淀粉酶产生菌的筛选及酶
活力测定
Prepared on 22 November 2020
南昌大学实验报告
淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定
一、实验目的：
1、学习从土壤中分离微生物的方法；
2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法
3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。
二、实验原理：
土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下
降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
三、实验器材及试剂：
1、培养基：
（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）
（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁,硫酸亚铁,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到～。）
（3）摇瓶培养：淀粉培养液。
2、试剂：
碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L乙酸、%生理盐水。
3、器材：
培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
四、实验步骤：
1、淀粉产生菌的筛选：
（1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；
（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒平板备用；
（3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一天；
（4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在37摄氏度培养箱中培养两天；
（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。
2、酶活力测定：
（1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。
（2）酶液稀释：
取发酵液进行4000r/min离心5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。
（3）标准曲线制作：
准备七支试管，按照下表配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液在660nm下的OD值。然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。
（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。
40摄氏度水浴保温5min
40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min,每管加入稀碘液1ml
（5）酶活力测定：
酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，的条件下每小时所分解的淀
粉毫克数来衡量。
五、实验结果：
1淀粉产生菌的筛选：
淀粉产生菌透明圈的检验图
2、酶活力测定：
(1)实验预测数据：
（2）计算：样品的OD660=
查标准曲线可得：淀粉含量==
初始淀粉含量=2g/100ml×2ml==40mg
被消耗的淀粉含量=40mg－=
酶活力=(1ml×=(ml·h)
六、实验结果分析：
平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响,例如菌种特性、接种量大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平板厚度等。绘制的淀粉含量标准曲线也会受实验室环境影响及误差而造成不准确，酶活力的表示方法也有多种，仅是一个相对的数值。
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
“生物制药技术实训”课程研究报告 项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌 一实验原理 枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。 二材料 灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。 三操作步骤 1.包平板 2.配生理盐水 3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基 4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min
5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h 6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌 7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min 8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。 9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h 10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。
土样中淀粉降解细菌的筛选（设计性实验） 一、实验目的 1.掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。 2.掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。 3.初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。 二、实验原理 在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰底产菌。 三、实验材料 1、培养基：蛋白胨， NaCl，可溶性淀粉，琼脂，蒸馏水。 2、玻璃仪器: 培养皿10副，试管10支，三角瓶 6个，移液管 10支（1mL7支,10mL 3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。 3、其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。 四、方法与步骤 1、土壤样品: 食品厂、粮食加工厂、饭店等日常接触淀粉较多的肥沃土壤。 2、培养基的制备 (1)液体培养基：称取蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、可溶性淀粉0.2 g溶于装有100 mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 (2)固体淀粉培养基：称取蛋白胨1.5g， NaCl 0.75g，可溶性淀粉0.3g ，溶于
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。
淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热 恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6
的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0
产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.
实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和 唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液（自备）。 2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液 体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。依此类推，如此继续稀释 至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
影响唾液淀粉酶活性的研究 摘要：讨论了不同条件下唾液淀粉酶的活性差异，实验结果表明，影响唾液淀粉 酶活性的因素很多，必须在适宜的条件下，才能发挥最佳催化作用；淀粉酶具有 高度专一性，其活性受温度、ｐＨ值、激活剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多 种因素的影响；每个人产生唾液淀粉酶的量不同，活性强弱也有差异。 关键词：淀粉酶；活性；温度；抑制剂；激活剂；专一性 2影响唾液淀粉酶的活性的因素 （一）实验目的 观察淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察温度、pH、激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响。 （二）实验原理 人唾液中淀粉酶为α-淀粉酶，在唾液腺细胞中合成。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下： 淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖、葡萄糖 淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色、麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。 淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对班氏试剂呈阴性反应。麦芽糖与葡萄糖是还原性糖，与班氏试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。 唾液淀粉酶的最适温度为37-40°C，最适pH为6.8.偏离此最适环境时，酶的活性减弱。 低浓度的Cl-离子能增加淀粉酶的活性，是它的激活剂。Cu2+等金属离子能降低该酶的活性，是它的抑制剂。 （三）器材及试剂 1、器材：试管、酒精灯、烧杯、恒温水浴锅、量筒、冰浴、玻璃棒、试管夹、白磁板、试管架、铁三脚架、唾液淀粉酶 2、试剂：1％淀粉溶液、碘液、班氏试剂、0.4％HCl溶液、0.1％的乳酸溶液、1％NaCl溶液、1％CuSO4溶液、0.1％淀粉溶液 （四）操作步骤
