6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验试剂及配制：
a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。
b,变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。
C, 固定液。100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。
d, 银染液。硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。
f, 显影液。无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。
DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程
6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。
电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。
漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍，
每次 2 ～ 3 min。
染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇
动染色 30 ～ 40 min。
显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后
立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显
影直到带型完全出现。
定影:将出现带型的胶板放入固定液中定
影 2 ～ 3 min，再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。
干胶:胶板置于室温自然干燥。
带型统计
改良方法：a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO
b,漂洗蒸馏水2-3s
C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min
d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。
RNA的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA非变性琼脂糖凝胶检测 实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1×TAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致28S 和18S 条带分不开。使用2ug 上样量，电压小于6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以DNA 标准为参照，28S 和18S 分别位于2.0kb 和0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。
变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢。由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用的分子标记方法。 DGGE最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。这一技术能够提供群落中优势种类信息，并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化。而且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析，鉴定群落组成。DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度，可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。 DGGE的基本原理及方法： DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示： 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000－2000 460 100 5.080－500 260 65 8.060－400 160 45 12.040－200 70 20 15.025－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶： （1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类 有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。 在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部 分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白 质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。 Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移 到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。 1.2 Clear Native PAGE Clear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。 Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳
变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用 变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用 【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用 【中图分类号】r919．2 【文献标识码】b 【文章编号】1007—9297(20xx)02—0063—04 随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基 因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多 样性均与基因的突变有关。因此，对基因突变的筛选 或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意 义。近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷 的同时，经典的方法也不断得到改进。其中。由fischer 和lerman[ ，2】创立的变性梯度凝胶电泳(denaturing gra— dient gel electrophoresis，dgge)历经多次改良，已发展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛 应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态 性分析、微生物种群研究等各个领域。 一 、dgge基本原理 dgge是利用dna的物理性质进行突变分析的。 其原理是基于待测dna 片段双螺旋的解链温度 (melting temperature。tm)。tm值由dna片段的碱基数目和碱基组成共同决定。主要引起低温解链区域解 链。当dna片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线 性梯度增加的凝胶中电泳时。起初双螺旋dna片段 以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性 效果相当于其tm值的变性剂浓度点时．双链dna开 始部分解链．部分解链后的dna分子呈分枝状使其 迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。长度相同 但序列不同的dna片段。即使仅存在单个碱基改变。 也将影响邻近碱基间的相互作用．导致tm值的改变． 从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样dna 片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。 上述原理仅能检测dna片段中低温解链区存在 的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检 出．因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全 解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。基于此．可 通过克隆或pcr方法在待检目的片段的5 端引入 3o 5o个gc碱基组成的寡核苷酸链．即gc—clamp。 使其成为片段中tm最高的区域，从而使目的片段高 温解链区解链时dna双螺旋不至于完全解链成单 链，极大增加dgge的突变检出率。[3]
