Study on Morphology and Anatomy of Astragalus membranaceus Roots Infected by The Root Rot Disease
Zhang Yanfang
目录
摘要................................................................................................................................I Abstract....................................................................................................................III 1前言. (1)
1.1黄芪研究概况 (1)
1.1.1黄芪的基本特征 (1)
1.1.2黄芪的化学成分 (1)
1.1.2.1黄芪多糖 (1)
1.1.2.2皂苷类 (2)
1.1.2.3黄酮类 (3)
1.1.2.4氨基酸和其他成分 (3)
1.1.3黄芪的药理作用 (3)
1.1.3.1对免疫系统的作用 (3)
1.1.3.2抗肿瘤作用 (4)
1.1.3.3抗衰老作用 (4)
1.1.3.4对心血管系统的作用 (5)
1.1.3.5对肝脏的保护作用 (5)
1.1.3.6其他药理作用 (6)
1.1.4黄芪种植过程中存在的主要问题 (6)
1.1.4.1黄芪根腐病 (6)
1.1.4.2白粉病 (7)
1.1.4.3线虫病 (7)
1.1.5黄芪根腐病的发病原因及防治 (7)
1.1.5.1黄芪根腐病的发病原因 (7)
1.1.5.2黄芪根腐病的防治 (8)
1.2植物根腐病的研究现状 (9)
1.2.1引起植物根腐病的病原菌 (9)
1.2.2植物根腐病的研究 (11)
1.2.2.1由多种病原菌共同引起的植物根腐病 (11)
1.2.2.2由单一病原菌引起的植物根腐病 (12)
1.3根系解剖观察方法 (12)
1.3.1徒手切片法 (13)
1.3.2石蜡切片法 (13)
1.3.3冰冻切片法 (13)
1.3.4薄切片法 (14)
1.3.5其他方法 (14)
1.4本研究的目的意义 (14)
2材料与方法 (16)
2.1黄芪根腐病病根的形态特征观察 (16)
2.1.1材料 (16)
2.1.2方法 (16)
2.2黄芪根的解剖结构 (16)
2.2.1材料 (16)
2.2.2试剂配制 (16)
2.2.3方法 (17)
2.2.3.1石蜡切片法 (17)
2.2.3.2徒手切片法 (18)
2.3病根解剖结构的观察 (18)
2.3.1材料 (18)
2.3.2试剂配制 (19)
2.3.3方法 (20)
2.3.3.1光镜观察法 (20)
2.3.3.2电镜观察法 (20)
2.4病根表面超微结构的观察 (21)
2.4.1材料 (21)
2.4.2方法 (21)
3结果与分析 (23)
3.1黄芪根腐病病根的形态特征观察 (23)
3.2黄芪根的解剖结构 (25)
3.2.1周皮 (25)
3.2.2次生维管组织 (25)
3.2.2.1次生韧皮部 (25)
3.2.2.2维管形成层 (26)
3.2.2.3次生木质部 (26)
3.3病根解剖结构的观察 (28)
3.4病根表面超微结构的观察 (33)
4讨论 (38)
4.1根形态学的研究 (38)
4.2根解剖学的研究 (39)
4.3病菌侵染过程的研究 (40)
5结论 (44)
参考文献 (45)
攻读硕士期间发表的科研成果 (52)
致谢 (53)
摘要
黄芪(Astragalus membranaceus)为豆科多年生草本植物，以根入药，性温，味甘，可补气固表，是药用价值很高的中药材。黄芪性喜凉爽气候，耐旱耐寒，极适合在西部干旱地区进行人工栽培。甘肃省定西市的渭源县、漳县、陇西县、岷县、临洮县是黄芪主产区，被誉为“中国黄芪之乡”。近年来随着市场对黄芪需求量的持续增加，其种植面积不断扩大以及轮作周期的缩短，由于连年重茬种植，致使黄芪根腐病的发病率大大增加，已成为影响其产量和质量的重要因素之一。
黄芪根腐病属于土传病害，以病残体和土壤带菌传播，是土壤中病原菌和病原线虫共同引起的，引起其根腐病的主要病原菌为镰刀菌。其病原菌经分离培养及致病性测定，主要有尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)和腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。目前对黄芪根腐病的研究主要集中在症状的肉眼观察、病原菌的分离鉴定及抑菌活性物质的筛选等方面，关于根腐病病根的解剖结构和表面扫描结构、病原菌与宿主之间相互作用机理的研究较少。
为此，本研究利用光学显微镜(Light microscopy，LM)、透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）、扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM），对自然生长状态下，黄芪的健康植株和根腐病病株根的形态、显微结构、超微结构和表面扫描结构进行观察，研究了病株根系形态特征、表面结构和解剖结构发生的变化，致病真菌的侵入方式以及在根内的分布，目的是了解黄芪根腐病病害侵染过程，为进一步从细胞水平研究黄芪根腐病致病机理及根腐病的防治提供理论依据。主要研究结果如下：
1.对健康黄芪和不同根腐病时期黄芪根的形态特征进行观察。结果表明，病菌侵染后，黄芪根部表皮粗糙发褐，根表面出现褐色凹陷斑，随着病情的加重，根表皱缩干腐，凹陷斑不断扩大增多，颜色也变深，开始腐烂，侧根腐烂脱落，整个根系发黑溃烂，表皮脱落。
2.利用石蜡切片和徒手切片法研究黄芪根的基本结构。结果发现，黄芪根为典型的双子叶植物根的结构，它的次生结构主要由周皮和次生维管组织组成。根的最外侧是起保护作用的周皮，由木栓层、木栓形成层、栓内层组成。次生维管组织位于周皮的内侧，由次生韧皮部、维管形成层和次生木质部组成，根中间无髓，其中次生韧皮部约占根半径的1/3，木质部约占根半径的2/3；维管组织薄壁细胞中存在丰富的后含物，有大量的淀粉粒，在个别韧皮薄壁细胞中还分布有
针状结晶束。
3.采用石蜡切片和超薄切片的方法，观察了黄芪根腐病病根的解剖结构。结果发现病根的基本结构和健康植株的没有明显的差异，两者主要的区别是在病根中发现有大量入侵的真菌，他们以菌丝或者菌丝结的形式分布在薄壁组织细胞中。真菌侵入时不破坏周皮，真菌以菌丝的形式穿过周皮组织细胞，侵入韧皮薄壁细胞，在其中的一个或连续几个细胞中定殖，并在细胞内形成菌丝结。韧皮薄壁细胞内的菌丝结有时通过菌丝穿过细胞壁上的纹孔，继续侵染其它相邻的细胞，逐渐扩展为一个侵染区域，真菌继而向下一层薄壁组织细胞内侵入，有少量菌丝侵染到根中间的木质部。被真菌侵染的细胞，其壁常木质化加厚、细胞变形并发生质壁分离、质膜断裂、各种细胞器和淀粉粒解体。真菌的生长和增殖抑制了细胞的生长。
