CHO细胞表达系统原理
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点
诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：
①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；
③具有重组基因的高效扩增和表达能力；
④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；
⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物
学功能方面最接近于天然蛋白分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
表1 用于生产基因工程药物的表达系统
CHO细胞表达系统常见问题及解析
1．问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？
参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。
2．问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho 细胞转染效率高吗？
参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：
1.采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。
2.WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。
3.构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。
当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！
3．问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长
参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。
无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。
4．问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1，没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问：
1.有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野
生型CHO细胞又是指的哪种？
2. 这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？
3.如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？
参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。
1.野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１
2. CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记．
3.你用pcＤＮＡ3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可. 5．问：最近作试验需要用到CHO细胞，老师从广西带回两瓶，本来用的是DMEM
培养液，由于我没有接触过细胞这方面的知识，上网查了下培养液，说1640就可以，就仓促用了1640，两天过去了贴壁很不好，估计是要完了，求救。
参考见解1：
1。带回来的细胞瓶汇合度大概多少？一般送人的细胞汇合度大概80－90％，且瓶里加满培养液，再包装。细胞生长旺盛，便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置，细胞接触不到培养液而死亡或活力下降。培养时应该分瓶培养。我想你应该分瓶了吧，我们一般1:3分瓶。不分瓶培养可想而知了。
2。如果上述没错的话，准备好正确的完全培养液，将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集，合并一下，铺底大概30％。正常培养。
3。关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。因为这细胞已很常见。方法正确不存在长不好的问题。除非你的老师带回来的细胞存在问题。
参考见解2：
37度预热胰酶，吸除培养瓶中的培养液，PBS（无钙镁）洗涤细胞1次后，加入少量胰酶，覆盖细胞即可。轻轻摇动（前后左右）。镜下观察细胞状态，一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化（防止过渡消化）。加入完全培养液（必须含胎牛血清）终止消化反应。湾头吸管顺序吹打细胞，小心避免产生气泡（对细胞有害）。镜下观察细胞，细胞分散即可后续操作。如果是新手，保留上清以防不测，别倒掉。
6．问：最近要养CHO细胞,要作些准备,但不知道其培养也是什么,谢谢参考见解：这是一篇已发表的CHO细胞培养的方法.
CHO细胞培养：CHO细胞株置于RPMI 1640 培养基中，内含10%灭活小牛血清，青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL，置于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。每隔48 h换培液，当单层培养细胞汇合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养板中，待进入对数生长期后（约24 h）加药。
这是细胞的供给源:
CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供。
7．问：这两个月，CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去，同期转瓶生长正常，基本排除细胞及培养基的问题，换罐做也出现同种现象，可排除反应器问题。与曾经在此罐上正常生长的一批相比，只是接入培养液体积由1.5升改为0.8升，其他条件均相同，反应器控制系统无异常。不知问题到底出在什么地方
参考见解：根据我自己的经验，如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话，试试一下几点：
1.接种时留一些细胞悬液，种回到方瓶或转瓶中，用与大罐相同的培养基同时培养，观察48小时内的生长情况，如果方瓶长势良好而罐子有问题，那就是操作的问题了
2.不知道你的罐子800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率，只看仪表显示是不够的，有时液位太低可能探测到的不是真实值，你可以在接种前用水试试，把各种条件设的极端一些，容易发现问题
3.有可能的话再做一次1.5L培养，看能否重现6月的结果，因为你说所有条件都一样可能是不准确的，有疏漏的地方。
8．问：我培养的cho细胞,在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好,形态也很正常,但是接入转瓶后贴壁情况很差,不伸展或伸展需要的时间很长.请问这主要是什么原因?
