(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910118948.X (22)申请日 2019.02.18 (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南 路1023号-1063号 (72)发明人 李玉华 胡宇行 常宁 贺艳杰 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 范盈 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 不同位点白血病MEF2D-BCL9融合基因寡核 苷酸的检测方法及检测试剂盒 (57)摘要 本发明是一种用于检测不同位点白血病 MEF2D -BCL9融合基因检测方法及试剂盒，包括检 测体系PCR反应液、引物对、探针、阳性对照品和 阴性对照品。利用实时荧光PCR中的Taqman探针 技术检测患者体内MEF2D -BCL9融合基因的表达 情况以及对高危人群进行较为准确的筛查和鉴 定，具有特异性好，灵敏度高，方法简便高效的特 点。 权利要求书2页 说明书7页序列表3页 附图2页CN 109593861 A 2019.04.09 C N 109593861 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109593861 A 1.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的检验试剂盒，所述检验试剂盒中包括检测用引物、探针，其特征在于： 检测目的基因用上下游引物分别为：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中， 序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 221-1055-F:GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.10 221-1055-R：ACCTGAAATTCGAGGATTCTGTGT SEQ ID No.11 221-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCCCTGTTGGAA-BHQ1 SEQ ID No.12 ABL1-F:GTGAGTGACATAGCCTCATGTTC SEQ ID No.13 ABL1-R:GCAGGCGTGCTCGTGAAAT SEQ ID No.14 ABL1-Probe:Quasar670-TCAGGGAGGGTTAGGAAAACCAC-BHQ-plus SEQ ID No.15。 2.根据权利要求1所述的检验试剂盒，所述检验试剂盒中还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照品为含有MEF2D-BCL9 Variant 1，MEF2D-BCL9 Variant 2，MEF2D-BCL9 Variant 3，MEF2D-BCL9 Variant 4；所述阴性对照品为去离子水。 3.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的引物和探针组合物，所述的引物和探针组合物包括：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中，序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 2
中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南(完整版) 成人急性淋巴细胞白血病(ALL)是最常见的成人急性白血病之一，约占成人急性白血病的20%~ 30%，目前国际上有比较统一的诊断标准和不同研究组报道的系统治疗方案，完全缓解(CR)率可达70%~90%，3~5年无病生存(DFS)率达30%~60%[1]；美国癌症综合网(NCCN)于2012年首次公布了ALL的诊断治疗指南，我国于2012年发表我国第1版成人ALL 诊断与治疗的专家共识[2]，得到了国内同行的认可。最近2016版WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类[3]发表，对于ALL的分类有一些更新，提出了一些新概念；NCCN对于成人ALL的临床指南也先后几次修改[4]。基于此，对我国成人ALL诊断与治疗的专家共识进行了更新。 一、诊断分型 (一)概述 ALL诊断应采用MICM(形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学)诊断模式[5]，诊断分型采用WHO 2016标准。最低标准应进行细胞形态学、免疫表型检查，以保证诊断的可靠性；骨髓中原始／幼稚淋巴细胞比例≥20％才可以诊断ALL；免疫分型应采用多参数流式细胞术，最低诊断分型可以参考1995年欧洲白血病免疫学分型协作组(EGIL)标准(表1)[6]，疾病分型参照WHO 2016版分类标准[3]。同时应除外混合表型急性白血病，混合表型急性白血病的系列确定建议参照WHO 2008造血及淋巴组织肿瘤分类的标准(表2)，可以同时参考1998 EGIL标准(表3)[7]。