4.运用扫描电子显微镜观察了黄芪健康植株和根腐病病株根的表面结构。结果表明，病菌侵染后黄芪根的表面微观结构发生了很大的变化。病根表面布满了大量的真菌菌丝和分生孢子，表面较粗糙，表层细胞轮廓不清晰、排列疏松杂乱，胞间空隙大，细胞壁破碎不完整。侵染晚期根腐烂，根表面出现凹陷、断裂及空洞。
关键词：黄芪；根腐病；根系形态特征；解剖结构；表面扫描结构
Abstract
Astragalus membranaceus is a perennial herb plant,belongs to Leguminosae family.Its root is used as a traditional medicine,which is warm in nature and sweet flavor and can replenish qi to strengthen exterior,it is a very high medicinal value in Chinese herbal medicine.Astragalus membranaceus is tolerant of drought and cold climate,is very suitable for artifical cultivation in West.Weiyuan County,Zhang County,Longxi County,Min County and Lintao County of Dingxi City are the main producing areas of A.membranaceus in China,so Dingxi City is honored as “hometown of Chinese A.membranaceus”.In recent years,with the market continuing to increase in the demand for A.membranaceus,the planting area of medicinal A.membranaceus constantly expanding and the cycle of rotation shortened,which have been resulted in increasing greatly of A.membranaceus root rot disease,and has became one of the important factor that impacted the yield and quality.
Astragalus membranaceus root rot is soil-borne diseases,which is resulted by in common of soil pathogens and nematodes.Fusarium is the main pathogenic bacteria of causing Astragalus membranaceus root rot,which are Fusarium oxysporum and Fusarium solani by the pathogens were isolated,cultivated and identificated.At present,the study on Astragalus membranaceus root rot is mainly focus on macroscopic symptoms observation,pathogen separation and identification,anti-bacterial active substances screening.However,the less study on the anatomical structure and surface scanning structure of Astragalus membranaceus roots infected by root rot,and the pathogenic mechanism of Astragalus membranaceus root rot.
For this reason,in this experiment,the root morphological characteristics,the surface and the anatomical structure of Astragalus membranaceus roots infected by root rot disease,the way of pathogenic fungi invaded and the distribution of the fungi in the root were studied used LM,TEM,SEM,taking the healthy roots as comparison.In order to understand the process of fungi infected.The result provide the theory basis for deeply researching the pathogenic mechanism and prevention and control of Astragalus membranaceus root rot.The main findings are as follows:
1.The morphological characteristics of the healthy roots and different time of Astragalus membranaceus roots infected by root rot disease were observed.The
results showed that after the disease infection,root skin rough and brown,and some brown concave spots at the surface.With the deterioration of the illness,concave spots unceasingly increasing,the root shrinking and dry rotted,lateral root rotted and fall off, and the root system rotting and exfoliation.
