实验五人的外周血淋巴细胞培养
一、实验原理
外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
二、实验目的
掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。
三、实验材料
人的外周血。
四、实验器具和药品
1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。
2．器皿的清洗和消毒
玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。
将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。
隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。
3．药品
(1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO，
1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。
(2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。
(3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。
(4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。
盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
酒精乙醚提取法：四季豆50g，先用生理盐水洗净。将豆浸入60ml盐水中，保存于4℃冰箱内，24h 后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加140ml盐水，置4℃冰箱中24h，取出后以6000转／min离心20min，吸取上清液，调pH至5.6(用0.1mol／L HCl调)之后，每100ml上清液加40ml无水酒精，加以搅拌，以3000转／min离心15min，取上清液，弃去沉淀。在每100ml上清液中加170ml10％乙醚无水酒精(10ml 乙醚十90ml无水酒精)以3000转／min离心15min，取沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的抽气干燥器中抽气2—4d，沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以0.85％NaCl液配成1％的溶液，此PHA溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。使用时每5ml培养物加0.1ml即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的PHA溶液便无需用细菌滤器过滤。
(5)抗菌素
青霉素(以每瓶40万U为例): 以4ML生理盐水(或培养基)稀释，则每ML含10万U。取1ml加入100ml培养基中，则最终浓度为100U／ml。
链霉素(以每瓶50万U为例)：以2ml生理盐水(或培养基)稀释，则每ml含25万U。取0.4ml(含10U)加入1000ml培养基中，则每ml含100U(即100μg)。(100万U=lg，lg=1×106μg)。
(6)姬姆萨染液：0.5g姬姆萨粉末，加33ml纯甘油，在研钵中研细，放在56℃恒温水浴锅中保温90min，再加入33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液(pH7.4)1：10稀释。
(7)0.1mol／L磷酸缓冲液：pH7.4—7.6
A. Na2HPO4·12H20 28.8g
KH2PO4(无水) 2.67g
溶解于1000ml双蒸水中。
B. Na2HPO4·7H20 2.164g
NaH2PO4·2H20 0.3g
溶解于1000ml双蒸水中。
五、实验步骤
1．培养液的分装：在无菌室或接种罩内，用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶，每瓶量为：培养液(RPMIl640或M199) 4ml
小牛血清lml
PHA 0.2ml
肝素0.05ml
双抗(青霉素加链霉素)培养液中最终浓度各为: 100U／ml
用3.5％NaHCO3调pH到7.2—7.4，分装到20ml的玻瓶中，用橡皮塞塞紧，待用或置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。
2．采血：用2ml灭菌注射器吸取肝素(500U／ml)0.05ml湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约0.3ml，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内(内含有生长培养基5ml)接种，轻轻摇动几次，直立置37℃±0.5℃恒温箱内培养。
3．培养：置37℃温箱内培养66—72h。
4．秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为40μg／ml的秋水仙素0.05—0.lml，最终浓度为0.4—0.8μg／ml，置温箱中处理2—4h。
5．低渗处理：低渗液的种类较多，如0.075mol／L的KCl溶液，0.95％的枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释4倍的Hanks液，也可直接用蒸馏水。秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液5毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置37℃温箱内处理20min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。
6．离心:以每1000rpm/min，离心5min，弃去上清液，收集白细胞。
7．固定：固定液为甲醇：冰醋酸：3：1。每只离心管中，加入固定液2－4ml，片刻后用滴管轻轻冲
打成细胞悬液，在室温中固定15min后，离心，吸弃上清液，留下白细胞。
8．再固定：加入固定液2ml，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15min(过夜也可以)。
9．再离心：除去上清液，留下白细胞制片。
10．制片:向上述离心管中滴入固定液0.5毫升，用滴管小心冲打成悬液，从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液1—3滴，用嘴轻轻吹散，用电吹风吹干，或在酒精灯火焰上微微烤干。
11．染色：用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释后的姬姆萨染色液染色20min，然后倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。
12．镜检：待稍午后，在显维镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。
13. 封片：用加拿大树胶封片。选择染色体清晰，分散度好的细胞进行显微摄影，进行核型分析(见图20—1)。
图20-1 人体外周血培养与染色体标本制作示意图
六、实验注意事项
1．接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后24h内进行培养，如果不能立刻培养，应置于4℃存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。
2．在培养中成败的关键，除了至为重要的PHA 的效价外，培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37+0.5℃。培养液的最适pH7.2—7.4。
3．培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡厂使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。