参考见解：我觉得可能的原因有如下几点：
1 细胞本身贴壁生长的能力较弱，一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿，这样的话，就选择塑料器皿好了。其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的，清洗干净，泡酸，冲洗干净，凉干之后，射线照射消毒或者就是紫外消毒也行，我们实验室就这样重复用培养板，没有什么问题。当然，太旧的还是扔了好了。
2 培养液PH不好也会影响贴壁，配的时候加好缓冲试剂，不嫌麻烦的话调定PH在7.2左右。使用时间较长的培养液由于在空气中暴露时间长，ph会有变化
3 消化时候处理不合适，比如胰酶消化过久，有EDTA的话，去除不干净也影响贴壁的。消化完了之后要吸干净消化液，用培养液漂洗细胞，或者吹下来之后离心，换加新鲜培养液
4 血清也可能影响贴壁，我观察过，细胞在胎牛血清中贴壁明显快于新生牛血清，尤其是Hyclone的血清，不过很贵
9．问：最近我养CHO细胞，是从别人那里得来的。给我的时候细胞有一半是圆形一半是梭形的。但是养着养着就大部分成圆形，而且有的像荷包蛋一样，而那些还是梭形的细胞里面出现了空泡一样的东西，还有渐渐像融化了一样。是什么原因，我一直很头疼，不知道该怎么办，下面的实验无法进行，苦恼啊！
参考见解：听您的描述估计很可能是支原体污染。
建议马上丢弃该细胞，因为支原体污染很难去除，为避免影响您实验室其他的细胞操作一定不要犹豫。您可以重新索取或购买状态好的CHO细胞。10．问：由于接种密度稍低一些，CHO细胞在2L转瓶中培养5天左右很难消化
下来，即使消化下来也是成团的，请问为什么？加完血清的培养基又重新过滤了，会不会对细胞的生长速度有影响，一般培养三天就能张满，谢谢
参考见解：1：首先考虑一下你的胰酶有没有问题，也有可能是胰酶的浓度不够？
2：成团也可能是细胞太多了，因此在消化时应该延长消化的时间，同时传代时尽量吹散成单细胞悬液！
3：消化后传代时多弃去些细胞试试，也可以多传几瓶，三瓶，四瓶都是可以的！
CHO细胞表达系统在疫苗研制中应用
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。1．CHO细胞表达体系及其特点
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
2．CHO细胞表达疫苗
2.1 乙肝疫苗
CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。使用酵母表达乙肝疫苗虽然获得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。而CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物制品研究所等单位研制成功了由CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。该疫苗是以S蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。
许多实验证明，乙肝病毒(rmv)衣膜蛋白的PreS部分在引发人体免疫反应中起着重要作用。因此由CHO细胞中表达的含S和PreS2基因的乙肝表面抗原，被誉为第三代乙肝疫苗。以色列生产的新型疫苗。包含了S、PreS1、PreS2等3个基因，在CHO中表达的蛋白形成22 μm大小的颗粒，含有衣膜所有的抗原表
位。
目前已投入市场的CHO表达基因重组乙肝疫苗主要有：法国巴斯德研究所Gen Hevac B、以色列Bio-Technology General公司的Bio-Hep-B、瑞士的Hepreeombe等。在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的同时，CHO表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。中国长春生物制品所的乙肝疫苗已正式生产。在现有的安全性记载中，动物细胞表达的生物产品尤其CHO表达的产物的安全性很好。在已批准进入临床或生产的动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。
在免疫原性方面，我国CHO生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫苗。还有调查显示，新生儿接种国产乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs阳性率为98.25％，抗体GMT为77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗HBs阳性率在73.3％～93.5％之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的CHO 乙肝重组疫苗及鼠细胞表达的乙肝疫苗在T细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激T细胞产生帮助引起更高的血清转化率和更高的抗HBs滴度。
2.2 Epstein-Ban-病毒(EBV)疫苗
象其他疱疹病毒一样，EBV外周包绕一层脂质包膜。主要由gp340(有报道为gp350)和gp220两种糖蛋白组成，分子量分别为340kDa和220kDa。gp340/220具有广泛的糖基化位点，其多糖部分占整个分子量的50％以上，因此，哺乳动物细胞是其最适宜的表达宿主。将含gp340/220基因的重组载体，转染CHO-A6细胞系和CHO dhfr-细胞系，经筛选获得可表达gp340/220蛋白的细胞株，经纯化的gp340/220免疫小鼠。2周后小鼠血清中检测到明显的gp340/220特异性抗体，表明CHO细胞表达的gp340/220具有同天然膜抗原相似的分子量、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为EB病毒基因工程亚单位疫苗。
国外有研究也将gp340/220基因克隆构建重组载体，但经过定点突变使之只合成gp340蛋白。该种蛋白同样能被抗gp340220的单克隆抗体所识别，并具有同EBV受体、CD21结合的能力，说明重组蛋白同野生型EBVgp340/220结构相似。用重组蛋白免疫兔子，获得了高滴度的抗体，所产生的抗体可以中和野生型EBV。
2.3 艾滋病病毒(HIV)疫苗
HIV基因组中的三大结构蛋白编码区分别编码核心蛋白Gag、聚合酶Pol 和外膜蛋白Env。Env的前体单位为糖蛋白gpl60，加工后形成膜外蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。目前针对HIV病毒研制的疫苗有多种：减毒活疫苗、灭活疫苗、载体活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗及重组亚单位疫苗。
其中不同宿主细胞表达的以Env、Gag、Pol等蛋白为靶抗原的多种亚单位疫苗在国外进入了临床实验。其中CHO细胞表达的gpl20制成的疫苗为较早研制的一种。重组载体转入CHO-L761h细胞系，获得可持续分泌gpl20蛋白的细胞株。
纯化后的蛋白同3种常用免疫佐剂免疫兔子，均诱导了高滴度的免疫反应；给猩猩接种也可以保护机体免受由低剂量的同类HIV毒株攻击而导致的感染。但是在泰国给数千人免疫接种后无明显的保护效果。不过。在恒河猴接种gp120疫苗的同时注射CHO表达的重组白介素12(ILl2)。所诱导的抗体水平是单一接种gp120疫苗的10倍；而新的I临床使用表明，受试者免疫重组痘病毒疫苗后。再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。