2.The anatomical structure of Astragalus membranaceus roots were studied by paraffin sectioning and free-hand sectioning.The results showed that the secondary structure was consist of periderm and secondary vascular tissue,and it belonged to the typical structure of dicotyledon root.The outermost layer of the root was periderm,it was consists of cork layer,cork cambium and phelloderm,and protect the root.The secondary vascular tissue was consists of secondary phloem,vascular cambium and secondary xylem.Secondary phloem accounted for about1/3of the root,the xylem was2/3,and there was no pith in the root.There were a large number of cell ergastic substance in the vascular tissue parenchyma cells,many starch grains,Needle-shaped crystal in few phloem parenchyma cells.
3.The anatomical structure of Astragalus membranaceus roots infected by root rot disease were studied by paraffin sectioning and thin sectioning.The results indicated that the only difference on the basic anatomical structure was that the fungi invaded in the diseased roots and many hyphae or pelotons in parenchymatous cells.The fungi didn't infected the periderm,they entered the phloem parenchymas through periderm,and then,formed pelotons,colonized and infected other cells continuously by means of hypha penetrating the cell wall,then they continued to infect the next parenchymatous cells,some even infected to xylem.In the infected cells,the damages to the tissues included cell wall lignification thickening,cell deformation and plasmolysis,membranes disruption,organelles and starch grains disintegration.The growth and proliferation of the fungi inhibited the growth of cells.
4.The surface structure of healthy and diseased roots of Astragalus membranaceus were researched by SEM.The results showed that there were great differences in the surface microstructure of the healthy and diseased roots.Many fungal hyphae and conidiospore in the surface of diseased roots,surface was rough, cell disorderly and cell wall was incomplete.Some concave,fracture and cavity in the surface of the root in the late infection.
Key words:Astragalus membranaceus;root rot;the morphological characteristics ;anatomical structure;surface scanning structure
of the root system
system;anatomical
1前言
1.1黄芪研究概况
1.1.1黄芪的基本特征
黄芪是豆科黄芪属多年生草本植物，主要有膜荚黄芪[A.membranaceus (Fisch.)Bge]和蒙古黄芪[A.membranaceus.var.mongholicus(Bge.)Hsisa][1]。本研究采用的品种是蒙古黄芪。株高40-80cm，主根长且粗壮，主根长20-80cm，圆柱形轻度木质化，浅棕黄色至深褐色；茎直立被稀疏短柔毛，茎上部多分枝，幼茎淡绿色。奇数羽状复叶互生，小叶数量较多，有12-18对；小叶片上面无毛，下面被柔毛，有短梗，形状椭圆形或长椭圆形，叶长5-10mm、宽3-5mm，两端近似圆形；披针形托叶；总状花序腋生，花浅黄色，花冠蝶形，每花序具花5-20朵；花萼钟形，被有浓密的短柔毛，具5萼齿；龙骨瓣、翼瓣均有长爪，旗瓣倒卵形长圆状；二体雄蕊，有10；子房有长柄，光滑无毛。荚果半卵圆形，果皮膜质，有网纹，光滑无毛，膨胀，内有种子3-8粒，种子黑褐色，宽肾形，两侧扁，种皮表面具有黑色斑纹，革质，光滑，电镜下种皮纹饰两侧处为皱折状。黄芪花期6-7月，果期7-9月，秋季采挖。其根以根条粗长、质地坚而绵、少皱纹、味甜、粉性足者为佳。饮片多数浅黄白色、浅黄色、褐黄色、也有赤色和赤褐色、黑色和黑褐色等不同的颜色。黄芪是我国名贵的中药材之一，也是目前临床上应用较多的药物之一，目前已被列为国家三级保护植物。我国黄芪的主产区有山西、内蒙、黑龙江、河北、四川、甘肃等地，近年来由于市场需求量增加，长期大量采挖致使野生的黄芪资源日渐稀少，各地分布也比较少，目前黄芪的来源主要依靠人工种植。
1.1.2黄芪的化学成分
关于黄芪的化学成分，曾报道其含有黄芪多糖、皂苷类、黄酮类，此外还含有氨基酸和微量元素等。
1.1.
2.1黄芪多糖
经研究黄芪多糖的含量处于中上水平，其成分主要有葡聚糖和杂多糖，其中葡聚糖分为水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖，分别是α-﹙1→4﹚﹙1→6﹚葡聚糖和α-﹙1→6﹚葡聚糖；杂多糖主要是水溶性酸性杂多糖，多由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖组成，其糖醛酸含量较少，由半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，
有些杂多糖仅由葡萄糖和阿拉伯糖组成[2]。
国内学者从黄芪中分离、纯化得到白色粉末状多糖，分子量37ku，经鉴定为α-糖苷键结构，多糖水解后检出葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比为1：0.95：0.70[3]。秦雪梅[4]采用酚-硫酸比色法，测定了内蒙黄芪多糖的含量，结果发现种子含量最低，茎叶次之，根部最高，茎叶生产量大且易采收，因此是很好的黄芪多糖资源。张善玉等[5]应用比色法，测定了不同生长年限黄芪的多糖含量，结果表明，黄芪中多糖的含量随着生长年限的增加而逐年降低，生长年限分别为1、2、3年的黄芪，其多糖含量为32.12、23.42、16.68mg／g。徐凌川[6]采用分光光度法，测得文登和新泰两地所产黄芪的黄芪多糖含量分别为8.62%和14.15%，即不同来源的黄芪药材多糖的含量不同，结果说明了黄芪药材多糖含量的差异性。Rios JL等[7]研究发现，蒙古黄芪中有3种多糖成分，分别为黄芪多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，黄芪多糖Ⅰ是由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成的杂多糖。
1.1.