表1 急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫学分型(EGIL，1995) 表2 混合表型急性白血病的WHO 2008诊断标准 表3 双表型急性白血病的诊断积分系统(EGIL, 1998)
白血病融合基因Last revision on 21 December 2020
bcr/abl融合基因 慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。 基因结构 人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2-11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。abl主要结构有N 端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。abl蛋白参与细胞周期调节。在G0期，abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S期。 bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1-63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。CML的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。bcr基因在ALL中大约2/3为m-BCR位点。Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML 和非典型CML的诊断指标。
什么是浆细胞白血病 浆细胞白血病（PCL）临床上分为原发性浆细胞白血病和继发性浆细胞白血病。原发性浆细胞白血病是一种独立细胞类型的白血病，其特征为异常白细胞广泛浸润，可遍及全身各组织，并常伴有出血和淀粉样变，引起脏器肿大或功能障碍，临床表现有贫血、高热、皮肤及黏膜出血，多脏器浸润，肝、脾肿大，若病变侵犯胸膜，可有胸水，胸水内可见大量浆细胞，若侵犯心脏可发生心律紊乱、心力衰竭等。继发性浆细胞白血病主要来自多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症等，其白血病病理改变和临床表现与原发性浆细胞白血病基本相似。 1、血象：大多数病例有中度贫血，多为正细胞正色素性贫血，少数是低色素性，白细胞总数多升高，可达（10～90）×109／L，包括原始和幼稚浆细胞，形态异常。血小板计数多减少。 2、骨髓象：骨髓增生极度活跃或明显活跃，医学|教育网各阶段异常浆细胞明显增生，包括原浆细胞、幼浆细胞、小型浆细胞和网状细胞样浆细胞。浆细胞成熟程度和形态极不一致，形态一般较小，呈圆形或卵圆形，胞核较幼稚，核仁明显，核染色质稀疏，核质发育不平衡。 3、免疫学检验：除具有浆细胞相关抗原外，还可有早期B细胞和相关抗原，如CD10、CD20及膜表面免疫球蛋白（SmIg）。 4、其他：血沉明显增高。血清中出现异常免疫球蛋白，以IgG、IgA型多见。多数病人尿本-周氏蛋白阳性。血清β2-微球蛋白及LDH水平明显升高。骨骼X片有半数病人可见骨质脱钙及溶骨现象。 根据国内诊断标准对其进行诊断，具体如下： ①临床上呈现白血病的临床表现或多发性骨髓瘤的表现。 ②外周血白细胞分类中浆细胞＞20%或绝对值≥2.0×109／L。 ③骨髓象浆细胞明显增生，原始与幼稚浆细胞明显增多，伴形态异常。
如有侵权请联系网站删除 精品资料荧光PCR仪检测平台：叶酸能力代谢基因检测 一、叶酸能力代谢基因检测的临床意义： 1、提前预防脑卒中，降低脑卒中发生率和死亡率 大量研究数据显示：亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因型变异是导致我国人群脑卒中高发最主要的遗传危险因素。 MTHFR基因的多个位点在人群中具有多态性，其中与功能和疾病最为相关的是C677T位点多态性。在MTHFR基因第677个核苷酸位置，其碱基可发生胞嘧啶（C）向胸腺嘧啶（T）的突变，MTHFR酶的活性逐级降低（CC型活性为100%，CT型活性为70%，TT型活性为35%），引起同型半胱氨酸在人体内不同程度的蓄积，破坏全身血管，从而形成”H型高血压”，导致卒中风险比一般人高出11-28倍。因此提前检测与脑中风最相关的基因MTHFR677C/T基因对预防脑卒中，提前进行干预治疗，从而降低脑卒中的发病率，有着非常重要的意义。 2、提前预防新生儿出生缺陷，提高我国人口素质 神经管畸形，唇腭裂等是常见的新生儿缺陷。出生缺陷不仅影响儿童的生命健康和生活质量，而且给患者家庭带来巨大的精神痛苦和经济负担。而大量的研究表明MTHFR677C/T基因突变会导致孕妇体内同型半胱氨酸升高，从而导致孕妇早产、低出生体重儿、新生儿神经管畸形、唇腭裂等。因此提前检测与孕妇早产，新生儿出生缺陷相关基因，提前进行干预治疗，从而降低新生儿出生缺陷以及孕妇早产，对提高我国人口素质，降低国家和家庭负担方面有着重要的意义。