3．小结
由于CHO表达系统具有完善的翻译后修饰功能。对于一些特定的蛋白,特别是糖基化程度高的蛋白来说。是最为合适的表达体系。因此，除了以上介绍的3种病毒疫苗外。丙肝病毒、水痘一带状疱疹病毒亚单位疫苗在CHO细胞中的表达在国内外均有研究。但CHO表达亚单位疫苗还存在着一些问题：
(1)单一的亚单位疫苗往往具有免疫原性弱的缺点；
(2)CHO细胞培养成本高、条件难控制。在一定程度上限制了CHO细胞表达亚单位疫苗的发展。
因此,应进一步研究CHO表达系统，对表达载体进行改造使之能容载更大片断的蛋白基因并提高表达量；改造CHO细胞使之更利于大规模生产；改进发酵工艺、纯化工艺。使CHO培养成本降低。
CHO细胞表达系统研究进展
影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达调节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。
转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是CHO细胞高效表达外源基因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件，主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。
1 启动子
启动子是影响外源基因表达效率的关键因素，因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、LTR和CMV在CHO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子>LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。T7启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO 细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP 之后EPO基因的前导序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、组成型启动子。SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。
与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。病毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA 帽子位点附近，从而形成紧密型表达载体CHO细胞中一般使用SV40和CMV 增强子。增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。
2 外源基因
位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。外源基因的结构可在翻译水平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。但是在启动子一定的情况下，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：
①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列；
②引入一个促进mRNA翻译的序列；
③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜
结合蛋白的输出等；
④在不改变基因氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题；
⑤尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5‘未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3未译区(3-UTR)对mRNA稳定性的不良影响。例如，人G-CSF 基因的3-UTR中富含AT元素（ARE)，ARE与mRNA的半衰期有关，切除AR 以增加mRNA的稳定性，提高蛋白质的合成；
⑥转染靶细胞中导人表达载体启动子相应的强反式激活因子是提高外源基因表达的新策略。
3 终止区域
为了使外源基因得到准确表达，其后是强的终止子区域。终止子一般从病毒基因组，如SV40、T抗原终止信号、肝炎表面抗原序列或β-珠蛋白等中获得。不同的3'-未编码区(UTR)序列能影响重组系统的表达。Rotondaro等使用两个不同的3'-未翻译区表达人G-CSF，结果包含兔β1-珠蛋白基因第二内含子和聚腺苷酸信号的3'-UTR的表达效率高于包含SV40小t内含子和早期区域腺苷酸化信号的3'-UTR的表达效率。
4 选择标记
要从细胞中选择出获得了外源DNA并稳定转化的动物细胞是很困难的。为此，人们在表达质粒或另一个质粒上，克隆或构建了许多选择性标记。目前有十余种选择性标记可供使用。最常使用的有DHFR、Neo和GS等基因。为了便于过程分析，研究者们还在CHO细胞中构建了一些具有特殊物理性质的报告基因。如Trudy H等人将E.coli Lac z基因克隆到载体上，通过简单的比色实验便可快速测定出β-半乳糖苷酸的活性，细胞在无菌条件下分析后还可继续培养。分泌碱性磷酸酶的基因也有类似的功效。其它类型的报告基因在检测时不甚便利，因为它们或者要求放射性基质，或者要求特殊仪器以测定发光物质或荧光物质。
5 基因扩增
外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和扩增基因表达单元。扩增基因往往亦为选择标记。
迄今为止，世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统，其中二氢叶酸还原酶(dhfr)基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。而谷氨酰胺台成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。宿主细胞为CHO-k1细胞。在这个系统中质粒pEEl4被整合人染色体，使外源基因在人巨细胞病毒(h-CMV5)和SV40 3'-端控制下进行表达。选择标记基因是从SV40晚期启动子转录而来，其中包括一个小基因，一个内含子和3'-侧翼约lkb DNA。GS基因的选择压力是低水平的MSX，在这一选择压力下，细胞内的外源基因拷贝数可达1000-2000拷贝/细胞。GS基因扩增前后，CAT基因的表达水平提高了19-20倍左右。与dhfr 基因扩增系统相比，GS系统具有更高的扩增效率。Bebbinglon等人利用GS系统生产嵌合抗体，表达水平达200-500mg/106/48h。
CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望
存在的问题
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：
①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低；