2.2皂苷类
皂苷类为黄芪中重要的活性成分。从黄芪及其同属近缘植物中分离出的三萜皂苷类化合物已多达40多种，主要有黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ，异黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，大豆皂苷Ⅰ和乙酰基黄芪皂苷等四大类，其结构为四环三萜及五环三萜苷类；其中，黄芪皂苷Ⅳ(亦称黄芪甲苷)是一种羊毛酯醇形的四环三萜皂苷，是黄芪的主要有效成分，为黄芪药材的定性定量指标[8]。梁伟等[9]研究了不同的产地及药用部位黄芪甲苷的含量，结果发现不同的产地和用药部位，其黄芪甲苷含量也不同。不同产地黄芪甲苷含量的高低为：甘肃>黑龙江>陕西>内蒙>宁夏>青海>山西>山东>河北；相同产地不同用药部位的黄芪，其甲苷含量均为细根(侧根)高于粗根(主根)。江燕等[10]对黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量进行比较，采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量，采用紫外分光光度法测定黄芪总皂苷的含量，并考察两者的相关性；结果黄芪甲苷含量为0.13-1.53mg／g，黄芪总皂苷含量为7.5-17.2mg／g；表明不同产地黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的差异较大，两种含量之间存在相关性。潘飞等[11]用分光光度法对蒙古黄芪总皂苷含量的动态实验表明，5月初苗期含量最低，此后随着植物生长其含量逐渐上升，至9月达到最高峰，以后逐渐下降。不同种黄芪间总皂苷含量有所差异，金翼黄芪、东俄洛黄芪、单蕊黄芪的总皂苷含量较高，多花黄芪、蒙古黄芪、膜荚黄芪及其青海变种含量居中，马衔山黄芪和多序岩黄芪含量较低。
1.1.
2.3黄酮类
研究表明，目前已从黄芪中分离出黄酮类成分近40种，其中包括黄酮5种，异黄酮12种，异黄烷12种和紫檀烷4种、二氢异黄酮、紫檀烯等六大类，主要有槲皮素、熊竹素、异鼠李素、鼠李异柠檬素、山奈黄素、芝柄花素、异黄烷、芦丁、芒柄花黄素、羟基异黄酮、毛蕊异黄酮等。陈鑫[12]研究发现不同产地黄芪总黄酮类含量存在明显的差异，结果得出以下地区黄芪总黄酮含量由高到低依次为：河北>山西>吉林>甘肃>内蒙>陕西>青海。
1.1.
2.4氨基酸和其他成分
黄芪中总共含有25种氨基酸，如天门冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸等。其中有18种的结构已经确定，有4种初步推断为天冬酰氨、半胱氨酸、β-丙氨酸和γ-氨基丁酸，还有三种未确定。通过对黄芪根中21种游离氨基酸含量的研究，结果发现天冬酰胺、刀豆氨酸、精氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸的含量较多[13]。
此外，黄芪中还含有微量元素，其中铁、锰、锌和铷等含量较大且是人体必需的；黄芪中还含有生物碱、叶酸、尼克酸、亚油酸、亚麻酸、核黄素、咖啡酸、克洛酸、甜菜碱、胆碱、香豆素、淀粉E、维生素P及甾醇类物质等。涂天智等[14]首次从内蒙黄芪根中分离得到了软脂酸甘油脂、软脂肪酸等化学成分。
1.1.3黄芪的药理作用
黄芪以根入药，性温，味甘，可补气固表，是药用价值很高的中药材[15]。正如黄芪含有多种有效成分一样，黄芪具有多种的药理作用。
1.1.3.1对免疫系统的作用
黄芪对机体的免疫系统具有明显的促进作用，能增强体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫等免疫调节作用。黄芪可以促进生物机体的抗体生成能力，研究表明，给慢性肾炎、支气管炎等疾病患者注射黄芪后，能明显提高其血清中免疫球蛋白IgA，IgG，IgM的含量，黄芪水提液还可以使肝炎患者的分补体(C3)和总补体(CH50)显著升高[16-18]。黄芪皂苷可使活化小鼠T淋巴细胞内游离钙增加，使Ca2+内流的驱动力增强，而Ca2+作为信息分子，可促进淋巴细胞的增殖分化、白细胞介素-2(IL-2）、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)的产生，可提高T淋巴细胞的水平，防止了化疗药物对免疫功能造成的伤害，从而增强了机体的免疫功能[19-22]。非特异性免疫主要是：机体单核巨噬细胞系统中各种巨噬细胞产