二、检测试剂盒介绍及优势 采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、对MTHFR 基因C677T 位点多态性进行定性检测：首先从EDTA 抗凝的全血中提取基因组DNA，在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光利用探针可与DNA模板特异性结合的特点，通过报告荧光的不同来分辨出样本的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因型，最后通过电脑软件自动计算给出结果，区分该基因位点的野生型（CC）、杂合型（CT）和纯合突变型（TT）。 基因多态性检测试剂盒优势： 1.灵敏度高：可以对低至1ng的DNA模板准确的进行基因多态性检测；
一、Ph染色体相关白血病的检测 Ph染色体最初在慢性粒细胞性白血病（CML）中发现，其发生率达到90%以上，成为慢粒的细胞遗传学标志。该染色体是由于第9号染色体长臂3区4带（9q34）和22号染色体长臂1区1带（22q11）相互易位所致，其后果使位于9q34的原癌基因C-ABL和位于22q11的BCR基因发生融合，形成BCR-ABL融合基因，并表达为BCR-ABL融合mRNA，翻译成融合蛋白质。20世纪70年代以来，在部分急性淋巴细胞白血病（ALL）中也发现有Ph染色体，占ALL的5%（儿童）～25%（成人）。近年来由于PCR技术的不断发展，对Ph染色体阳性白血病的诊断和残留白血病细胞的检测有了很大的进展。 应用筑巢式逆转录酶/多聚酶链反应技术（RT/PCR）检测BCR—ABL融合基因转录本，发现了3种BCR-ABL异构体，这种异构体的形成是由于BCR基因断裂点的位置不同所致。慢粒患者在BCR基因的断裂点主要集中于经典的bcr区域，即M-BCR区域，而伴有Ph染色体急性白血病中，约50%的患者BCR基因断裂点与慢粒患者相同，而另50%患者的断裂点位于BCR 基因的第1个内含子，ABL基因的断裂点主要位于第1或第2个内含子，第22号染色体的断裂点位于M-BCR2内含子，即M-BCR第二外显子与ABL基因第二个外显子相融合（简称b2a2转录本）。如果断裂点于M-BCR第三外显子即形成b3a2转录本，如果BCR基因的断裂点位于基因的第一内含子，则形成e1a2转录本，后者主要见于Ph染色体阳性的急性白血病患者。 二、急性早幼粒细胞性白血病的检测 急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中95%以上具有特异的染色体易位t（15；17）（q22；q21），易位的结果使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维A酸受体α（RARα）基因形成PML-RARα融合基因转录本。由于该融合基因对APL具有高度特异性，因此可以作为APL诊断的分子标志。近年来各国科学家有在少数APL患者中陆续发现了变异型染色体易位t（5；7）、t（11；17）、dup（17）形成的NPM-RARα、PLZF-RARα、NμMA-RARα、STATSB-RARα融合基因，这对进一步研究APL的发生机制具有重要意义。同时在APL患者的鉴别诊断和治疗上具有积极的意义。 三、急性粒细胞性白血病（M2b）的检测 急性粒细胞性白血病（M2b）型患者中90%存在特异的t（8；21）（q22；q22）染色体易位，伴该染色体易位的白血病细胞具有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性和嗜酸性细胞，且对化疗反应较敏感。目前已经发现该染色体易位使8号染色体的ETO/MTG基因和21号染色体的AML1基因融合形成AML1-ETO融合基因，从而导致产生AML1-ETO嵌合转录子，这种异常转录因子有可能参与造血系统恶性肿瘤的发生，因此检测该融合基因转录本对急性粒细胞性白血病（M2b）型患者的诊断、微小残留病变监测等具有重要意义。 四、AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv（16）导致CBF-MHY11融合基因的检测 近年来的研究发现在AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv(16)（p13；q22）的结果使16号染色体长臂的CBF（核心结合因子）β链基因和短臂的MYH11基因发生融合，形成两种形式的融合基因，即CBFβ-MHY11和MHY11-CBFβ融合基因，其中前者对M4Eo的致病可能更为重要。研究结果提示CBFβ基因的断裂点恒定于靠近3′端编码区的17个氨基酸处，而MYH11基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，同进这些重排仍然保持融合基因转录本的开放阅读框架。与其他类型的白血病发生的分子机制相似，CBFβ-MYH11融合蛋白的产生将促使白血病的发生。特别有意义的是，本型白血病中的inv（16）与急性粒细胞性白血病（M2b）型中的t（8；21）（q22；q22）染色体易位分别累及CBFα和β链，进一步说明了转录因子异常在白血病发病机制中的特殊地位。 与用PCR检测CBFβ-MYH11融合基因时，必须检测所有可能的CBFβ-MYH11融合基因转录