4．制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开；可将固定时间延长数小时或过夜。
七、实验结果
1．
核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY 女子是46，XX(见图20—2)。
图20-2 人淋巴细胞染色体(46, XY)
求取以下三个参数：
(1) 染色体的相对长度=染色体长度
条条常染色体总长单个染色体长度X 1221000+? （2）臂比率=短臂长度
长臂长度 （3）着丝粒指数=
100?染色体全长短臂长度 可以将人的46条染色体分成A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 七组，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。 参考文献
项维，吕曼硎，7(1963)，《科学通报》，科学出版社，北京。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析 一、实验背景 1、Carnoy固定液： 固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。 2、低渗液（hypotonic solution） 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。 2、肝素 N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。 2、PHA 植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。 3、青霉素和链霉素 青霉素：青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。 链霉素对许多革兰阴性杆菌有抗菌作用。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。链霉素的作用在PH值为7.8时最强，PH值降至6或6以下时则大大减弱。四环素作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。 4、秋水仙素 秋水仙能素破坏纺锤体,阻断细胞有丝分裂,使分裂的细胞全部阻止在中期。实验中要严格控制培养物中秋水仙素的浓度,不仅保证有效的终止细胞第一次分裂,而且使秋水仙素的细胞毒
https://www.doczj.com/doc/1a16418273.html,/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞 分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。 我的经验 1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！） 3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 4. 离心 .转速：1500/分 温度20c －28c 时间：20分钟 no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) 5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞 6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！ 7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。 8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！) 时间：10分钟 温度：4c 9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你） 10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？ 11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形. a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数） b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞 c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形 d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度 e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？） 12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱. 看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！ 1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是 2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的 3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团 建议; 不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
坐骨神经——腓肠肌标本和腓肠肌标本制备 二、实验原理 三、1、蛙或蟾蜍等两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织生活条件易于掌握，在任氏液的浸润下，神经肌肉标本可较长时间保持生理活性。因此，在生理学实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经腓肠肌离体标本来观察神经肌肉的兴奋性、兴奋过程以及骨骼肌收缩特点等。 2、细胞的静息膜电位为外正内负，电刺激可改变可兴奋细胞的膜电位差。膜电位减小时，细胞去极化，细胞兴奋；膜电位增大时，细胞超极化，细胞兴奋性被抑制。蘸有任氏液的锌铜弓接触活组织时，可产生沿锌片—活组织—铜片流向的电流对细胞产生刺激效应。 四、实验步骤 1、洗净实验动物→毁髓→剥制后肢→分离坐骨神经→游离腓肠肌→游离股骨头→标本检验→电刺激极性法则的验证 2、双毁髓 一只手握住牛蛙，使其背部向上。用拇指压住牛蛙背部，食指按压其头部前端，另一只 手持毁髓针，由两眼之间沿中线向下触划，触及凹陷处即为枕骨大孔。将毁髓针垂直刺入枕骨大孔。将针尖向前刺入颅腔内搅动，此时为单毁髓；将毁髓针退回枕骨大孔，针尖转向后方，与脊椎平行刺入椎管内捣毁脊髓，完成双毁髓。 3、坐骨神经-腓肠肌标本制备（1）剥制后肢标本:轻提双毁髓蛙，自背面耻骨联合上方约1公分处横向剪断脊柱。轻轻托起后肢，看清坐骨神经位置，沿脊柱两侧横向切口剪断体壁，去除断口以上肢体和内脏放入污物缸。剥去后肢皮肤后放入任氏液中备用。（2）分离两后肢，一只用于剥制标本，一只放入任氏液中保存。（3）分离坐骨神经：将后肢标本脊柱端腹面向上，趾端向外侧用蛙钉将标本固定在蛙板上。先在腹腔面用玻璃分针沿脊柱游离坐骨神经,然后在标本的背侧于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经与周边的结缔组织分离直到腘窝。（4）游离腓肠肌：同样用玻璃分针将腓肠肌与其下的结缔组织分离并在其跟腱处穿线、结扎；（5）分离股骨头：捏住股骨，剪去并刮净周围肌肉，保留股骨的后2/3，剪断股骨; （6）检验标本：用手术镊轻提标本的脊椎片，再用经任氏液蘸湿的锌铜弓接触坐骨神经，如腓肠肌发生收缩，则表示标本机能正常。轻提腓肠肌上的结扎线，将标本放入任氏液中保存15-20分钟后进行实验。（7）电刺激的极性法则验证：用棉线在神经干中间部位进行结扎，以阻断神经传导兴奋的能力。用锌铜弓跨越结扎线刺激坐骨神经干。 五、注意事项 1、避免血液污染标本，压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。 2、在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。 3、标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟,使标本兴奋性稳定再开始实验效果会较好。 六、实验结果 通过任氏液浸泡，刺激后，看到肌肉有收缩的反应，调换电极进行刺激后也同样有收缩 反应。通过铜—锌与锌—铜的两种刺激比较后，铜—锌更强。 八、思考题 1、剥去皮肤的后肢，能用自来水冲洗吗？为什么？ 答：不能。因为自来水中还有例如氯离子、钙离子等许多离子，它们会影响细胞膜的点 位分布，最终就会影响到刺激反应现象的观察；另外自来水里有许多微生物如果它们附着与誓言材料上，也会影响实验效果的。 2、金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌，可能引起哪些不良后果？ 答：金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌会损伤腓肠肌细胞膜，使肌肉中的神经收到过