１０ 科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ ２０１０ ＮＯ．２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ 研 究 报 告 科技创新导报α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。 目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。总产量上万吨。 近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。 本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产 α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。 １ 材料和方法 １．１实验材料 １．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。 １．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．２实验方法 １．２．１菌种激活 枯草芽孢杆菌在马铃薯固体培养基（简称ＰＤＡ）上３７℃培养１２ｈ后使用 １．２．２液体种子的制备 １００ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ马铃薯液体培养基（起始ＰＨ为自然ＰＨ），灭菌后接激活菌种悬液１．５ｍＬ，培养３６ｈ。 １．２．３发酵培养 在各淀粉液态培养基中加１．５ｍＬ液体种子，用电热恒温振荡培养箱培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。 １．２．４分析方法 酶活力测定，根据国家标准局发布的方法进行①。即１ｍＬ酶液于６０℃，ＰＨ４．８条件下，１小时液化１ｇ可溶性淀粉为１个活力单位。［①国家标准局颁布，ＧＢ８２７５－８７，１９８８－０２－０１实施］ ２ 实验结果与讨论 （１）培养温度对菌体生长和产酶的影响在不同温度下用电热恒温振荡培养箱（天津产ＳＨ６０００Ａ型）在２３℃至４４℃范围内培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），３６ｈ后测定α－淀粉酶活力。结果示于表１。菌体生长和产酶的最适温度均在３７℃。温度高于４４℃菌体生长和酶活力迅速下降。 （２）培养基对菌体生长和产酶的影响，同在最适温度３７℃下，相同的接种量、相同的种龄的枯草杆菌，比较不同比例的淀粉液体培养基产α－淀粉酶，结果见表２测定产α－淀粉酶的最适培养基为：淀粉∶水＝７５∶１００。 （３）培养时间对产酶的影响，在最适温度３７℃下，相同的接种量，淀粉与水的比例为：７５∶１００时１（最适产α－淀粉酶的淀粉液体培养基），测定枯草杆菌产α－淀粉酶最适培养时间为３６ｈ。 ３ 结论 α－淀粉酶是产量在，用途广的酶制剂 品种之一，我国目前枯草杆菌α－淀粉酶是主要品种之一，在行业应用具有重要价值。本实验采用枯草杆菌在淀粉液态培养基上产α－淀粉酶，其研究结果对以玉米或大米为主要原料的发酵造酒具有指导意义。１）在２３℃至４４℃范围内，振荡培养，起始ＰＨ为自然ＰＨ，产α－淀粉酶最适培养条件：培养温度３７℃。２）在温度３７℃下，用淀粉液体培养基发酵，当淀粉与水的比例为７５∶１００时，产α－淀粉酶酶活力最高。３）在最适温度３７℃，淀粉与水的比例为７５∶１００（即产酶最高的淀粉液体培养基）时，最佳培养时间为１２ｈ，此时α－淀粉酶活力最高。 参考文献 ［１］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验． 北京：高等教育出版社，２０００．［２］臧明玺，姜延程，李廷生．发酵助剂提高 枯草杆菌α－淀粉酶的活性研究．郑州粮食学院学报，１９９７． ［３］钟穗生等．枯草杆菌α－淀粉酶的活性 研究．太原工业大学学报，１９９７． 枯草杆菌生产α－淀粉酶的研究 哈申吐力古尔 （内蒙古通辽职业学院 通辽 ０２８０４５） 摘 要：以枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＦ７６５８）为实验菌株，以淀粉为主要原料，采用液态培养基摇瓶发酵，生产α－淀粉酶。结果表明：①在２３℃至４４℃内，培养基起始ＰＨ为自然ＰＨ，产酶最适培养温度为：３７℃②枯草杆菌在淀粉液态培养基中３７℃，振荡培养，其产酶最适淀粉水组成为：淀粉∶水＝７５∶１００；③在最适温度３７℃下，淀粉∶水＝７５∶１００时，最适培养时间为３６ｈ。关键词：α－淀粉酶 枯草杆菌 淀粉液体培养基中图分类号：Ｒ３１３文献标识 码：Ａ 文章编号：１６７４－０９８Ｘ（２０１０）１０（ｂ）－００１０－０１ 表１ 不同温度下所测糖度值 表２ 不同培养基对枯草杆菌产α－淀粉酶的影响
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养
明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：03 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法 注明：蓝色字体是已修改的 一、实验目的 1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法； 2、掌握测定酶活力的方法； 3、培养自行设计、实施实验的能力。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。 4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 三、实验材料 1、土壤样品 湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。 2、培养基 淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml 种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml
发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸 氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养 条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿 锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL） 10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备： 天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培 养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种 环等 四、实验步骤 1、样本采集 ①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。 ②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。在37℃摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 3、初筛 将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到10-6，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。取出培养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。 4、划线分离 从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将于种子培养基上划线后，再将培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。 5、镜检 挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选 一、实验目的： 1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2.巩固以前所学的微生物学实验技术。 3.学习淀粉酶活性的测定方法。 二、实验原理： 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其 是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初 步筛选、分离纯化和性能测定。 a)采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多， 然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土 壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分 解菌较多。 b)富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于 待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从 而便于我们从其中分离到这类微生物。 c)初步筛选： i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊 成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d)分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中 的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e)性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须 要进行性能测定后才能决定取舍。 三、实验材料： 1.培养基配制： a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、 NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、 Na2HPO40.2%、pH7.0。 2.主要试剂和溶液的配制： a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