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
前景展望
在今后的若干年内，随着以CHO细胞为主的动物细胞表达系统日趋完善，动物细胞将可能成为生产基因工程药物的主要宿主细胞。围绕CHO细胞表达系统而进行的相关研究将成为生物工程领域一个活跃的研究热点。科研人员将把以下问题作为今后的主攻方向：
①提高表达水平，如发展一些新的强启动子，寻找合适的增强子，装配适合于cDNA高效表达的必要元件以及根据CHO细胞翻译特点调整外源基因密码子等；
②在进一步提高表达水平的同时．还将注重分离纯化的问题，如改变DNA 中的个别序列，使表达产物在不影响生物活性的前提下，携带有利于分离纯化的基团；
③细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化、自动化精巧化；
④分离纯化的低成本和高活性回收率。
CHO细胞表达系统原理 分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点 诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。 基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。 针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点： ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。 但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物
蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力； 氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。 1. CHO细胞表达体系 常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。 2. 载体系统 借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。 2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV 和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，
cho细胞表达系统及筛选原理 Cho细胞表达系统及筛选原理 一、引言 Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。 二、Cho细胞表达系统的原理 Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。 1. 转染 将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。 2. 选择性筛选 为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。 3. 扩增和表达 经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模
蛋白质表达。通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。 4. 蛋白质纯化 经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。 三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用 Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。 1. 高表达水平 Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。 2. 真核细胞表达 与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。 3. 可选择性筛选 通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。 4. 灵活性
CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗 来源：易生物实验浏览次数：533 网友评论0 条 CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗 关键词：细胞疫苗CHO细胞表达体系CHO细胞表达 分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 1、CHO细胞表达体系及其特点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) 突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。 与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 2、CHO细胞表达疫苗 （1）乙肝疫苗 CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。使用酵母表达乙肝疫苗虽然获得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。而CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物制品研究所等单位研制成功了由CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。该疫苗是以S 蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。
MSX加压筛选与MTX加压筛选 蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力； 氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。 1. CHO细胞表达体系 常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。改造CHO 细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。 2. 载体系统 借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。 2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO 细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR 启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来 实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差别，因此我们认为在进行外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强启动子，才