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞生长曲线的绘制实验报告 篇一：实验五微生物生长量的测定及生长曲线的绘制 一、实验目的 学习了解微生物生长量测定的方法 学习了解细菌生长曲线的绘制方法 学习掌握血细胞计数板的使用方法 微生物生长量的测定 计数法重量法生理指标法 1、显微镜直接计数法 利用血细胞计数板计数 涂片计数 2、活菌菌落计数法 3、滤膜法 细菌生长曲线 将单细胞细菌接种到恒定容积的液体培养基中，不补充营养物或移去培养物，细菌以二分裂方式繁殖，以时间为横坐标，细菌数目的对数值为纵坐标，可画出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，称为生长曲线 篇二：细胞生长曲线的测定 细胞生长曲线的测定 一、实验目的
掌握测定细胞生长曲线的方法。 二、实验器具 24孔细胞培养板、微量加样器、eppendorf管、吸头、吸头盒、显微镜、细胞计数板、载玻片、盖玻片、吸管、试管架、普通显微镜、细胞悬液、0.4%台盼蓝。 三、实验方法 1. 培养细胞：首先在24孔细胞培养板内分别接种相同数量的细胞，计数并记录接种的细胞悬液密度，接种时间记为0小时。 2. 计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24小时计数3孔的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次，如此操作至第七天结束。 3. 绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。 篇三：MTT法绘制生长曲线 实验材料： 1，5%FBS-L-DMEM, 5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01M PBS,2, 96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22μm滤膜，锡箔纸，MTT工作液 实验步骤： 1，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl 细胞悬液进行培养。
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
人外周血淋巴细胞微核测定 一、实验原理: 人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的G0期，在含有PHA的培养基中进行体外培养后，原来处于G0期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物，检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。 二、验用品 （1）器材：离心管、注射器、培养瓶（10ml）、吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水浴箱。 （2）试剂：Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、RPMI1640培养液、PHA溶液、0.075mol／L KCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液 （3）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。 三、实验步骤 1、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分别加入受试物（CP终浓度100ug/ml）培养72小时，收获前不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。 2、低渗：加入0.075mol／L KCl溶液4m1。混匀后放入37℃恒温水浴箱中低渗处理10分钟。低渗时间可根据预实验中细胞完整程度进行调整。 3、预固定：低渗结束后加入甲醇·冰乙酸（3:1）固定液lml，混匀后离心（1000rpm）5分钟。 4、固定：弃上清液，加入5ml固定液，混匀后离心（1000rpm）5分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再固定一次。 5、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。 6、染色：用Giemsa染液染色 10分钟。自来水细水冲洗后，晾干。 7、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。转化淋巴细胞与未转化淋巴细胞比较，前者细胞较大，胞核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核仁多，胞浆丰富，常见空泡
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
动物细胞培养 一、试验目的。 1、掌握无菌操作技术。 2、掌握原代和传代细胞培养。 3、掌握细胞冷冻和复苏技术。 4、了解培养成纤维细胞的形态。 二、试验原理。 将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。 三、实验器材及药品。 器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精 培养箱、超净工作台、离心管、灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO 2 高压灭菌锅、试管架等。 药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。 四、实验操作。 1、消毒灭菌。 将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。
2、培养基的配制。 分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。 3、原代培养。 （1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。 （2）、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200μl的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。 （3）、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。 （4）、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打 箱培养，瓶口少少混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于℃恒温CO 2 拧的松一点。 4、传代培养。 （1）、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。 （2）、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞。 （3）、传代细胞的培养。