6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验试剂及配制： a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。 b,变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。 C, 固定液。100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。 d, 银染液。硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。 f, 显影液。无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。 DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程 6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。 电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。 漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍， 每次 2 ～ 3 min。 染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇 动染色 30 ～ 40 min。 显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后 立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显 影直到带型完全出现。 定影:将出现带型的胶板放入固定液中定 影 2 ～ 3 min，再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。 干胶:胶板置于室温自然干燥。 带型统计 改良方法：a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO b,漂洗蒸馏水2-3s C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验 【实验目的】 掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。 【实验原理】 在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。 【仪器、材料与试剂】 1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。 2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。 3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。 5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至250mL，过滤并排气。 6.染料：40%(W/V)蔗糖，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青和30%甘油。 7.塑料胶框、梳子和垫片，两个用于固定胶框中玻璃片的塑料支架。 8.一有柄和一无柄的两片玻璃板(尺寸：17.78cm 宽×20.32cm 长×0.635cm 厚)，有柄的玻璃板有一个13.97cm 宽，2.54cm 厚的突出。
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及 步骤 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影：
此文档下载后即可编辑 基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且 由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化 程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据 检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象， 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过
SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 简介： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE)，其原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE 凝胶，也可配制非变性(native)PAGE 凝胶，具体配制的量应根据器具大小决定。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制10%过硫酸铵：直接在Ammonium Persulfate 中加入蒸馏水，充分溶解，分装 成小份储存于-20℃或4℃。注意：一般用1.5mlEP 管分装成0.5-1ml 每支，-20℃保存，每支使用2-3次即弃用。短期使用时，可保存于4℃，1周有效。 2、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶(下层胶)： 不同浓度的SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围： SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 成分 配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积(ml) 编号 名称 PE0018 30T Storage 试剂(A): 30% Acr-Bis(29:1) 100ml 4℃ 避光 试剂(B): 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 100ml RT 试剂(C): 10% SDS 5ml RT 试剂(D): Ammonium Persulfate 0.5g RT 试剂(E): TEMED 2×1ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验 一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制溶液： 1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存） 2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月） 3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml） 4、TEMED 5、20-200 DNA marker 6、尿素 实验步骤： 1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素 6.1ml water 3.3ml 30% Acrylamide 1ml 10 ×TBE 0.11ml APS 0.01mlTEMED 2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。 3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合 的丙烯酰胺。 4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部 的三分之一处，大约需要60-90分钟。 二银染实验 银染溶液的配置：实验之前准备4℃水 1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行） 2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须 储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行） 3、显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液 （通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将2.48g Na2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。 注意事项： 1、染色液和显影液要现用现配； 2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃； 3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作； 4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色； 5、显色不能在透光的盒子中进行； 6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方 一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘； 7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶是具有分子筛作用的网络结构。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰胺凝胶。 在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质可以保持完整的状态，并根据蛋白质的分子量，蛋白质的形状和附着的电荷量逐渐彼此分离。在DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，DNA以双链状态游动，其迁移率受碱基组成和序列的影响。 在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，变性剂通常为SDS（SDS-PAGE），变性剂通常为尿素和甲酰胺。蛋白质的SDS-PAGE技术由Shapiro于1967年首次建立。他们发现，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子量（电荷因子可忽略不计），加入离子去污剂和强还原剂（SDS，十二烷基样品介质和丙烯酰胺凝胶。 SDS是一种阴离子洗涤剂。作为变性剂和增溶剂，SDS可以破坏分子之间的氢键，展开分子并破坏蛋白质分子的二级和三级结构。诸如巯基乙醇和二硫苏糖醇之类的强还原剂可以破坏半胱氨酸残基之间的二硫键。将还原剂和SDS加入样品和凝胶后，分子解聚成多肽链。解聚的氨基酸侧链与SDS结合形成蛋白质SDS胶束。聚合物的负电荷远高于蛋白质的原始电荷，因此消除了不同分子之间的电荷和结构差异。
