵工艺处理液的准备绝大多数生物物质的分离纯化构成基本上是在液相中或液相与固相转换中进行的，在组织细胞破碎、目标成分释放溶出、提取物的澄清、浓缩与稀释、沉淀、吸附、离心、层析、脱盐和洗脱等加工处理中大多需要在适宜的液相中才能实现。因此，生物产品分离提纯过程需要使用多种溶液、试剂和去垢剂、酶类抑制剂等添加剂。为了保证分离纯化中不出现顾此
失彼，通常在分离纯化前均需将工艺中所用到的各种处理液事先准备好，各处理液的要求应遵循政府或行业制定的有关标准，暂无通行标淮的特殊溶剂应制订企业标准。
五、分离纯化的基本步骤
每一种生物物质在结构、理化性质、生物学性质上又千差万别，加之原材料的来源、终极产品的用途等也有所不同。因此，不同的生物物质有多种不同的分离纯化手段，即便是同一种物质，不同技术路线或生产线也可采取不同的分离纯化工艺。但大多数生物物质的分离纯化有一个基本框架，即常常按生产过程的顺序分为以下几个步骤。
1．原材料的预处理
其目的是将目标产物从起始原材料（如器官、组织或细胞）中释放出来，同时保护目标产物的生物活性。
2．颗粒性杂质的去除
由于技术和经济原因，在这一步骤中能选用的单元操作相当有限，过滤和离心是基本的单元操作。为了加速固－液两相的分离，可同时采用凝聚和絮凝技术；为了减少过滤介质的阻力，可采用错流膜过滤技术，但这一步对产物浓缩和产物质量的改善作用不大。
3．可溶性杂质的去除和目标产物的初步纯化
如果产物在滤液中，若要求通过这一步骤能除去与目标产物性质有很大差异的可溶性杂质，使产物浓度和质量都有显著提高。这常须经过一个复杂的多级加工程序，单靠一个单元操作是不可能完成的。这步可选的单元操作范围较广，如吸附、萃取和沉淀。
4．目标产物的精制
该步骤仅有限的几类单元操作可选用，但这些技术对产物有高度的选择性，用于除去有类似化学功能和物理性质的可溶性杂质，典型的单元操作有层析、电泳和沉淀等。
5．目标产物的成品加工
产物的最终用途和要求，决定了最终的加工方法，浓缩和结晶常常是操作的关键，大多数产品必须经过干燥处理，有些还需进行必要的后加工处理如修饰、加入稳定剂以保护目标产物的生物活性。
六、分离纯化技术的综合运用与工艺优化
生物物质的分离纯化一般由原材料的预处理、颗粒性杂质的去除、目标产物的初步纯化、精制和成品加工等若干工序组成连贯的工艺流程。但就生物物质本身特有的特点而言，到目前为止，还没有一种分离纯化设备和技术可以经过一步加工处理就分离纯化出符合要求的终极产品，一种合格生物产品是综合运用多种分离设备和技术加工纯化的结果。究其原因有：①在每个工序中根据现有
设备条件和目标产物的性质、规格、用途不同可以采用多种分离纯化手段；②每种分离纯化操作本身各项影响加工效果的因素如处理液的种类、浓度、离子强度和pH值，超速离心中介质种类与梯度的设置，层析中吸附与洗脱液的种类、离子强度、PH值、温度、吸附与洗脱时间等参数和操作条件等都直接影响分离纯化的效果和成本；③各工序间具有复杂的相互影响作用，前一工序加工产物的质量状况如盐浓度、颗粒杂质的存在等直接影响后一工序的处理，分离纯化时必须保证上一工序工艺处理条件和产物的质量适于下一工序的加工需要，后一工序对加工物料的专门要求决定前一工序加工产物必须符合一定的标准，如进入层析柱的物料应无颗粒性杂质，以防止其堵塞装填介质形成反向压力，这就要求用离心或过滤设备去除进料中的颗粒类杂质。因此，—种合格的生物产品是综合运用多种分离设备和技术加工纯化的结果。而一套成熟的分离纯化技术无论在大规模生产前、生产中都需结合当时的设备条件、市场情况、目标产物的性质、规格、用途等，从产物质量、收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出发，对分离纯化设备、加工手段、各工序之间的衔接以及影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进行优化。
1．建立在制品、半成品、成品的检测方法是工艺优化的前提
在生物产品分离纯化中建立在制品、半成品、成品的检测方法是分离纯化工艺优化的前提条件，也是分离纯化操作过程中的重要组成都分。在实际生产中根据在工艺里所起作用可将其分为在线检测、数据检测和放行检测等几类。在线检测是在工艺运行过程中通过对在制品取样并用适当仪器和方法测试样品相应指标、或通过安装在生产设备上的监测仪器(如感应探头等)直接检测加工物料或设备的有关数据，以了解工艺运行状况，并对其进行调整和控制。纯化过程中往往在进一步加工之前需要测试在制品的某些指标的具体数值，根据测得的数据进行计算，确定下一道工序的工艺参数后才能继续加工，这种检测即为数据检测。如某在制品进入层析工序前，可能需要测试其中目标产物的浓度，算出在制品中目标产物的总量，按照层析柱的加工容量和性能，决定是合需要对在制品进行浓缩或稀释、合并或分批，推算应该进入层析柱的在制品体积或目标产物的数量以及平衡、洗脱所需各工艺处理溶液的体积等。在一道分离纯化工序结束后，其产物是否可以进人下一道工序继续分离处理，应根据加工工艺的要求，对工序间在制品设定质量标准，抽样检验在制品有关质量指标，其结果符合标准后方允许在制品进入后一道工序继续加工，这种检测就是放行检测。
2．明确优化工艺的评判标准，处理好收率、纯度、经济性之间的平衡
许多技术经济指标，如产物收率、原料消耗、能原消耗、产品生产成本、设备投资、操作费用等均可作为优化工艺的评判标准。此外，环保、安全、占地面积等也是应考虑的主要因素，对于生物产品的分离纯化应重点处理好以下两个平衡。