中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南（2016年版） 成人急性淋巴细胞白血病（ALL）是最常见的成人急性白血病之一，约占成人急性白血病的20%~ 30%，目前国际上有比较统一的诊断标准和不同研究组报道的系统治疗方案，完全缓解（CR）率可达70%~90%，3~5年无病生存（DFS）率达30%~60%；美国癌症综合网（NCCN）于2012年首次公布了ALL的诊断治疗指南，我国于2012年发表我国第1版成人ALL诊断与治疗的专家共识，得到了国内同行的认可。最近2016版WHO造血与淋巴组织肿瘤分类发表，对于ALL的分类有一些更新，提出了一些新概念；NCCN对于成人ALL的临床指南也先后几次修改。基于此，对我国成人ALL诊断与治疗的专家共识进行了更新。一、诊断分型（一）概述ALL诊断应采用MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学）诊断模式，诊断分型采用WHO 2016标准。最低标准应进行细胞形态学、免疫表型检查，以保证诊断的可靠性；骨髓中原始/幼稚淋巴细胞比例≥20%才可以诊断ALL；免疫分型应采用多参数流式细胞术，最低诊断分型可以参考1995年欧洲白血病免疫学分型协作组（EGIL）标准（表1），疾病分型参照WHO 2016版分类标准。同时应除外混合表型急性白血病，混合表型急性白血病的系列确定建议参照WHO 2008造血及淋巴组织肿瘤分类的标准（表2），可
以同时参考1998 EGIL标准（表3）。预后分组参考G?kbuget 等发表的危险度分组标准（表4）。细胞遗传学分组参考NCCN 2016建议：预后良好遗传学异常包括超二倍体（51~65条染色体）、t（12；21）（p13；q22）和（或）ETV6-RUNX1；预后不良遗传学异常包括亚二倍体（<44条染色体）、t（v；11q23）[t（4；11）和其他MLL重排]、t（9；22）（q34；q11.2）、复杂染色体异常。建议开展相关的遗传学检查，提供诊断分型、预后判断所需的标志，如：IKZF1缺失、CDKN2A/B缺失、CRLF2重排、JAK2重排、NOTCH1突变等（有条件者可以行ABL1、ABL2基因分离探针的分析）。ALL诊断确立后应根据具体分型、预后分组采用规范化的分层治疗策略，以取得最佳治疗效果。（二）WHO 2016版前体淋巴细胞肿瘤分类1．原始B淋巴细胞白血病/淋巴瘤：具体见表5。2．原始T淋巴细胞白血病/淋巴瘤：根据抗原表达可以划分为不同的阶段：早期前T、前T、皮质T、髓质T。建议分类：早期前体T淋巴细胞白血病（Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia，ETP）。（三）几种特殊类型ALL的特点 1．BCR-ABL1样ALL（BCR-ABL1-like ALL）：（1）和BCR-ABL1阳性ALL患者具有相似的基因表达谱。（2）共同特征是涉及其他酪氨酸激酶的易位、CRLF2易位。还包括EPO受体（EPOR）截短重排、激活等少见情况。CRLF2易位患者常与JAK基因突变有关。（3）涉及酪氨酸激酶突变的
白血病融合基因检测综 述 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
白血病相关融合基因的检测及意义 白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。 白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。 BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。 Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年O`Riordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley 发现缺失下来的那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22） （q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。 BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码 P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体阳性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融