通常，不连续缓冲系统用于SDS-PAGE，其分辨率高于连续缓冲系统。 浓缩胶的作用是积聚，凝胶小，孔径大，将较薄的样品加入到增稠胶中，通过大孔胶的迁移作用将其浓缩到狭窄区域。当选择Tris / HCl缓冲溶液作为样品溶液和浓缩凝胶时，选择Tris /甘氨酸作为电极溶液。电泳开始时，HCl分解为氯离子，甘氨酸分解为甘氨酸离子。蛋白质带负电荷，因此它们一起移动到正电极。氯离子最快，甘氨酸离子最慢，蛋白质在中间。电泳开始时，氯离子的迁移率最高，高于蛋白质。因此，在电泳的背面形成低电导率区域，并且电场强度与低电导率区域成反比。因此，产生更高的电场强度，这使得蛋白质和甘氨酸离子快速移动以形成稳定的界面，这使得蛋白质在移动的界面附近聚集并浓缩成中间层。 在这种方法中，蛋白质的迁移率主要由其相对分子量决定，与电荷和分子形状无关。
凝胶电泳
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论文题目：凝胶电泳 专业：化学 年级：10级 学号：10101550203 姓名：马慧 摘要 凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，也可称为扁平式电泳法，是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。它是以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法，如质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者 免疫印迹检测之前，进行部分提纯分子。通过学习，了 解凝胶电泳的类别、原理、特点及其应用范围。 关键词：制备，类别，定义，原理，特点，应用范围 正文 一、凝胶制备 1、设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris?HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris?HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 2、凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。 5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步 骤 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影：
变性梯度凝胶电泳 摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。它们在突变分析上都有着重要的作用。 关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳 1、前言： 随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。 2、基本原理 2.1变性梯度凝胶电泳 由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性荆有尿素(urea)和甲酰胺(formamide)。根据DGGE变性梯度方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的DGGE：垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样本的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成；平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样本。检测某种突变的变性剂浓度一般通过变性
Native-PAGE原理 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 实验方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。 工作液配制 1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存； 5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH 6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；
DGGE的基本原理 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis变性梯度凝胶电泳)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。 DGGE实验 一． 1.制胶：使用梯度胶制备装置，分别制备30%和60%的变性胶。 DGGE制胶参数 制胶30%变性胶的配置20（ml）60%变性胶的配置20（ml）40%丙烯酰胺（Bis-Acr）5ml 5ml 50×TAE 400ul 400ul Formamide去离子甲酰胺 2.4ml 4.8ml 尿素（urea） 2.52g 5.04g DdH 2 O 定容至20ml 定容至20ml 最后加（几分钟内凝固）10%AP(APS) 100ul 100ul TEMED 20ul 20ul 试剂配方： 40%丙烯酰胺（Bis-Acr）： Acrylamide 丙烯酰胺 38.93g Bis-acylamide 双丙烯酰胺 1.07g 蒸馏水定容至100ml 50×TAE： TrisBase 242.0g 冰醋酸 57.1ml EDTA o.5M PH 8.0 100ml 去离子水定容至1000ml。 10%APS； Ammonium persulfate 过硫酸铵 0.1g，蒸馏水定容至1.0ml. 2.灌胶 具体步骤见设备说明 3.点样 缓冲液加热至60℃后准备点样。 将45微升的PCR产物和5微升6×loading buffer 混匀后加入上样孔。若PCR产物亮
非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体 现在哪里？ 作者: 墨池(站内联系TA)收录: 2011-07-31 发布: 2011-07-21 1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？ 2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？ 谢谢(*^__^*) 嘻嘻 收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。 2. SRAP（貌似叫什么...相关序列扩增多态性）标记这个应该是非变性PAGE，6%的PAGE胶配方就不用发了吧，google一下一大堆。TEMED和过硫酸铵都是最 Originally posted by holyala at 2011-07-21 2121: 1. 变性胶加尿素或者其他变性剂，非变性胶是不加的。一般做RNA分离或回收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。 2. SRAP（貌似叫什么...相 ... Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2138: TEMED和过硫酸铵的先后呢？ Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2019: 1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？
2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？ 谢谢(*^__^*) 嘻嘻 1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。 2.SRAP一般用变性的聚丙烯酰胺，毕竟片段还是比较小。 3.配胶时不用加入过硫酸铵，灌胶前同时加入过硫酸铵(注意有毒！低温保存)和TEMED（也有毒，特臭）。 另外，这些问题貌似分子克隆那本书非常详细，只不过SRAP标记较新而已，没 Originally posted by changes at 2011-07-21 2107: 1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。 2.SRAP一般 ... Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2104: 你说SRAP是变性的，我看师姐的配胶过程没有一点体现变性的物质。 非变性胶也可以，但是分辨率会低些。另外，你是用SRAP标记做什么的，多态 Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 0727: APS和TEMED虽然不好，但也比不上丙烯酰胺有神经毒性，可随皮肤渗入人体，所以我是什么东西都加完之后最后加丙烯酰胺。 ...额~~话说我们一般都是把丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺配成40%的母液，用的时候根据所需要的浓度加一定量的母液即可。要是每次都搞丙烯酰胺来配，那谁