⑴收率与纯度之间的平衡
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案
精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2 生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。
第九章 1.膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 2.膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类： 3.微滤（MF ）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.025~14μm 之间； 4.超滤（UF ）：分离介质同上，但孔径更小，为0.001~0.02 μm ，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；需要增加流体的静压力，改变天然过程的方向，才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜，此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差； 5.反渗透（RO ）：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.0001~0.001 μm 之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）；过程类似于超滤，只是纯溶剂通过膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作压力比超滤大得多。超滤和反渗透通常又被称之为“强制膜分离过程” 6.纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离300~1000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm ； 7.电渗析：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作； 8.渗透压的大小取决于溶液的种类、浓度和温度； 9.一般说来，无机小分子的渗透压要比有机大分子溶质的渗透压高得多。 第七章 1.色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。 流动相：指色谱过程中携带组分向前移动的物质。 固定相：指色谱过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面上的液体。 2.概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 3.分配系数，在凝胶色谱法中，分配系数表示凝胶颗粒内部水分中溶质分子所能达到的部分，故用一定的凝胶分离一定的溶质时，分配系数也为一常数。 4.阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比，意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 5.塔板理论可以给出在不同瞬间溶质在柱中的分布和各组分的分离程度与柱高之间的关系。所谓“理论塔板高度”是指这样一段柱高，自这段柱中流出的液体(流动相)和其中固定相的平均浓度平衡。设想把柱等分成若干段，每一段高度等于一块理论板。 理论塔板的计算方法： N---理论塔板数 t R --保留时间 c q K d =2 2/1)(54.5W t N R =2)(16b R W t N =N L H =
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
1．发酵液常用的固液分离方法有（离心）和（过滤）等。 2．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 3．阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为（强酸型），（弱酸型）和（中等强度）；其典型的活性基团分别有（磺酸基团），（羧基），（磷酸基）。 4．过饱和溶液的形成方式有：（饱和溶液冷却），（部分溶剂蒸发），（化学反应结晶法）和（解析法）。5．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 6．为使过滤进行的顺利通常要加入（惰性助滤剂）。 7．离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有（pH梯度）和（离子强度（盐）梯度）。 8．阴离子交换树脂按照活性基团分类，可分为（强碱型），（弱碱型）和（中等强度）；其典型的活性基团分别有（季氨基）、（伯、仲、叔氨）、（强弱基团都具备）。 9．多糖基离子交换剂包括（葡聚糖离子交换剂）和（离子交换纤维素）两大类。 10．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 11．