生的非针对某特定病原体的防御机制。黄芪还能增强小鼠腹腔内巨噬细胞的吞噬能力，能提高巨噬细胞内酸性磷酸酶、醋酸α-茶酚酯酶、粘多糖和三磷酸腺苷酶糖原四种物质的含量，加强了巨噬细胞对抗原处理以及免疫调节的能力，尤丽芳[23]发现在体外用小鼠肺巨噬细胞加黄芪后其吞噬白色葡萄球菌的能力明显增强。宁康健等[24]研究发现，黄芪多糖可以改善单核巨噬细胞的功能，增强巨噬细胞的吞噬能力，提高自然杀伤细胞(NK)的活性，不同给药途径、不同剂量黄芪，均可不同程度地增强小鼠腹腔内巨噬细胞的吞噬能力。郭颖杰等[25]的研究也发现黄芪多糖类能增强单核巨噬细胞的功能，提高自然杀伤细胞(NK)的活力。
1.1.3.2抗肿瘤作用
黄芪具有抑制肿瘤细胞的生长增殖，促进肿瘤细胞凋亡的作用。金宏勋[26]研究发现黄芪水煎液可增强环磷酰胺(CTX)的抗癌活性。伦永志等[27]研究发现黄芪成分F3新制剂能延长腹水荷瘤小鼠的生命。杨丽娟等[28]发现黄芪对S180肿瘤有免疫抑制的作用。彭佳明等[29]分析了黄芪注射液治疗62例肿瘤放化疗后白细胞减少的患者，发现其有效率高达89%，且无明显的毒副作用。许杜娟等[30]研究发现黄芪总提取物（TAE）明显的抑制了人肝癌细胞和人宫颈肿瘤细胞，说明TAE对癌细胞具有直接的抑制作用。黄天风[31]实验研究发现，黄芪能够抑制低淋巴转移(HepA)小鼠肿瘤的生长，促进机体产生IL-2，增加免疫器官重量和小鼠单核吞噬细胞的功能，说明黄芪通过增强荷瘤小鼠的免疫调节能力而起到抗肿瘤的作用。曾健[32]在黄芪对顺铂致大鼠肾损害的保护作用的实验研究中发现黄芪对顺铂造成的肾损害有明显的减轻作用。
此外，除色氨酸外，黄芪中的氨基酸都是人体必需氨基酸，表明黄芪除具有多种药效外，还有丰富的营养价值，因而能显著地提高人体的免疫能力，可以有效地抑制肿瘤的发生[33]，在临床上起到了不可替代的作用。
1.1.3.3抗衰老作用
经科学研究，发现人体内自由基水平的增加是导致衰老的主要原因。自由基作用于机体细胞特别是膜和遗传结构中的大分子，致使其受损伤而引起疾病和衰老。研究表明：黄芪提取液能使细胞寿命延长1/3达98代，黄芪总黄酮类和总皂苷类等成分具有抗氧化活性能力，能显著抑制机体自由基的产生，清除过剩的自由基，保护细胞免受过度氧化作用危害，因而延长细胞寿命；黄芪清除自由基的能力与其浓度有关，作用原理是糖甙与自由基发生反应从而阻止了新自由基的产生[34-38]。黄芪多糖能降低血浆、肝匀浆、脑匀浆中过氧化脂质(LPO)水平，提
高血超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的活力；黄芪还能降低病毒对细胞的致病作用，抑制病毒繁殖，补气生血，提高机体的应激能力等。因此黄芪具有显著的抗衰老作用。
1.1.3.4对心血管系统的作用
黄芪皂苷通过扩张血管达到降压目的，对心脏的作用则是通过改善心肌收缩舒张功能、增加冠脉流量、对心功能起到保护作用；其作用机制是皂苷浓度的变化，低浓度使Na+-K+-ATP酶兴奋，高浓度使Na+-K+-ATP酶受到抑制，从而间接抑制了Na+-Ca2+交换对心脏的作用，包括保护心肌细胞、强心作用、高心脏保存效果等，此外，黄芪皂苷对脑血管系统和血液流变性均有影响[39]。黄芪多糖对心血管系统的作用表现在可以改善微循环，收缩心肌功能，缩小梗塞面积，减轻心肌损伤，其机制可能与抑制Na+-K+-ATP酶活性和抗自由基损伤作用有关，还有待于进一步研究。黄芪可以增强心肌收缩力，其主要有效成分为黄芪皂苷，主要作用机理为：黄芪能够激活磷酸化酶，促进糖原降解，提高红细胞葡萄糖耗氧率和心肌细胞内Ca2+的利用水平，从而增强心肌收缩力[40]。于影等[41]用黄芪中总黄酮（20，40mg/kg）给予豚鼠的实验发现，黄芪中总黄酮能减少心律失常发生率。黄芪可以明显地抑制脑缺血再灌注大鼠脑组织MDA含量的升高和提高SOD活性，从而清除氧自由基，并从超微结构上证实，其对膜性结构具有一定保护作用[42-43]。