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．xx酵母细胞表达系统 （1）特点 自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白时，已成功放大到100升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；
C H O细胞表达系统常 见问题及解析 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
1、问：请问有人养过CHO细胞吗文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞cho细胞转染效率高吗 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有： （1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长
CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能 够更进一步的对两个表达系统有更深的了解。 与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接 近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到100 0L以上，可以大规模生产。
CHO细胞基本知识 引言 CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种常见的哺乳动物细胞系，常被用于生物技术领域的研究和应用。CHO 细胞具有诸多优点，如易于培养、较高的复制速度和稳定性等，使其成为生物药物生产的重要工具。本文将介绍CHO细胞的 基本知识，包括其来源、特点、培养条件和应用等方面。 来源 CHO细胞最初来源于中国仓鼠卵巢组织，1957年被美国科学家狄利克(Dilworth)和哈普斯特(Hamster)首次成功培养。 经过多年的研究和改进，CHO细胞逐渐成为工业界主要采用 的细胞系之一。现在，CHO细胞已经被广泛应用于生物制药 行业，特别是重组蛋白的生产。 特点 CHO细胞有许多特点使其成为生物药物生产的理想细胞系。
1.易于培养：CHO细胞相对容易培养，可以在常规的 培养基中生长。其生长要求较为简单，包括适当的培养基、温度、pH值、营养物质等。 2.高繁殖速度：CHO细胞的繁殖速度较快，在适宜的 培养条件下，细胞数量可以迅速增加。这对于大规模的生 物药物生产非常有利。 3.稳定性：CHO细胞在长期培养过程中具有较高的遗 传和表达稳定性。这对于生物药物的一致性和稳定性非常 重要。 4.多样性：CHO细胞可以表达多种重组蛋白，包括抗 体、生长因子、酶等。这使得CHO细胞在生物制药领域有广泛的应用前景。 培养条件 CHO细胞的培养条件对于细胞的生长和表达产物的质量具 有重要影响。以下是一些常用的培养条件： 1.培养基：CHO细胞通常使用含有葡萄糖和氨基酸的 培养基，如DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi um）或RPMI 1640。培养基中还可以添加胎牛血清（FBS）或
cho细胞表达 Cho细胞表达是指在生物学中，利用Cho细胞（Chinese Hamster Ovary cells）作为表达系统来表达外源蛋白质的过程。Cho细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有较高的蛋白质表达能力和稳定的遗传特性，因此被广泛应用于生物医学研究和制药工业中。 Cho细胞表达系统的优势在于其能够高效地表达外源蛋白质，并能够正确地折叠和修饰蛋白质。Cho细胞具有相对简单的遗传背景和较低的背景蛋白质表达，可以避免其他细胞系统中常见的问题，如蛋白质聚集、不稳定、部分折叠等。此外，Cho细胞的培养和维持相对容易，生长速度快，适应不同的培养条件，对不同的基因表达系统都具有较高的兼容性。 Cho细胞表达系统的应用范围广泛，包括生物医学研究、药物发现与研发、生物制药等领域。在生物医学研究中，Cho细胞表达系统常被用于产生重组蛋白，如抗体、细胞因子、酶等，用于研究蛋白质功能、结构与机制。在药物发现与研发中，Cho细胞表达系统被用于产生药物靶标蛋白、药物载体、药物代谢酶等，用于筛选和评价药物候选化合物。在生物制药中，Cho细胞表达系统常被用于大规模生产重组蛋白药物，如单克隆抗体、重组蛋白等。 Cho细胞表达系统的建立和优化需要考虑多个因素。首先，选择合
适的载体和表达系统是关键。常用的载体包括质粒、病毒载体等，表达系统可以是稳定转染系统或转染后选择稳定表达细胞的系统。其次，选择合适的表达宿主细胞株和培养条件也十分重要。Cho细胞的培养基和培养条件需要根据表达蛋白的特性和需求进行优化，包括培养基成分、温度、pH值、培养密度等。此外，还需考虑到蛋白质折叠、修饰和纯化等后续步骤。 Cho细胞表达系统的优势也存在一些限制和挑战。首先，Cho细胞是一种非人类细胞，因此相较于人类细胞，其表达的蛋白质可能存在差异。其次，Cho细胞在遗传稳定性和蛋白质表达水平上存在一定的变异性，需要进行筛选和优化。此外，Cho细胞的培养和维持相对费时费力，对于大规模的生产需求可能不太适用。 Cho细胞表达系统是一种常用且有效的表达外源蛋白质的系统。其优势在于高效、稳定地表达蛋白质，并能够正确折叠和修饰蛋白质。Cho细胞表达系统在生物医学研究和制药工业中有着广泛的应用前景。但在应用过程中，需要综合考虑多个因素，并在实验中进行优化和验证，以获得最佳的表达效果。
MSX加压筛选与MTX加压筛选 分子生物与细胞培养 蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力； 氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。 1. CHO细胞表达体系 常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。 2. 载体系统 借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。 2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细
蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfo*imine, MS*)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因〔glutaminesynthetase, GS〕系统压力； 氨甲喋呤〔amethopterin, MT*〕筛选用的是二氢叶酸复原酶基因〔dihydrofolatereductase, dhfr〕系统压力。 1. CHO细胞表达体系 常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸复原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子构造、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于别离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进展悬浮培养或在无血清培养基中到达高密度，培养体积能到达1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的别离纯化。