常用的化学细胞破碎方法有（渗透冲击），（酶消化法），（增溶法），（脂溶法）和（碱处理法）。12．DEAE Sepharose是（阴）离子交换树脂，其活性基团是（二乙基氨基乙基）。 13．影响离子交换选择性的因素有（离子化合价），（离子水化半径），（溶液浓度），（离子强度），（溶液的pH值），（有机溶剂），（树脂物理结构）和（辅助力）。 14．CM Sepharose是（阳）离子交换树脂，其活性基团是（羧甲基）。 15．工业离心设备从形式上可分为（管式），（套筒式），（碟片式），等型式。 16．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 17．工业上常用的超滤装置有（板式），（管式），（螺旋卷式）和（中空纤维式）。 18. 影响吸附的主要因素有（吸附剂的性质），（吸附质的性质），（温度），（溶液pH值），（盐浓度）
生物分离与纯化技术模拟试卷九答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．离心分离技术：是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。 2．物理萃取：即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 3．有机聚合物沉析：利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而析出的分离技术称为有机聚合物沉析。 4．平衡离子：离子交换树脂中与功能基团以离子键联结的可移动的平衡离子，亦称活性离子。 5．离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．葡聚糖凝胶可使用那种溶剂溶胀（C ） A.甲醇 B 乙醇 C.缓冲液 D.乙酸乙酯 2．不能用于固液分离的手段为（C ） A.离心 B 过滤 C.超滤 D.双水相萃取 3．最常用的干燥方法有（ D ） A 、常压干燥 B 、 减压干燥 C 、喷雾干燥 D 、以上都是 4．物理萃取即溶质根据（ B ）的原理进行分离的 A.吸附 B.相似相溶 C 分子筛 D 亲和 5．适合小量细胞破碎的方法是（ B ） A.高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 6．关于分配柱层析的基本操作错误(D )。 A 装柱分干法和湿法两种 B 分配柱层析法使用两种溶剂，事先必须先使这两个相互相饱和 C 用硅藻土为载体，需分批小量地倒入柱中，用一端是平盘的棒把硅藻压紧压平 D 分配柱层析适用于分离极性比较小、在有机溶剂中溶解度大的成分，或极性很相似的成分。 7．颗粒与流体的密度差越小，颗粒的沉降速度（ A ） A.越小 B.越大 C.不变 D.无法确定 8．“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（ B ） A ．极性溶剂 B ．非极性溶剂 C ．水 D ．溶剂 9．关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是： （ A ） A 、最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。 B 、对弱酸性物质可用碱来解吸。 C 、对弱碱性物质可用酸来解吸。 D 、如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。 10．亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ D ） A 、 阴性洗脱 B 、剧烈洗脱 C 、正洗脱 D 、负洗脱 11．下列哪一项不是常用的滤布材料 （ C ） A. 法兰绒 B. 帆布C. 滤纸 D.斜纹布 12．阴树脂易受有机物污染，污染后，可用（ B ）处理 A 柠檬酸 B 10%NaCl+2%～5%NaOH 混合溶液 C 氨基三乙酸 D EDTA 13．HPLC 是哪种色谱的简称（ C ）。 A ．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 14．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A ．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 15．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用 （ A ） A 、分离量大分辨率低的方法 B 、分离量小分辨率低的方法 C 、分离量小分辨率高的方法 D 、各种方法都试验一下，根据试验结果确定 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞内产物释放到水相中去。（√ ） 2．向含有生化物质的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能使生化物质沉淀析出。（√ ） 3．等电点沉淀在实际操作中应避免溶液pH 上升至5以上。（√ ） 4．在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS ），影响凝胶的形成。