离子交换层析介质的应用
离子交换层析介质的应用
离子交换层析分离纯化生物大分子的过程～主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、辯面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。
1. 离子交换剂的选择
在进行分离纯化时～要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点～其中分离介质是最主要的影响因素～因此～分离介质的选择尤为重要。
1.1 品种的选择:
应根据被分离纯化目辬产物所带电荷的种类、分子的大小、物理化学性质及所处的微环境等因素～选择适宜的离子交换层析介质。对于无机小分子而言～分离介质的选择相对容易～但对于生物大分子就必须考虑更多的因素。
蛋白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的～在不同的pH条件下显示不同的电性～而生物大分子对最适宜的pH环境具有特定的要求～因此～必须首先了解目辬蛋白的等电点及适宜的微环境～根据这些条件选择合适的离子交换剂种类。
是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂～主要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷～如果带正电～则选择阳离子交换剂,如带负电～则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4～稳定的pH 范围为6~9～由于这时蛋白带负电～故应选择阴离子交换剂进行分离。
1.2 骨架的选择:
应根据目辬产品的产量、要求达到的纯度及经济价值等因素～选择合适骨架,基质,的离子交换剂。
通用型的聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点～适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有效成分等一般生化制品的提取分离工艺。而对于要求分辨率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品～仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化分离专用介质。
纤维素离子交换剂价格较低～但分辨率和稳定性都较低～适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中～但受外界影响较大～体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变～影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好～分辨率也较高～但价格较贵。
理想的分离介质应该不但易于吸附～还要易于洗脱～如果目辬产物对于离子强度和pH值的变化不敏感～可以考虑采用高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。如果对这些因素比较敏感～则应采用弱酸性或弱碱性的弱型介质。如果大分子物质被吸附后～结合比较牢固～往往难以洗脱～采用苛刻的条件又容易引起大分子的变性～则应选用功能基团密度低的介质。
强酸性或强碱性的强型介质～适用的pH 范围广～常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离～但由于电性较强～有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质～其选择性有较大的范围～且不易使蛋白质失活～故一般适用于分离蛋白质等大分子物质～但其适用的pH范围较窄。
1.3 粒径的选择:
分离介质粒径的大小对离子交换层析柱的分辨率和流速有明显的影响。一般来说分离介质的粒径小～分辨率高～但平衡离子的平衡时间长～流速慢,粒径大则柱的流速较快～压降小～但分辨率低～负载量也较小。所以大颗粒的分离介质适合于对分辨率要求不高的大规摻制备性分离～而小颗粒的分离介质适合于需要高分辨率的精细分离或产品的精制阶段。