2009年4月第47卷第11期·论著· 急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AM L）是一种以造血干/祖细胞获得性突变为特征的恶性克隆性疾病，大约55%的成人病例在诊断时出现非随机的克隆性染色体异常，儿童病例的检出率更高，但正常核型检出率在AM L中达到40%～47%[1]。染色体畸变能在转录水平干扰造血调控、影响髓系细胞分化，因此快速、简便地获得患者染色体遗传缺陷的信息是临床亟待解决的问题。本研究采用多重RT-PCR方法一次可同时检测29种基因重排，提高了隐匿性染色体易位的检出率，用于初诊时的筛选，对临床分型、预后判断及指导个体化治疗具有重要价值。 1材料与方法 １．１对象 选取2006年1月～2008年11月山西医科大学第二医院及山西省儿童医院血液科门诊或住院AM L初治患者60例，男30例，女30例，年龄1～70岁，中位年龄35岁。所有病例均经临床、形态学、免疫学和组化染色确诊，分别为M1、M2、M3、M4各12例，M5、M6各6例。所有病例均进行了染色体核型分析。 １．２方法 1.2.1试剂和仪器TRIzol试剂盒购自美国Gibco/BRL公司；AM V逆转录酶、RNAsin、TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司。PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司产品。 1.2.2细胞总RNA的提取和逆转录反应全部病例于初诊化疗开始前采取骨髓标本2～3mL，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，按Trizol一步法提取细胞总RNA，分光光度计测定A260值、A280值，以AM V逆转录酶系合成cDNA。引物序列参照文献[1]方法设计。逆转录广泛表达的转录因子（E2A）mRNA为内对照。1.2.3多重巢式RT-PCR两轮均平行设置8组含有混合引物的多重PCR，同时检测29种染色体易位和畸变所形成的86种剪接形式。每组检测的融合基因包括：第Ⅰ组inv（16）的CBF/M YH11；t（X；11）的M LL/AFX；t（6；11）的M LL/AF6；t（11；19） 正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测 赵瑾1*周永安1△苏丽萍1武坚锐2王恺1解菊芬1马莉1石磊3 （1.山西医科大学第二医院血液科；2.山西省儿童医院检验科；3.山西医科大学第二医院风湿科，太原030001） [摘要]目的探讨急性髓系白血病（AM L）患者染色体畸变所形成的易位相关融合基因的临床和实验的关系。方法采用多重巢式RT-PCR方法和染色体核型分析技术对60例AM L患者的融合基因进行分析。结果18例（30%）正常核型的AM L 患者分别检测出有PM L/RARα、AM L1/ETO、TLS/ERG、CBFβ/M YH11和M LL/AF9等5种融合基因的存在。结论多重巢式RT-PCR技术可用于白血病患者初诊时染色体畸变的筛选，可在核型正常的AM L患者中检出隐匿的染色体易位，对AM L 的诊断分型具有重要帮助，进一步指导临床个体化治疗。 [关键词]急性髓系白血病；融合基因；多重RT-PCR；正常核型 [中图分类号]R733.7[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2009）11-11-03 Det ect ion of Fusion Genes in Acut e Myeloid Leukemia Pat ient s wit h Nor mal Kar yot ypes ZHAO Jin1ZHOU Yongan1SU Liping1WU Jianrui2WANG Kai1XIE Jufen1MA Li1SHI Lei3 1.Department of Haematology，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University； 2.Children's Hospital of Shanxi； 3.Department of Rheumatism，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University，Taiyuan030001 [Abst r act]Object ive To investigate the fusion genes derived from chromosome structural aberrations in patients with acute myelocytic leukemia determined by multiplex RT-PCR and explore its potential clinical significance in diagnosis，treatment and prognosis evaluation. Met hods Bone marrow samples from60patients were analyzed with a novel multiplex nested RT-PCR and examination for chromosome karyotype.Result s5types of fusion genes such as PM L/RARα，AM L1/ETO，CBFβ/M YH11，TLS/ERG，M LL/AF9were detected in18（30%）patients with normal karyotypes by multiplex RT-PCR.Conclusion M ultiplex