黄芪对血压具有正负双相的调节功能，查益中[44]通过实验观察，发现黄芪具有扩张周围血管阻力、降低动脉压及右心前负荷而改善心功能的作用；黄芪降压的主要成分为1-氨酪酸(GA-BA)，一些人认为黄芪的血管效应不能全部以GABA代表，也有人认为其含量可作为判断黄芪质量好坏的一个指标；黄芪降压途径可能是通过一氧化氮-可溶性鸟苷酸环化酶-环磷酸鸟苷(NO-SGC-cGMP)介导的信号转换通道，调节血管平滑肌细胞(VSMC)的功能，从而调整血压同时对冠状动脉有直接扩张作用。黄芪具有抗血栓作用：徐旭等[45]研究发现，黄芪皂苷(TSA)可明显延长电刺激大鼠颈总动脉时所形成血栓的时间，而且能抑制血小板凝集，提高一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)含量的水平，降低血栓素A2(TXA2)／前列环素(PGI2)比例；说明TSA具有显著抗血栓形成的作用，其作用机制与提高NO和PGI2水平有关。
1.1.3.5对肝脏的保护作用
黄芪具有良好的抗肝纤维化作用，能够抑制脂氧化酶，减少脂多糖的产生，提高肝脏的谷胱苷肽，抗自由基、保护线粒体、调节代谢等，从而起到了保护肝
脏的作用[46]。王要军等[47]用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型，观察黄芪对血清透明质酸(HA)、肝组织纤维化评分及细胞间黏附分子-l(ICAM-1)表达的影响，发现黄芪组肝组织纤维化评分及血清HA明显低于模型组，肝组织中ICAM-l 阳性细胞数也明显减少，结果表明黄芪有良好的抗肝纤维化作用，其机制可能与黄芪抑制肝细胞中ICAM-1的表达有关。
1.1.3.6其他药理作用
韩旭[48]等发现给大鼠注射黄芪煎剂具有利尿作用；宋洁[49]等发现黄芪具有抗辐射作用；黄芪对肾脏和肺脏具有保护作用[50-51]；何利雷等[52]发现用穴位注射黄芪能提高小鼠的记忆力，刘东梅等[53]发现黄芪对β-淀粉样肽(Aβ)所致海马神经元的损伤具有保护作用，说明黄芪对中枢神经系统也产生作用。
1.1.4黄芪种植过程中存在的主要问题
近年来随着市场对黄芪需求量的不断增加，其种植面积不断扩大和轮作周期的缩短，致使黄芪的病虫害加重、品质下降，严重影响了黄芪的产量和质量。因此，黄芪的病虫害已成为其种植过程中存在的主要问题。研究表明，黄芪的病虫害主要有根腐病、白粉病、立枯病、褐斑病、紫纹羽病、根结线虫病等[54]。其中最严重的病害是根腐病，当地俗称麻坑病，是造成定西地区黄芪品质下降的主要原因。
1.1.4.1黄芪根腐病
受气候条件和栽培管理等的影响，黄芪根腐病在多雨潮湿的地区或季节易发生，发病期多在6-8月，发病率一般为30%-50%。病害一般从苗期开始发生，并由中心病株向四周蔓延。患病植株地上部分长势弱小，叶色较浅，严重时整株叶片变黄枯萎，根部表皮发褐粗糙，有大量的横向细纹，严重时产生大量的纵向裂纹和龟裂纹。其变褐根茎横切面韧皮部有许多呈塑料泡沫状的空隙，有紫色小点，呈褐色腐朽状，表皮易剥落；木质部的髓部早期产生淡黄色圆形环纹，随后扩大变成粗环纹，后期变为淡紫褐色或黄褐色，蔓延至根下部，其皮易剥落，病根的维管束组织变褐。根尖或侧根先发病并向内蔓延到主根，病株多从主根头部开始腐烂，其主根及侧根上均可见变皱的褐色斑，严重时根皮腐烂呈纤维状；发病后期茎基部及主根呈红褐色干腐状，根部表面粗糙，侧根腐烂，整个根系发黑溃烂，植株极易从土中拔出。土壤湿度较大时，病株根部产生白色菌丝。植株地上症状是非特异的，与地下害虫的伤害症状相似[55]。
1.1.4.2白粉病
多5-6月开始发病，9-10月发病率可达100%。为害植株叶、茎秆、叶柄。病害早期叶片两面产生白色粉末状小霉层，然后扩大至覆盖全叶，菌丝层似毡状、很厚，后期菌丝中产生无数黑色小颗粒，发病严重时造成叶片枯死以至整个植株死亡。病原菌豌豆白粉菌（Erysiphe pisi），属半知菌亚门真菌，以闭囊壳在病叶上越冬，翌春产生子囊孢子进行初次侵染，生长季在寄主部位以分生孢子的方式进行再侵染，此外在芽上越冬的菌丝，翌年也可发病。黄芪各种植地普遍发生，造成黄芪大幅度减产[54]。
1.1.4.3线虫病