（× ） 5．当气体的温度超过其临界温度，压力超过临界压力之后，物质的聚集状态就介于气态和液态之间，成为超临界流体。（√ ） 6．冻结-融化法冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性来破坏细胞的。（√ ） 7．盐析作用也能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（√ ） 8．氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等两性物质可用等电点沉析。（√ ） 9．甲醇沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质的变性作用比乙醇、丙酮都小，所以应用广泛。（×） 10．若两性物质结合了较多阳离子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+等），则等电点pH 升高。（√ ）
选择题： 1．HPLC是哪种色谱的简称（）。 A．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（）。 A.凝胶过滤 B.离子交换层析 C.亲和层析 D.纸层析 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（） A.蛋白产量最高 B.酶活力单位数值很大 C.比活力最高 D.Km最小 5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 7．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C.凝胶过滤色谱 D.反相色谱 8．适合小量细胞破碎的方法是（） 高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 9．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH 到等电点 10．蛋白质分子量的测定可采用（）方法。 A．离子交换层析 B.亲和层析 C.凝胶层析 D.聚酰胺层析 11．基因工程药物分离纯化过程中，细胞收集常采用的方法（） A．盐析 B.超声波 C.膜过滤 D.层析 12．离子交换剂不适用于提取（）物质。 A．抗生素 B.氨基酸 C.有机酸 D.蛋白质 13．人血清清蛋白的等电点为4.64，在PH为7的溶液中将血清蛋白质溶液通电，清蛋白质分子向（） A ：正极移动；B：负极移动；C：不移动；D：不确定。 14．蛋白质具有两性性质主要原因是（） A：蛋白质分子有一个羧基和一个氨基；B：蛋白质分子有多个羧基和氨基；C：蛋白质分子有苯环和羟基；D：以上都对 15．使蛋白质盐析可加入试剂（） A.氯化钠； B.硫酸； C.硝酸汞； D.硫酸铵 16．凝胶色谱分离的依据是（）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 17．非对称膜的支撑层（）。 A、与分离层材料不同 B、影响膜的分离性能 C、只起支撑作用 D、与分离层孔径相同 18．下列哪一项是强酸性阳离子交换树脂的活性交换基团（） A 磺酸基团（-SO3 H） B 羧基-COOH C 酚羟基C6H5OH D 氧乙酸基-OCH2COOH 19．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同。树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（）。 A、Fe3+﹥Ca2+﹥Na+ B、Na+﹥Ca2+﹥Fe3+ C、Na+﹥Rb+﹥Cs+ D、Rb+﹥Cs+﹥Na+ 20．乳化液膜的制备中强烈搅拌（）。
我国制药分离纯化技术现状和发展方向 引言：制药工业关系国计民生。一种好的药品，不仅能治疗疾病，而且能够提高国民的身体素质。大千世界，形形色色的动植物，不计其数的化合物，想要从里面找到能够制成药物的有效成分是一件困难的工作。由于药物的纯度和杂质含量与其药效、毒副作用、价格等息息相关，使得分离过程在制药行业中的地位和作用非常重要。因此，制药分离纯化技术在制药工业中具有举足轻重的地位。 一、现状 制药分离过程主要利用待分离的物质中的有效活性成分与共存杂志之间在物理、化学及生物学性质上的差异进行分离，是一个复杂的过程。 近年来，我国的医药产业虽然得了比较大的发展，但是在制药过程上并没有取得重大突破，与发达国家仍有很大的差距。其原因是多方面的，但最主要的原因来自于生产过程中的工艺技术和装备问题，药品提取分离纯化过程作为医药生产过程中最关键的环节，自然而然的成为了首要原因。 目前，在我国制药领域，很多先进的提取分离纯化技术已经得到了发展和应用，但是仍然没有成为制药过程中的主导工艺，依然是以传统落后的提取技术为主导，在制药过程中存在着提取分离技术装备简单，工艺流程单一等缺陷。我国目前的分离提取技术还存在很多不足。设计和开发出一个新的生产系统和设备，显得尤为迫切。 制药提取分离技术及其装备关系到三个问题：(1)能否最大限度