向离心管内加入大约7—8ml的培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中，置于37度恒温CO 培养箱中培养。培养1—2天后于显 2 微镜下观察细胞的形态。 5、细胞冷冻保存。 （1）、收集细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。 笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。 M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。参考文献 [1] 丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9. (收稿日期:2010-12-16) v 通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin https://www.doczj.com/doc/1a16418273.html, 。 #经验交流# 外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会 马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元 v (川北医学院附属医院检验科,四川南充637000) 摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。 关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。1 淋巴细胞培养 1.1 外周血采集 一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。 1.2 接种 培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。 1.3 细胞培养 细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。1.3.1 培养时间 经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于 分析。 1.3.2 培养温度与气体 淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。2 细胞收获 2.1 秋水仙素与作用时间 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。 2.2 离心力 将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。整个过程中,离心力的大小很关键。离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。这一步本室选择1900r /min 离心10min 。而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。 2.3 低渗 低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。低渗液渗透压过
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
坐骨神经一一腓肠肌标本和腓肠肌标本制备 二、实验原理 三、1、蛙或蟾蜍等两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体 组织生活条件易于掌握，在任氏液的浸润下，神经肌肉标本可较长时间保持生理活性。因此, 在生理学实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经腓肠肌离体标本来观察神经肌肉的兴奋性、兴奋过程以及骨骼肌收缩特点等。 2、细胞的静息膜电位为外正内负，电刺激可改变可兴奋细胞的膜电位差。膜电位减小时，细胞去极化，细胞兴奋；膜电位增大时，细胞超极化，细胞兴奋性被抑制。蘸有任氏液的锌铜弓接触活组织时，可产生沿锌片一活组织一铜片流向的电流对细胞产生刺激效应。 四、实验步骤 1、洗净实验动物→毁髓→剥制后肢→分离坐骨神经→游离腓肠肌→游离股骨头→标本检验→电刺激极性法则的验证 2、双毁髓 一只手握住牛蛙，使其背部向上。用拇指压住牛蛙背部，食指按压其头部前端，另一只手持毁髓针，由两眼之间沿中线向下触划，触及凹陷处即为枕骨大孔。将毁髓针垂直刺入枕骨大孔。将针尖向前刺入颅腔内搅动，此时为单毁髓；将毁髓针退回枕骨大孔，针尖转向后方，与脊椎平行刺入椎管内捣毁脊髓，完成双毁髓。 3、坐骨神经-腓肠肌标本制备（1）剥制后肢标本：轻提双毁髓蛙，自背面耻骨联合上方约1公分处横向剪断脊柱。轻轻托起后肢，看清坐骨神经位置，沿脊柱两侧横向切口剪断体壁，去除断口以上肢体和内脏放入污物缸。剥去后肢皮肤后放入任氏液中备用。（2）分离两后肢，一只用于剥制标本，一只放入任氏液中保存。（3）分离坐骨神经：将后肢标本脊柱端 腹面向上，趾端向外侧用蛙钉将标本固定在蛙板上。先在腹腔面用玻璃分针沿脊柱游离坐骨 神经,然后在标本的背侧于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经与周边的结缔组织分离直到腘窝。（4）游离腓肠肌：同样用玻璃分针将腓肠肌与其下的结缔组织分离并在其跟腱处穿线、结扎；（5）分离股骨头：捏住股骨，剪去并刮净周围肌肉，保留股骨的后2/3,剪断股骨；（6）检验标本：用手术镊轻提标本的脊椎片，再用经任氏液蘸湿的锌铜弓接触坐骨神经，如腓肠肌发生收缩，则表示标本机能正常。轻提腓肠肌上的结扎线，将标本放入任氏液中保存15-20分钟后进行实验。（7）电刺激的极性法则验证：用棉线在神经干中间部位进行结扎，以阻断神经传导兴奋的能力。用锌铜弓跨越结扎线刺激坐骨神经干。 五、注意事项 1、避免血液污染标本，压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。 2、在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。 3、标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟，使标本兴奋性稳定再开始实验效果会较好。 六、实验结果 通过任氏液浸泡，刺激后，看到肌肉有收缩的反应，调换电极进行刺激后也同样有收缩反应。通过铜一锌与锌一铜的两种刺激比较后，铜一锌更强。 八、思考题 1、剥去皮肤的后肢，能用自来水冲洗吗？为什么？ 答：不能。因为自来水中还有例如氯离子、钙离子等许多离子，它们会影响细胞膜的点位分布，最终就会影响到刺激反应现象的观察；另外自来水里有许多微生物如果它们附着与 誓言材料上，也会影响实验效果的。 2、金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌，可能引起哪些不良后果？ 答：金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌会损伤腓肠肌细胞膜，使肌肉中的神经收到过度刺激，而过度兴奋最终失活，刺激时候就没有现象。
微核细胞率micronucleus frequency，在CB法微核试验中指1000个双核细胞中含有微核的细胞数。 外周血淋巴细胞微核率测定 外周血淋巴细胞微核率测定作为对职业性放射性工作者所受辐射损伤的评价是一项非常有意义的指标，亦列为我国慢性放射病诊断的重要检测指标之一。健康成人外周血淋巴细胞微核细胞率正常值范围为0-6‰,均值为1.2‰, 微核 微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。而植物系统则更直接、更简便。如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。微核是细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞浆中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核，位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核1/3，主要由外界损害因素(生物、物理、化学)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。