一般6-10月均可发病，主要为害黄芪根部。线虫侵入后，细胞因受刺激而加速分裂，主根、侧根变形成为瘤状物，严重者整个根系成为一个大瘤，其表面早期光滑，后期变得粗糙、龟裂；发病早期地下根头或中上部局部表皮变粗糙,横向皱缩、发褐，其根内组织干腐变褐，后期向内向下蔓延，导致根大面积腐朽。植株衰弱，株矮叶小且叶色发黄，严重时枯黄而死[54]。病原为南方根结线虫（Meloidogyne incognita Chitwood），属根结线虫属。
1.1.5黄芪根腐病的发病原因及防治
1.1.5.1黄芪根腐病的发病原因
黄芪属耐旱型作物，喜凉爽气候，怕热怕涝，适宜生长在土层深厚、富含腐殖质、排水力强的中性或微碱性砂质土壤中，而粘土和重盐碱土易造成烂根，不适宜种植。影响黄芪根腐病发病率的因素主要有以下四个方面。（1）种质、种植地苗木与发病率：黄芪根腐病属于土传病害，以病残体和土壤带菌传播，虽然种子一般不带菌，但是也有一定的影响。种子饱满，成熟度好，发病率低；种子成熟度不一，种质差，发病率偏高。移栽田的发病率比直播田高。随着黄芪生长年限的增大发病率升高。在黄芪的各个生长期，发病率从苗期到开花结果期逐渐升高。（2）水量与发病关系：黄芪耐旱、耐寒、耐贫瘠，喜干旱环境，多雨或积水都不利于其生长，会促使根腐病的发生。干旱年份比多雨年份发病率低；在正午或高温天气灌水、灌水量多、灌水速度慢、单口灌溉，发病率高；在大雨或连阴雨天气，发病率高，在结果期遇连阴雨发病率高达80%以上。（3）种植密度与发病率：种植密度直接影响到发病率，据调查，30、40、50、60万株/hm2四种种植密度下，黄芪根腐病的发病率逐渐增大，分别为12.3%、15.1%、20.4%、32.8%。密度小的田块，单株生长良好发病率低，但产量低不可取，因此，种植密度以
40-50万株/hm2为宜。（4）耕作制度与发病率：黄芪根系相对发达，对耕作制度要求严格，不同的耕作制度会不同程度地影响根腐病的发生。研究发现：排水良好的砂壤土发病最轻、壤土地发病较重、粘土地发病最重；新开垦的荒地不发病或发病极轻，而种植多年的地发病重；精细整地的田地发病率比整地质量差、土壤质地粗糙的田地低；施优质农家肥的田地较只单纯施无机肥的田块发病轻；进行合理轮作的田地发病率低，迎茬或重茬种植黄芪的田地发病率高。据初步统计，重茬地发病率为55%以上，迎茬地发病率为33%以上，垄作或平畦的田块发病轻，平作的田块发病重[55]。
1.1.5.2黄芪根腐病的防治
（1）农业防治：选择地势较高、排水良好、土层深厚、渗水力强、地下水位低的砂壤土或冲积土栽培黄芪，不宜选择白浆土、黏壤土、低洼积水的草甸土；播种前进行选种，选择健康饱满的种子，以提高其发芽率和发芽势；前作物收获后及时翻耕土地，晾晒土壤以降低病害源，黄芪根系发达，需肥较多，种植前一次性施足底肥，将化肥与农肥混施，保证黄芪所需养分；移栽时尽量减少伤口，齐苗后及时进行中耕除草，保持田园清洁，减少病虫危害，增强土壤通透性，提高植株抗逆能力；3月下旬至4月上旬种植，保证行距和株距，合理密植；前茬作物以玉米、小麦、棉花、蔬菜地或油菜地为宜，避免豆科植物、甜菜、胡麻、瓜类等茬口，忌重茬或迎茬，轮作期以4-5年为宜；黄芪一年需浇水4次；降水多的地区不灌或少灌水；田内若有积水应及时排除；在生长期可喷施Cu、Zn、Mo等进行叶面施肥[56]。（2）药剂防治：秋季整地或种植前l0d-15d，用辛硫磷乳剂兑细沙土拌成毒沙土施入地内，防治地下害虫，或用多菌灵粉剂在无风条件下均匀喷施于地表，及时耙地，使土药混合均匀，然后耥平，预防效果达47%-56%。禁止使用五氯硝基苯进行土壤消毒；一旦发现有病株应及时拔除销毁，有效阻止病害的蔓延；也可用药剂浸苗的方法，种植前用利克菌与多菌灵等比混合稀释200倍，浸苗5min晾2h移栽，防病效果最佳，高达85%以上；杀菌剂多菌灵、硫悬浮剂等与杀虫剂苦参素、皂素烟碱、新科等以600-2000倍混合，浸苗10-30min，可有效控制黄芪根腐病危害，获得较高产量，达到优质高产的目的。（3）生物防治：哈茨木霉菌、康氏木霉菌、长枝木霉菌、绿色木霉菌、钩状木霉菌等对许多植物病原菌具有抑制作用。藤艳萍[57]利用3种木酶菌通过室内抑菌和盆栽试验，发现3种木霉制剂均能有效防治黄芪根腐病的发生，木酶菌抑制黄芪根腐病主要原因是：木霉菌在生长中可能会释放某种抑制物质，或产生某种抗