地从药材中提取有效成分，但是保证无用的物质不能被同时转移。(2)能否尽量使所提取物质的量相对平均；(3)能否在尽量满足最大产能的情况下，把成本降到最低。简单来说是产率、工艺条件稳定和效率三个问题。这些问题如果能得到有效的解决，就能为后续生产环节制提供良好的生产环境，实现提高生产质量的最终目的，目前，我国大部分所使用的传统提取工艺和装备都难以解决以上的几个问题，生产中仍然以传统落后的工艺技术和装备为主导，提取生产过程中的装备陈旧、工艺流程单一，集成优化和高效节能的成套装备虽然已经开发出来，但是并没有得到广泛应用，因此，充分利用各种先进的提取分离纯化技术，先进的装备的优势以及自动化控制与在线检测系统的优势，开发出先进、适用的中药提取分离技术流程，并使其得到推广和广泛的应用。 传统的分离纯化方法主要有水提醇沉法(水醇法)、醇提水沉法(醇水法)、酸碱法、盐析法、离子交换法和结晶法等。新的分离纯化方法主要有絮凝沉淀法、大孔树脂吸附法、超滤法、高速离心法等。这些新技术的推广应用，降低了生产成本、提高了产品质量，推动了医药的现代化进程，为我国的医药行业走向国际市场奠定了基础。 二、发展方向 我国的医药生产水平与世界先进的药物提取水平差距甚大，影响了我国医药产品在世界药品市场的地位。中国已经加入WTO，国内医药生产企业要想在竞争中赢得主动，必须采用先进的提取分离技术，才可能使我国医药产品生产和销售在国际市场占有更多的份额，
现代生物分离技术及其应用举例生物物质的分离（Bioseparation）是生物工程的一个重要部分。国外文献中，常称之为下游过程（Downstream Process），国内则称之为产品的分离或回收。其目的是把生物反应液，如发酵液或酶反应液内的有用物质分离出来，获得所需的目标成品。 不同的生物产物，其溶解度、分子大小、形状、极性、电荷性质、专一结合位点等理化和生物学性质有或大或小的差异，所以采用适当的分离技术可将其分离纯化。 根据分离过程的基本原理，分离可分机械分离和传质分离两大类。机械分离的对象是非均相物系，是依据物质相态的不同（例如液体、固体），以及依据物质大小、密度的差异进行分离，如过滤、重力沉淀和离心降解等。传质分离的对象主要是均相物系，通常是溶液，可分为速度分离和平衡分离两种。速度分离根据物质溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离，亦可称为输送分离，其传质推动力主要有压力差、电位梯度和磁场梯度等，如滤超、反渗透、电渗析、电泳和磁泳等；平衡分离则根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离，又称扩散分离法，其传质推动力为偏离平衡态的活度差或浓度差，如蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、吸附和离子交换等。对于特定的目标产物，应根据其自身的性质以及共存杂质的特性，选择适宜的分离方法，以
获得最佳分离效果。即在保证目标产物的生物活性不受（或少受）损伤的同时，达到所需的纯度和对回收率的要求，并使回收过程成本最小，以适应大规模工业生产需求。 生物工艺中目前常用的生物分离提纯原理及方法如下表所示： 分离提纯原理分离纯化方法分离对象举例 溶解度的差异 分配系数的差异 分子大小和形状的差异 电荷性质的差异盐析法、等电点沉淀 法、有机溶剂沉淀法、 PEG沉淀法 有机溶剂萃取法、双水 相萃取法、反胶束萃取 法、液膜萃取法、超临 界流体萃取法 离心过滤法、离心沉降 法、超离心法、微滤法、 超滤法、纳滤法、透析 法、凝胶过滤法 离子交换层析法、电泳 法、色谱聚焦法、等电 聚焦法 蛋白质 有机酸、氨基酸、 抗生素、蛋白质、 香料、脂质 菌体、菌体碎片、 细胞、细胞碎片、 蛋白质、核酸、 糖类 蛋白质、氨基酸、 核酸
总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。 萃取分离法 溶剂萃取法原理： 利用物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同而进行的分离 设法使一种溶解于液相的物质传递到另一液相的操作 pH影响分配系数-表观分配系数 双水相萃取原理：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程 反胶束萃取原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。 超临界萃取原理：当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：流体的密度接近于液体的密度,粘度接近于气体；在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感； 固相析出分离法 盐析法原理： 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。 破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。 有机溶剂沉淀法原理： 1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 等电点沉淀法原理： Pl时分子表面静电荷未零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。 成盐沉淀法原理： 1.金属离子沉淀 所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。 蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。 分离沉淀→复合物分解→除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA） 2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。 亲和沉淀法原理：