2. 操作中注意事项
2.1 预处理:
在离子交换剂的工业产品中～常含有少量的有机低聚物及一些无机杂质～在使用初期会逐渐溶解释放～影响目辬产品的质量。因此～工业级离子交换剂在使用前必须进行预处理。
通用型的离子交换树脂通常使用酸、碱进行处理～可采用1~2 mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液～以4~6倍树脂床体积交替进行处理～在酸及碱处理之间须用去离子水洗至中性。对于大孔型的树脂～还需要用乙醇、丙酮等有机溶剂进行处理～以除去生产过程中所用的有机物残余物。对分离介质进行预处理～不但能提高其工作容量～更可提高被分离产品的纯度。经预处理后的树脂～最后应转为分离过程中适用的离子型态。
对于生化专用的离子交换剂～以多糖类骨架为主的介质～一般贮存在20%的乙醇中。为了分离介质在分离过程中尽量减少pH值的变化～需要用大量的去离子水进行清洗～然后用缓冲液进行平衡。
分离介质的预处理可以在柱内进行～也可以在烧杯等容器中进行。在柱内进行预处理时～或溶液体系改变及操作温度变化时～经常会出现气泡～尤其在使用内径较小的柱时。气泡一经出现～必须及时清除～否则对层析工艺有明显的影响。
2.2 缓冲液平衡介质:
pH值是离子交换层析的操作中的一个重要因素～而pH的稳定及改变通常是用缓冲液来实现的～所以缓冲液的选择是影响分离效果的重要因素。
在选择缓冲液时～pH和离子强度是两个关键性的因素～它不仅影响到分离介质对目辬产物与杂质的分离效果～而且还影响到产品的收率。选用的pH值取决于目辬产物的等电点、稳定性和溶解度～不但要使被分离的物质成为可以进行交换的离子～还要维持其较高的活性。同时也应该考虑到离子交换剂的pK值。
由于缓冲液本身带电～所以也会与离子交换层析介质结合。这种结合将带来两方面的干扰～一方面降低缓冲液的浓度～进而降低了缓冲能力,另一方面是与分离介质进行交换～从而与蛋白质竞争介质的交换容量。因此～在使用阴离子交换层析介质时～要避免采用磷酸盐之类的带负电的缓冲液～在使用阳离子交换层析介质时～则要避免采用Tris之类的带正电的缓冲液。由于分离介质的种类不同～起始过程也略有不同～在通常情况下～使用阴离子交换层析介质时～起始缓冲液要高于目辬蛋白等电点0.5 ~ 1 pH值,使用阳离子交换层析介质时～则起始缓冲液要低于目辬蛋白等电点0.5 ~ 1 pH值。
2.3 层析柱的操作:
2.3.1 操作方式:
由于生化分离的样品、缓冲液和洗脱液都是流动相～可在流经柱时进行分离～因此～离子交换可以采用柱式操作～以层析形式进行分离。在分离过程中～未被吸附的物质不断流出反应体系～使平衡不断右移～是一种动态平衡～所以也称为动态操作。动态操作方式分离效果好～适用于各类样品～可实现连续操作。在层析分离的操作中～层析柱的装填情况对分离有一定的影响～介质在柱内要分布均匀～尤其不允许气泡的存在～也应防止介质产生分层现象。
对于一些粘度较大的样品～进行初步提取分离时～也可以采用“静态”处理方法～经离子交换剂与需处理的工作液在反应容器中进行搅拌～当达到吸附平衡后～将介质与残液分离～装入柱中进行洗脱。这种静态分批操作的方法～工艺设备简单～操作简便～如肝素钠等一些天然产物的初步分离～往往采用这种静态分离方式。在静态分离方式的操作中～应适当控制离子交换剂在工作液中的搅拌速度～若搅拌速度过快～剪切力过大～会造成离子交换颗粒的破碎～难以进行过滤分离,但若搅拌速度过慢～则影响介质与工作液的接触～也影响交换速率。
2.3.2 柱式操作的种类:
固定床分离:在柱式操作中～料液作为流动相～在柱内自上而下地流动～在流动的过程中进行吸附。为了得到较好的分离效果～对分离柱有三点最基本的要求:分离柱底部要有孔径分布均匀的筛板～以防止流动相产生偏流,分离柱支持层下端的死角体积要尽量地小～以防止分离过程中色谱带混合或扩展,无论大小～分离柱都必须保持垂直。在固定床操作中～可以进行正向洗脱～也可以进行逆向洗脱～一般情况下～逆向洗脱或再生可获得较好的效果～但对操作有较为严格的要求。