生性物质从而使病原菌生长缓慢；木霉菌菌丝对半裸镰孢菌有缠绕和侵入的现象，从而使其细胞质变稀薄，部分菌丝消解、断裂，影响了菌丝的生长；绿色木霉菌生长速度快、争夺营养空间的能力强、能在短期内迅速占满培养皿，从而抑制病原菌的生长。在室内抑菌和盆栽试验中，木霉菌虽然对黄芪根腐病病原菌具有一定的抑制作用，但还需在田间进一步验证。
1.2植物根腐病的研究现状
1.2.1引起植物根腐病的病原菌
植物在种植的过程中，由于病虫害的破坏一直产量降低，造成了严重的经济损失。大量研究证明根腐病已成为其种植过程中存在的主要病害之一，很多病原菌都能引起植物根腐病，已报道的有镰刀菌、丝核菌、疫霉、腐霉、蠕袍菌以及链格孢等。国内外对一些主要的农作物和经济作物根腐病研究较多，而对于药用植物黄芪、西洋参、三七、枸杞等根腐病的研究，主要在国内有报道，而国外较少。我国对根腐病病原菌的研究报道中发现，引起植物根部病害的病原菌主要为镰刀菌。
镰刀菌（Fusarium Link ex Fr）是真菌中的一个重要类群，是一个大而可变的属，因其在无性阶段产生的大型分生孢子形状似镰刀而得名。其无性时期在真菌分类系统中隶属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)；有性阶段分别属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、赤霉属(Gibberella)、丽赤壳属(Calonectria)、丛赤壳属(Nectria)和小赤壳属(Micronectriella)等属，但有许多种仍不知其有性阶段。
国外研究概况：镰刀菌在国际上有10种不同的分类系统（表1.1）[58]。1935年，Wollenweber和Reinking[59]等发表了第一个以16组65种为内容的分类系统，是最具参考价值的分类系统之一。他们根据小孢子的有无以及形态特征，大孢子和足细胞的形态、特点，厚垣孢子的形成与否以及着生方式等来划分组；根据子座有无和颜色，大孢子的长度和宽度、隔膜数，菌核的形成与否等特征来划分亚组、种、变种和型；但是，这些特征属于不稳定性状，易受环境影响而发生变化；另外，该系统使用了7种不同培养基，同一种菌在众多的培养基上又有所变异，以致不同菌之间在形态上发生交错，从而使这个系统变得十分复杂，难以在实践中应用。因此这个系统成为人们长期争论的焦点，但是至今已有的十几个分类系统
都是以此系统为基础的，是最具参考价值的分类系统之一。1940年，Snyder[60]提出了9个种的分类系统。1952年，Gordon提出一个26种的分类系统，它是折衷于Wollenweber和Snyder系统之间的产物。1971年，Booth[61]以Wollenweber系统为基础，吸收了Snyder系统的合理部分，推出了44种系统，受到了人们的普遍欢迎，也得到我国镰刀菌工作者的充分肯定。1983年，Nelson[62]等提出了30种的分类系
表1.1镰刀菌的各分类系统[58]
Table1.1The classification system of Fusarium Link ex Fr[58]
统，该系统以Wollenweber等系统为起点和基础，综合了现有各分类系统的优点，种的概念简明扼要，很适合于种的鉴定。
国内研究概况：1955年俞大紱[63]根据Wollenweber系统鉴定出我国镰刀菌44个种，35个变种，并在文中对引起植物镰刀菌病害的约1000株镰刀菌属病菌作了分类鉴定，是最早在我国开展较为系统的镰刀菌属分类学的学者。1987年，白逢彦[64]研究了除台湾外、分离自全国各地区的3000多株镰刀菌，初步确定了40个种和变种，并发现5个新记录种和一个新种。陈鸿逵和王拱辰等[65]历时11年，收集浙江省内2000余份镰刀菌标本，进行分离、培养以及鉴定，结果归纳为28个种和6个种级下品种并发表了《浙江镰刀菌志》。王拱辰、郑重、叶琪明等[66]合著了一本《常见镰刀菌鉴定指南》，对我国常见镰刀菌26个种和6个变种的培养特征、菌种形态、分布和产毒进行了描述和记载，同时配以培养性状的彩照和抱子形态的显微摄影照片，介绍了镰刀菌的鉴定方法，有分组和分种的检索表，并且对镰刀菌分类作了讨论。孙守恭和黄振文等[67]编著出版了《台湾植物镰孢菌病害》一书。