生物分离与纯化技术模拟试卷十一答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．盐析：是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度的差异，向溶液中加入一定量的中性盐，使原溶解的物质沉淀析出的分离技术。 2．洗脱：利用适当的溶剂，将树脂吸附的物质释放出来，重新转入溶液的过程。 3．树脂的再生：就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程，树脂的再生反应是交换吸附的逆反应。 4．疏水层析：是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行分离纯化的层析技术。 5．过滤介质：是指能使固一液混合料液得以分离的某一介面，通常指滤布或膜过滤中所用的膜。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．微滤膜所截留的颗粒直径为( A ) A 0.02～10μm B 0.001～0.02μm C <2nm D < 1nm 2．关于分配柱层析的基本操作错误(D )。 A 装柱分干法和湿法两种 B 分配柱层析法使用两种溶剂，事先必须先使这两个相互相饱和 C 用硅藻土为载体，需分批小量地倒入柱中，用一端是平盘的棒把硅藻压紧压平 D 分配柱层析适用于分离极性比较小、在有机溶剂中溶解度大的成分，或极性很相似的成分。 3．在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量 （ C ） A ．羟型阴 B ．氯型阴 C ．氢型阳 D ．钠型阳 4．下列哪项不是常用的树脂再生剂（ D ） A 1％～10％HCl B H2S04、 C NaCl 、 D 蒸馏水 5．亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作 （ C ） A 、 阴性洗脱 B 、 剧烈洗脱 C 、竞争洗脱 D 、非竞争洗脱 6．活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强？ （ A ） A 、水 B 、甲醇 C 、乙醇 D 、三氯甲烷 7．在一定的pH 和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作 ( A ) A 、KS 盐析法 B 、β盐析法 C 、重复盐析法 D 、分部盐析法 8．在超滤过程中，主要的推动力是 （ C ） A 、浓度差 B 、 电势差 C 、压力 D 、重力 9．在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是 （A ） A 、粗且长的 B 、粗且短的 C 、细且长的 D 、细且短的 10．如果用大肠杆菌作为宿主细胞，蛋白表达部位为周质，下面哪种细胞破碎的方法最佳？ （ C ） A.匀浆法 B.超声波法 C. 渗透压休克法 D. 冻融法 11．盐析法与有机溶剂沉淀法比较， 其优点是（ B ） A ．分辨率高 B ．变性作用小 C ．杂质易除 D ．沉淀易分离 12．磺酸型阳离子交换树脂可用于分离（E ） A 、强心苷 B 、有机酸 C 、醌类 D 、苯丙素 E 、生物碱 13．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（ C ） A ．离子交换色谱 B ．亲和色谱 C ．凝胶过滤色谱 D ．反相色谱 14．洗脱体积是（C ）。 A 、凝胶颗粒之间空隙的总体积 B 、溶质进入凝胶内部的体积 C 、与该溶质保留时间相对应的流动相体积 D 、溶质从柱中流出时所用的流动相体积 15．下列细胞破碎的方法中，哪个方法属于非机械破碎法( A ) A.化学法 B. 高压匀浆 C. 超声波破碎 D.高速珠磨 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．伯胺基在pH<7的溶液中使用。（√ ） 2．阴树脂易受有机物污染，可用有机溶剂浸泡或淋洗。（× ） 3．吸附力较弱的组分，有较低的Rf 值。（× ） 4．凝胶柱层析可进行生物大分子分子量的测定。（√ ） 5．等密度梯度离心中，梯度液的密度要包含所有被分离物质的密度。（√ ） 6．疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液（√ ） 7．采用溶剂提取法提取中草药有效成分时，选择溶剂的原则是“相似相溶原则”。 （ √ ） 8．丙酮，介电常数较低，沉析作用大于乙醇，所以在沉析时选用丙酮较好。（×） 9．中性多糖类药物常用水作溶剂来提取，也可用水浸煮，也可以用冷水浸提。（ ∨ ） 10．有机溶剂（如胍、乙醇、尿素和异丙醇等）可以削弱疏水分子间的相互作用。可以用于任何规模的细胞破碎。（√ ）