RT-PCR technique can quickly screen chromosome structural aberrations in patients with newly diagnosed leukemia.It is useful in detection of fusion genes in acute myeloid leukemia（AM L）with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis，help us to improve classification of the leukemia types of M ICM and to direct individulized chemotherapy. [Key Words]Acute myeloid leukemia；Fusion gene；M ultiplex RT-PCR；Normal karyotype *山西医科大学硕士研究生在读 △通讯作者 CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生11
本文极具参考价值，如若有用请打赏支持我们！不胜感激！ 浆细胞白血病(专业知识值得参考借鉴) 一概述浆细胞白血病（Plasmacellleukemia即PCL）由Foa于1904年首次报道，据不完全统计，国外文献报道有200多例，国内报道百余例。起病时外周血浆细胞数＞20%，或浆细胞绝对值＞2.0×109/L，且有形态学异常，往往就可诊断。资料表明，本病占急性白血病1%～2%，病程较短，类似其他急性白血病。PCL目前总体治疗效果不满意，治疗困难，疗效差，目前还没有很好的治疗选择，尚无标准治疗方案或最佳化疗方案。 临床上浆细胞白血病分为原发性浆细胞白血病（PPCL）和继发性浆细胞白血病（SPCL），大约60%～70%为原发性浆细胞白血病。原发性浆细胞白血病（PPCL）属白血病独立类型，临床表现与急性白血病相似。继发性浆细胞白血病大多数继发于多发性骨髓瘤（MM），临床病理与MM基本相似，为MM的一种终末期表现。发病占MM的1.6%～2%，国内报道占MM的8%，也有少数继发于巨球蛋白血症、淋巴瘤、慢性白血病和淀粉样变。 二病因病因不详，继发性PCL多是MM的终末期。 三临床表现继发于MM的SPCL临床病理与MM基本相似，为MM的一种终末期表现，表现为外周血浆细胞明显增多，且有骨髓和髓外器官的广泛浸润。PPCL的临床特征如下：①发病年龄小，最小为9个月，中数为45.2岁，＜40岁的占34.1%，而MM发病年龄较大，中数为53岁；②起病急，症状明显，大多数在2个月内可以确诊，很少超过半年；③常有高热、出血、肝、脾、淋巴结肿大及胸骨压痛等症状，与急性白血病相似；常有多脏器浸润，肝脾肿大比MM多见；④贫血及血小板减少，外周血白细胞明显增高，PPCL的骨髓增生显著活跃，浆细胞系统明显增生，均较MM 显著，畸形浆细胞也明显增多；而骨骼损害相对较轻。 四检查病理检查：与多发性骨髓瘤相比，PCL浆细胞多表达CD20（50%vs17%），多不表达 CD56，而MM细胞多表达CD56，CD56是个预后较差的指标。继发性PCL多表达CD28，CD28与高增殖率和疾病进展有关。应用Fish技术在80%以上的PCL患者中可检测到13q缺失和13号染色体单体。大约80%的患者存在16号染色体缺失。另外，PCL患者也往往存在2q和6p缺失。 PRAD1/CyclinD1在控制细胞周期中起重要作用，也存在于PCL浆细胞中。 五诊断浆细胞白血病是浆细胞恶性增殖性疾病。国内诊断标准如下： 1.临床上呈现白血病的临床表现或MM的表现。
急性混合细胞白血病诊治研究进展 发表时间：2018-05-07T16:02:28.497Z 来源：《航空军医》2018年4期作者：唐琳洁 [导读] 急性混合细胞白血病在临床上较为罕见，是一种危害极大的白血病类型。 （广西壮族自治区南溪山医院血液科广西桂林 541002） 摘要：急性混合细胞白血病在临床上较为罕见，是一种危害极大的白血病类型。目前针对该病的发病原因尚未有统一的定论，而在治疗上一般也采用淋系和髓系诱导方案进行化疗，根据目前临床研究显示，该病的唯一治愈方式可能是采用异基因造血干细胞移植。急性混合细胞白血病和其他急性白血病相比治疗难度大，患者预后不佳，本文针对该病的诊治进行了分析和探讨，以期为急性混合细胞白血病的诊治提供有效参考。 关键词：急性混合细胞白血病；诊断；治疗；分子生物学 急性混合细胞白血病是一种危害极大的白血病类型，在临床上的发病例数相比其他白血病而言较低，目前针对该病的发病原因和诊断标准的观点还未能得到统一。急性混合细胞型白血病又可具体细分为四个亚型，并且该病本身并不包含继发性白血病。本次研究中针对急性混合细胞白血病进行了进一步的分析探讨，以期为该病的诊治提供有效参考。 1.流行病学特征和临床症状 根据欧洲白血病免疫分型小组的评分系统[1]，在急性白血病中急性混合细胞白血病的占比大约在0.5%至1%左右；根据世界卫生组织在2008年所整合的最新诊断标准，急性白血病中约有2%至5%左右为急性混合细胞白血病，并且该病多发于成年男性，以中年男子比例居多，并且患者的淋系和髓系存在同时表达淋系和髓系抗原的现象。