改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因〔细胞凋亡抑制基因〕导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长〔细胞静止〕，改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品本钱降低。 2. 载体系统 借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。 2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用*围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中别离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究说明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子〔EF-1α〕、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个适宜的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差异，因此我们认为在进展外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强启动子，才有可能获得较为理想的表达效果。与启动子相连的是增强子元件，具种、组织特异性，CHO细胞中一般采用SV40和CMV增强子。 2.2选择标记和基因扩增CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸复原酶基因〔dihydrofolatereductase，dhfr〕，谷氨酰胺合成酶基因〔glutaminesynthetase，gs〕。外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。dhfr基因扩增系统最常用，当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后，或携带dhfr
蛋氨酸亚氨基代砜(ｍｅｔhiｏniｎe sulfｏximine, MＳX)筛选用得就就是谷氨酰胺合成酶基因(gｌutaminｅsynｔhetasｅ,GＳ)系统压力； 氨甲喋呤（amethｏpterin, ＭＴX)筛选用得就就是二氢叶酸还原酶基因(diｈydrofolateredｕc ｔaｓe，dhfr)系统压力。 １、CHO细胞表达体系 常用得CHO细胞系有两种：CHＯ与CHO(dhfｒ-),CＨO(ｄhｆr-）就就是缺失二氢叶酸还原酶得细胞株。ＣHＯ表达系统就就是目前应用最广泛得真核表达系统之一,与其它表达系统相比，它具有许多优点:准确得转录后修饰功能,表达得糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性与生物学功能方面最接近天然蛋白分子;表达产物胞外分泌,便于分离纯化;具有重组基因得高效扩增与表达能力;贴壁生长,有较高得耐受剪切力与渗透压能力,可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到100０Ｌ以上；ＣＨO细胞属于成纤维细胞,很少分泌内源蛋白,利于外源蛋白得分离纯化。改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡得发生,将bcl－2基因(细胞凋亡抑制基因)导入细胞，bcl-２基因得过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起得细胞凋亡,减少细胞特定营养成分得消耗，提高细胞密度与目得蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因,可使细胞G1期延长（细胞静止),改造后细胞活力正常,营养成分消耗与代谢毒物含量有效降低,从而减少细胞凋亡、死亡,外源蛋白表达量提高,产品成本降低。 2、载体系统 借助真核基因表达调控得理论,可将较强得顺式作用元件集中到一个载体中,使其方便高效地表达外源基因。目前,已经构建了许多真核表达载体,它们包含适当得顺式作用元件与选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切与Poｌy A信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记:非扩增基因与共扩增基因。 2、1启动子与增强子启动子就就是影响外源基因表达效率得关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强得转录活性，又应具备较广得应用范围。细菌得主要启动子与增强子在动物细胞中不起作用,所以大多从启动效率高且生物背景清楚得病毒基因组中分离得到。SV4０、LTR与CＭＶ启动子在CＨO细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中,CＭV 启动子得转录活性分别就就是SV40启动子与LTR启动子得10倍与30倍左右。来源于噬菌体得一些启动子,如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源得启动子,现在热衷于寻找细胞内源性得启动子,如肽链延长因子基因得启动子(ＥF－１α)、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。ＥF-1α启动子就就是迄今应用中最强得启动子之一。目前商业化得表达载体中主要使用SV４0、ＣＭV与EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中得表达受许多因素得影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平得调节最为重要。在细胞中转录水平得调控就就是由基因得顺式作用元件与细胞内存在得反式作用因子之间得相互作用来实现,由于在特定得细胞内,反式作用因子就就是固定得,不可改变得，因此基因得表达主要取决于其顺式作用元件得作用。对外源基因而言,也就就就是决定于特定得表达载体中得启动子，一个合适得启动子可将外源基因得表达水平提高几倍甚至几十倍。但就就是对于特定得基因与细胞,各启动子起始转录得效率有很大得差别,因此我们认为在进行外源基因得表达研究中,应考虑选用几种不同得强启动子,才有可能获得较为理想得表达效果。与启动子相连得就就是增强子元件,具种、组织特异性，CHO细胞中一般采用SV40与CＭV增强子。 2、2选择标记与基因扩增CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类就就是nｅo等非扩增基因,它对目得基因得拷贝数没有影响,用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增得功能,也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因(dihｙｄrｏfｏlateredｕcｔａse,dhfr),谷氨酰胺合成酶基因(gｌuｔamiｎesynthetase,gs)。外源基因在ＣHO细胞中扩增就就是提高表达