生物物质分离 一、名词解释 1. 盐析：是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度的差异，向溶液中加入一定量的中性盐， 使原溶解的物质沉淀析出的分离技术? 2. 亲和层析：是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。 3. 萃取：利用溶质在互不相溶的两相中溶解度（或分配系数）的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。 2.预处理及固液分离 （1 ）发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？ 目的： 1）改变发酵液的物理性质，提高从悬浮液中固形物沉降的速率； 2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液相）， 3）去处发酵液中部分杂质，以便后续工序的顺利进行。 方法：①加热法：②调节悬浮液的pH值,；③凝聚和絮凝；④使用惰性助滤剂。 2、绘制结晶过程中饱和曲线和过饱和曲线图，并简述其意义。 结晶过程中的饱和温度曲线和不饱和温度曲线的简图如下图所示： S-S曲线为饱和温度曲线，在其下方为稳定区，在该区域溶液为不饱和溶液，不会自发 结晶； T-T曲线为过饱和温度曲线，在其上方为不稳定区，能够自发形成结晶； S-S曲线和T-T曲线之间为亚稳区，在该区域，溶液为过饱和溶液，但若无晶种存在，也不能自发形成晶体。 二、填空题 1、高效液相色谱分离方法中，液-液色谱是以_液体_作为流动相；以_固定在固 相载体表面的液体_______ 作为固定相。 2、完整的萃取操作过程一共分三个步骤，分别为萃取，洗涤和反萃取 3、离子交换树脂的组成：载体，活性基团和可交换离子。 4、根据分离机理的不同，色谱法可分为吸附色谱，分配色谱，离子交换色谱，凝胶色谱。 5、双相电泳中，第一相是 6、物料中所含水分可分等电凝胶；第二相是凝胶电泳。 化学结合水，物理结合水，机械结合水三种； 7、电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是—引发剂________________ ;甲叉双丙 烯酰胺的作用是交联剂__________ ；TEMED勺作用是_增速剂____________ 。 9、简单地说，离子交换过程实际上只有_外部扩散，内部扩散，化学交换反应_三个步 骤。 10、电泳过程中，加入溴酚兰的目的是_指示蛋白的迁移位置_。 11、吸附剂按孔道结构区分—多孔型___________ 介质和—凝胶—介质。 12、常用的工业起晶方法：自然起晶法、刺激起晶、晶种起晶法
生物分离与纯化技术模拟试卷五答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．离心沉降：利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离 2．固相析出技术：利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 3．乳化液膜系统：乳化液膜系统由膜相、外相和内相三相组成，膜相由烷烃物质组成，最常见的外相是水相，内相一般是微水滴。 4．反相色谱：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 5．等电点：是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH 值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．在蛋白质初步提取的过程中，不能使用的方法（C ）。 A 、双水相萃取 B 、超临界流体萃取 C 、有机溶剂萃取 D 、反胶团萃取 2．离子交换法是应用离子交换剂作为吸附剂，通过（A ）将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上。 A 、静电作用 B 、疏水作用 C 、氢键作用 D 、范德华力 3．丝状（团状）真菌适合采用（A ）破碎。 A 、珠磨法 B 、高压匀浆法 C 、A 与B 联合 D 、A 与B 均不行 4．真空转鼓过滤机工作一个循环经过（A ）。 A 、过滤区、缓冲区、再生区、卸渣区 B 、缓冲区、过滤区、再生区、卸渣区 C 、过滤区、缓冲区、卸渣区、再生区 D 、过滤区、再生区、缓冲区、卸渣区 5．阴离子交换剂（C ）。 A 、可交换的为阴、阳离子 B 、可交换的为蛋白质 C 、可交换的为阴离子 D 、可交换的为阳离子 6．凝胶色谱分离的依据是（B ）。 A 、固定相对各物质的吸附力不同 B 、各物质分子大小不同 C 、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D 、各物质与专一分子的亲和力不同 7．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同。树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（A ）。 A 、Fe3+>Ca2+>Na+ B 、Na+ >Ca2+> Fe3+ C 、硫酸根>柠檬酸根>硝酸根 D 、硝酸根>硫酸根>柠檬酸根 8．