根据目前的最新研究成果表明，在参与研究的324名急性白血病成年患者中，双表型患者约占1.8%左右，并且患者在治疗后的预后效果不佳，平均生存期仅有17-18个月左右。除此之外，急性混合细胞白血病也会出现在未成年群体中，根据相关研究报告显示，在调查的23例急性混合细胞白血病患者中，年龄不足15岁的患者高达7例，研究中将急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病患者的生存率与其进行对比，发现两者之间并无显著差异，但是未成年人的预后情况和成年人相比相对较好。 2.免疫分型和分子遗传学 2.1免疫分型 在临床上目前诊断急性混合细胞白血病的主要方式之一是采用单克隆抗体检测。在急性混合细胞白血病中，CD45是主要的表达之一，其他例如CD34、HLA-DR、TdT等也是常见的免疫标记。同时也可以采用流式细胞术进行检测，如果患者血清髓过氧化酶检测结果呈现阳性，同样可以作为诊断的重要依据。除此之外，CD3、CD19、CD79a、CD117等也同样可以作为诊断的参考依据。在急性混合细胞白血病中，B/M表型患者居多，比例约为65%左右，而其余26%左右的患者则为T/M表型。在最近一项欧洲的最新研究中显示[2]，参与研究的100例急性白血病患者中，急性混合细胞白血病的患者共有38名，其中显示为B/M表型的患者约占58%，另外T/M表型的患者约占36%左右，其余仅有极少数的患者为B/T/M表型。另外有研究显示，成人患者和未成年患者的急性混合细胞白血病表型略有差异，多以T/M表型为主。也有研究表明，未成年急性混合细胞白血病患者中B/M表型约占58.2%，而其余患者大多为T/M细胞表型，仅有极少数患者为T/M表型。由于目前各个研究的参照标准各有差异，因而统计结果也也存在一定的差异性。 2.2分子遗传学 2008年世界卫生组织在细胞免疫表型的基础上综合考虑分子遗传学对急性混合细胞白血病的遗传学异常进行了明确的规定，即t（9；22）（q34；q11.2）和11q23/MLL重排。根据相关研究数据显示[3]，异常克隆现象中最常见的遗传学异常即为11q23/MLL重排，其次较为常见的即为t（9；22）（q34；q11.2）。但是急性混合细胞白血病不能用任何一种单一染色体异常来进行表达，也没有任何一种单一的特异的异常遗传标记能够表达。 在针对急性混合细胞白血病的研究中，有大约28%至35%的患者出现t（9；22）异常，而其中绝大多数患者为老年人。在另一项调查中显示，在未成年急性混合细胞白血病患儿中，出现t（9；22）异常的患儿人数较低，而绝大多数患儿存在EVT6/RUNX1重排现象；另外急性混合细胞白血病患儿中存在较多的5/7号染色体异常现象。 3.治疗和预后 目前针对急性混合细胞白血病的治疗尚未有统一的标准。根据相关研究显示，针对58例复杂核型患者进行分组治疗对比，其中一组患者采用CAG方案进行治疗，另一组患者则采用MOAP、DOAP和IOAP方案进行治疗，前一组中完全缓解的患者共计27例，而后一组中完全缓解的患者共计14例，随后对未缓解的患者采用CAG方案诱导，治疗后完全缓解的患者共计7例。随后统计基因突变患者和无突变患者的生存率，两者之间并无显著差异。另外有研究中显示[4]，对急性混合细胞白血病患者采用两系结合诱导治疗方案的治疗效果明显优于单一系的治疗方案，但是用于儿童治疗的结果却没有显著差异。还有研究表明，如果急性混合细胞白血病成年患者有bcr-abl异常的现象，若采用淋系方案进行治疗，则完全缓解的患者比例高达85%，但若采用髓系方案治疗，则完全缓解的患者比例仅有41%；当患者治疗后初次达到完全缓解时，对患者进行荧光原位杂交检测，无论患者是否存在微小残留，都立刻采取异基因造血干细胞移植进行治疗。根据相关数据显示，对急性混合细胞白血病患者采用异基因造血干细胞移植治疗后，患者3年的生存率达到67%。根据另一项研究报告显示，采用淋系、髓系相结合诱导方案进行治疗的患者完全缓解率达到71%左右，而单独采用淋系诱导方案进行治疗的患者完全缓解率约为64%左右，但单独采用髓系诱导方案进行治疗的患者完全缓解率仅有1/3左右。 除此之外，在急性混合细胞白血病的四个亚型中，有大约20%至40%的患者为Ph+患者。根据相关报道显示[5]，这类患者的生存率约占14%左右。针对这类患者的治疗中，也需要对患者的Ph染色体阳性的特点进行综合考量。根据相关实验研究表明，对于Ph+患者，采用伊马替尼和化疗进行治疗，患者的生存率明显高于单独使用细胞毒药物化疗的患者，而通过酪氨酸激酶抑制剂进行化疗诱导，患者的生存率也有了显著提升。根据意大利一项研究报告显示，在对Ph+患者进行治疗的过程中，53例患者均采用了达沙替尼和泼尼松进行治疗，这54名患者的病情均完全缓解，且在随访中未出现复发的情况。无论在哪一种分类中，急性混合细胞白血病和急性淋巴细胞白血病、急性髓