乳化液膜的制备中强烈搅拌（B ）。 A 、是为了让浓缩分离充分 B 、应用在被萃取相与W/O 的混合中 C 、使内水相的尺寸变小 D 、应用在膜相与反萃取相的乳化中 9．盐析法纯化酶类是根据（ B ）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 10．以下哪项不是颗粒在离心力场中受到的力（ C ） A.离心力 B. 向心力 C.重力 D. 阻力 11．关于精馏回流比控制，对于一定的分离任务，以下正确的两项是（A ） A 、若回流比变大，则精馏能耗增大； B 、若回流比变大，则精馏能耗减小； C 、若回流比变大，则所需理论塔板数变大； D 、若回流比变小，则所需理论塔板数变小。 12．其他条件均相同时，优先选用那种固液分离手段（B ） A. 离心分离 B 过滤 C. 沉降 D.超滤 13．蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（A ）范围内适合。 A. 0.5％～2％ B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 14．超滤技术常被用作（C ） A. 小分子物质的脱盐和浓缩 B 小分子物质的分级分离 C. 小分子物质的纯化 D.固液分离 15．通过改变pH 值从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来，可使用（A ） A. 阳离子交换剂一般是pH 值从低到高洗脱 B 阳离子交换剂一般是pH 值从高到低洗脱 C. 阴离子交换剂一般是pH 值从低到高 D. 以上都不对 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．溶剂萃取中的乳化现象一定存在。（×） 2．用冷溶剂溶出固体材料中的物质的方法又称浸煮。（× ） 3．在生物制剂制备中，常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液；碳酸盐缓冲液；盐酸盐缓冲液；醋酸盐缓冲液等。（× ） 4．蛋白质变性，一级、二级、三级结构都被破坏。（× ） 5．不同高分子化合物的溶液相互混合可形成两相或多相系统，如葡聚糖与聚乙二醇（PEG ）按一定比例与水混合后，溶液先呈浑浊状态，待静置平衡后，逐渐分成互不相溶的两相，上相富含PEG ，下相富含葡聚糖。（√ ） 6．离子交换剂可以分为3部分：高分子聚合物基质、电荷基团和被交换离子。（× ） 7．由于pH 值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱（√ ） 8．盐析一般可在室温下进行，当处理对温度敏感的蛋白质或酶时，盐析操作要在低温下（如0℃～4℃）进行。 （√ ） 9．采用凝胶过滤分离蛋白质主要取决于蛋白质分子的大小，先将蛋白质混合物上柱然后进行洗脱，小分子的蛋白质由于所受排阻力较小首先被洗脱出来。( × ) 10．树脂使用后不可再回收。（×）
（生物科技行业）生物分离与纯化技术复习重点
生化分离技术复习重点 1.生化分离，生化分离技术的基本步骤 生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。 来源：（1）动物脏器（2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物 特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高 基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作 2.吸附技术 概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术 吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换） 常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙‘氢氧化铝等。 活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸
附力大于相对分子质量小的化合物。 影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）、溶剂的影响。 3.膜分离技术 概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。 类型：渗析；电渗析；微滤；超滤；反渗透；纳滤；气体分离 微孔滤膜清洗和再生方法：将滤膜平放于清洁盛器内，用60℃左右的蒸馏水浸泡，使全部湿润，数小时候（约4小时以）倾去水，再用上法浸泡12小时，使用前再用适量温蒸馏水清洗一次。 微孔滤过膜截留粒子的范围：0.1—10μm的粒子。 4.液膜分离技术 概念：是一种以液膜为分离介质，以浓度差为推动力的分离操作，是属于液—液系统的传质分离过程。 组成：膜溶剂；表面活性剂；流动载体；膜增强剂。 分类：乳状液膜；支撑液膜。 液膜分离步骤：制备液膜；液膜萃取；澄清分离；破乳。 影响因素：液膜乳液成分的影响；乳水比；连续的PH；搅拌速度的影响；料液的浓度和酸度的影响；操作温度的影响；接触时间。应用：分离氨基酸；提取抗生素；提取生物碱；提取蛋白质；分离