荧光PCR仪检测平台：叶酸能力代谢基因检测 一、叶酸能力代谢基因检测的临床意义： 1、提前预防脑卒中，降低脑卒中发生率和死亡率 大量研究数据显示：亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因型变异是导致我国人群脑卒中高发最主要的遗传危险因素。 MTHFR基因的多个位点在人群中具有多态性，其中与功能和疾病最为相关的是C677T位点多态性。在MTHFR基因第677个核苷酸位置，其碱基可发生胞嘧啶（C）向胸腺嘧啶（T）的突变，MTHFR酶的活性逐级降低（CC型活性为100%，CT型活性为70%，TT型活性为35%），引起同型半胱氨酸在人体内不同程度的蓄积，破坏全身血管，从而形成”H型高血压”，导致卒中风险比一般人高出11-28倍。因此提前检测与脑中风最相关的基因MTHFR677C/T基因对预防脑卒中，提前进行干预治疗，从而降低脑卒中的发病率，有着非常重要的意义。 2、提前预防新生儿出生缺陷，提高我国人口素质 神经管畸形，唇腭裂等是常见的新生儿缺陷。出生缺陷不仅影响儿童的生命健康和生活质量，而且给患者家庭带来巨大的精神痛苦和经济负担。而大量的研究表明MTHFR677C/T基因突变会导致孕妇体内同型半胱氨酸升高，从而导致孕妇早产、低出生体重儿、新生儿神经管畸形、唇腭裂等。因此提前检测与孕妇早产，新生儿出生缺陷相关基因，提前进行干预治疗，从而降低新生儿出生缺陷以及孕妇早产，对提高我国人口素质，降低国家和家庭负担方面有着重要的意义。二、检测试剂盒介绍及优势 采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、对MTHFR 基因C677T 位点多态性进行定性检测：首先从EDTA 抗凝的全血中提取基因组DNA，在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光利用探针可与DNA模板特异性结合的特点，通过报告荧光的不同来分辨出样本的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因型，最后通过电脑软件自动计算给出结果，区分该基因位点的野生型（CC）、杂合型（CT）和纯合突变型（TT）。 基因多态性检测试剂盒优势： 1.灵敏度高：可以对低至1ng的DNA模板准确的进行基因多态性检测；
心血管药物个体化用药指导的基因检测及临床意义 导读 心血管系统疾病主要包括高血压、动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等，是严重威胁人类健康和导致死亡的重要原因。目前临床上常规使用的抗凝药、抗血小板药、降脂药、血管扩张药等普遍存在个体差异。随着药物基因组学研究的深入，开展与药物疗效相关的基因多态性检测，可以为临床选择合适的药物种类及药物剂量提供遗传证据，能极大地提高心血管药物使用的安全有效性。 心血管系统疾病主要包括高血压、动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等，是 严重威胁人类健康和导致死亡的重要原因。目前临床上常规使用的抗凝药、抗血小板药、降脂药、血管扩张药等普遍存在个体差异。随着药物基因组学研究的深入，开展与药物疗效相关的基因多态性检测，可以为临床选择合适的药物种类及药物剂量提供遗传证据，能极大地提高心血管药物使用的安全有效性。 一、阿司匹林 虽然阿司匹林被广泛应用于抗血小板治疗，但是部分患者在服用常规剂量的阿司匹林后不能达到预期临床效果，这种现象被称为阿司匹林抵抗(aspirin resistance, AR)。 1．COX－1基因多态性： 阿司匹林是非选择性的COX酶抑制剂，突变COX－1单体型CGCGCC显著增加了阿司匹林抵抗的发病风险[1]。但是Kranzhofer等[2]通过研究认为阿司匹林抵抗与COX1/2基因多态性无关。
2．血小板糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)基因多态性： 血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合体(GPⅡb/Ⅲa)是纤维蛋白原的受体，PLA2等位基因可以增加急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome ACS)的风险，并且携带该等位基因的患者对于阿司匹林疗效不佳，存在阿司匹林抵抗现象 [3]。 二、氯吡格雷 大量的研究和长期的临床实践表明氯吡格雷联合阿司匹林在ACS尤其是行PCI术患者中具有显著的抗栓治疗作用[4]。 1．CYP2C19基因多态性： CYP2C19基因的突变位点有很多，已经发现36个。东方人突变携带者中，99%以上是属于*2、*3类型[5]。根据CYP2C19基因型的不同可将人群分为快代谢(*1/*1)，中等代谢(*1/*2，*1/*3)，慢代谢(*2/*2，*2/*3，*3/*3)，他们在中国人中的频率分别为42.4%、43.4%和14.2%[6]。 2．CYP2C19基因多态性在氯吡格雷治疗中的影响： Sibbing等[7]对2 485例冠状动脉支架置入的患者研究发现：至少携带一个*2等位基因的患者发生支架内血栓的概率明显高于野生型(1.5% vs. 0.4%, HR＝3.81, 95%CI 1.45～10.02，P＝0.006)，同时发现CYP2C19* 2 /* 2慢代谢型发生支架内血栓的概率最高(2.1%, P＝0.002)。携带一个以上CYP2C19*2等位基因的患者与不良临床预后有相关性，更容易出现氯吡格雷抵抗[8]。Spokoyny等[9]通过研究后发现，慢代谢和中间代谢心脑血管疾病患者在服用氯吡格雷时有复发心脑血管事件的风险。 3．CYP2C19基因型检测对临床用药的指导意义：