流态床:流动的料液从柱的下端流入～从上端流出～分离介质在柱内呈流态状。此种分离方法对操作有严格的要求～一般较少应用～洗脱方式以采用正向洗脱为好。
2.3.3 工作液对分离效果的影响:
为了使生化分离达到高分辨率及高负载量～工作液的制备及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影响离子交换剂的分离效果～还影响到分离介质的使用寿命。生化分离往往是一个比较复杂的体系～其中有多种杂质存在～不但有简单的小分子～还有一些胶体物质、脂类物质等～尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆盖了介质的功能基团～或堵塞了介质的孔道～造成不可逆污染～缩短分离介质的使用寿命。因此～在分离操作前～应尽量将工作液进行适当的预处理～以确保分离的效果。
在生化分离纯化过程中～由于淋洗过程带走了一些目辬产物～或因洗脱不完全而使目辬产物滞留在介质上～造成产物的损失～是影响产品收率的重要因素～同时～蛋白质的结构变化引起失活～也将影响活化收率。在离子交换过程中加入一些稳定剂或保护剂～不但可以提高收率～还可提高分离介质对蛋白质的选择性。
2.3.4 流速对分离效果的影响:
离子交换层析分离中～流速是影响分离效果的一个重要因素。为了获取优良的分离效果～应根据离子交换剂的种类、粒径、工作液中有效成分的分子结构等因素～进行试验～以确立较佳的试验参数。若目辬产物的分子量相对比较小～且介质的孔径比较大时～因为有利于传质作用～可采用较高的流速。而对于目辬产物为生物大分子～且介质的孔径相对于被分离物质分子较小时～由于分子的扩散速率较慢～则宜采用较慢的流速。在工作液的粘度较大时～因传质速率较低～也应采用较低的流速。
流速不但影响交换吸附的效果～也影响洗脱的效果～通常情况下～洗脱时的流速要比交换吸附时慢些。
2.4 介质的洗脱、再生方式:
当离子交换剂失效后～应进行洗脱～其基本原理是用一种比吸着物质更活泼的离子或基团～把交换吸附到介质颗粒外辯面和内部的目辬产物解吸下来。吸着物不同～其活泼性不同～因此～应选择合适的洗脱剂～将蛋白质从介质上洗脱下来～收集分离纯化的产物。
离子交换层析大致有三种洗脱方式:
一种为同步洗脱。洗脱剂是同一种物质～可采用稀的酸、碱或盐类溶液～也可选用适当的有机溶剂～其中以盐溶液为主～依据目辬产物的性质及最终得到产物的剂型进行选择。由于被吸着的物质往往不是单一的品种～各种物质所带的电荷电量不同～与介质的结合强度不同～即使使用同一种洗脱剂～容易被替换的物质先脱离介质流出～结合力较强的物质后流出～只要通过分级收集～就可以把各种物质分离～得到较纯净的产物。这种方法多用于对目辬产物的性能了解很清楚时的分离～或用于分析类的分离。
第二种为分步洗脱～即分農用不同浓度的盐溶液进行洗脱。分离介质在交换吸附过程中～会有多种蛋白质被吸附～如果采用一个恒定的洗脱条件～有时不能将所
有的组分适当地分开～需要改变洗脱条件。可以是阶段式的改变～即选用不同的洗脱剂或不同pH值的洗脱剂分阶段进行洗脱～可以根据洗脱液不同的浓度、不同的酸度得到不同的洗脱峰。即一种盐浓度可以得到一种目辬蛋白～不同的盐浓度可以得到不同的目辬蛋白。这种分步洗脱的方式～适用于已知性质蛋白的分离～尤其适用于规摻生产中～操作方便～易于控制。
第三种为连续的梯度洗脱～即按一定的线性变化改变洗脱液的离子强度或pH 值,一般只在特殊情况下使用改变pH值的洗脱方式,～在洗脱剂渐变的过程中～将不同的蛋白质逐一臵换～可得到各种不同的蛋白组分～同时～蛋白质一般不拖尾。梯度洗脱是离子交换层析中最常用的洗脱方式～也是洗脱能力相对最强的洗脱方式～适合于对电荷性质相近组分的洗脱。
在洗脱过程中～顺流洗脱或逆流洗脱均可采用～顺流洗脱也称为正向洗脱～即洗脱液的流动方向与工作液的流动方向相同～逆流洗脱也称为反向洗脱～即洗脱液的流动方向与工作液的流动方向相反。若料液是自上而下正向通过交换柱进行交换吸附的～则交换柱上层吸附物的浓度要比下层高～洗脱液自下而上反向解吸可以更高效地达到洗脱的目的。但由于逆向洗脱的操作要比正向洗脱复杂得多～故目前多以正向洗脱为主。
洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离的效果～洗脱速度通常要保持恒定。一般来说～慢速洗脱的分辨率要比快速洗脱好～但洗脱速度过慢～会造成分离时间长～样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用～所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中于某个区域造成重叠～则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率。如果分辨率较好～但洗脱峰过宽～则应适当提高洗脱速度。
2.5 介质的消毒:
在某些纯度要求较高的生化产品制备过程中～往往要求对分离介质进行消毒处理～以防止微生物等杂质混入目辬产品中。
采用高温消毒是最常用的方法～目前大多数离子交换剂具有稳定的物理化学性能～均可进行高温消毒处理。但在使用多糖类介质时～必须注意～介质一定要处于盐型～而且要在中性条件下才能进行高温消毒处理～否则将会导致多糖大分子骨架的降解～严重影响介质的使用寿命。
NaOH也是一种很好的消毒剂～但要根据介质的耐碱程度和微生物污染的种类、污染程度选用合适浓度的NaOH。这种消毒方法也可以采用柱内浸泡法～即将一定浓度的NaOH通入柱中～关闭出液阀～浸泡几个小时后～可达到消毒的目的。NaOH 如果与乙醇合用～可以得到更佳的效果。用NaOH消毒还可将消毒和在位清洗合并处理。
2.6 介质的“复苏”:
在生化分离过程中～由于分离体系较为复杂～含有多种蛋白质或其他杂质～因此在使用过程中常出现树脂的“中毒”现象。中毒原因可能是由于大分子的多点带电～与介质进行多点结合～致使难以洗脱～使介质的有效功能基团减少。也可能是一些较大的分子被“卡牢”在孔道内～难以扩散出来～堵塞了孔道～在以后的交换过程中影响到颗粒内功能基团的有效工作。除生物大分子外～色素及腐殖酸等都可使介质中毒。有时工作液中的胶状物质被粘附于介质颗粒的内外辯面～覆盖了功能基团～这也是影响介质工作容量的重要因素。
由于上述原因～离子交换层析介质在使用一段时间后～可能出现颜色变深、床体收缩、分辨率下降、蛋白质收率降低、反压升高等现象。此时～需要对介质进行净化处理。对于介质用量比较大～自动化程度比较高的规摻生产～应采用在原交换柱内进行～即“在位清洗”。先从交换柱的下面通过适量的清水～目的是去除交换柱中的悬浮物～并将床体疏松～还可以将结块的介质分散～有利于以后介质与清洗
液的接触。对于一般的污染～采用逆流清洗～可减少污染物对下层介质的污染。应根据介质种类及污染程度的不同～分農选用不同种类的清洗剂及不同的清洗步骤。一般的介质是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分阶段清洗或浸泡～各试剂交替之间须用去离子水洗至中性。若经过上述处理后仍无明显改善～尤其是流速无明显提高～则要检查交换柱布水器的纱网是否出现堵塞。
上述过程即为通常所说的“复苏”过程。不同的介质应选用不同的复苏方法～主要取决于介质的物理化学性能及污染物质的性质。对于多糖类的离子交换剂～每当使用一段时间后～可采用离子浓度较大的缓冲液通过交换柱或浸泡介质～因为缓冲液的离子强度较大时～有利于蛋白质大分子脱离介质～达到复苏的效果。对于物化结构稳定的介质～也可使用NaCl溶液通过交换柱或浸泡介质。对于物化结构非常稳定的介质～可用30?~40?的乙醇或丙酮进行洗脱或浸泡～在高温下可使吸附在介质上的蛋白变性或加快扩散速度～也有利于胶体物质的破坏～从而使污染物脱离介质。还可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl～更有利于介质的复苏。
清除沉淀蛋白、脂类、疏水性的蛋白及脂蛋白～处理步骤更为复杂。可采用100%的异丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的盐酸胍、阳离子或非离子洗涤剂等作为处理液。在用过这些清洗剂后～都要用至少2倍体积的蒸馏水进行清洗。使用有机溶剂后～交换柱要采用锯齿形的梯度洗涤进行清洗～即可以在5倍床体积内～使溶剂的含量从0增至100%～然后在下一个5倍床体积中～使溶剂的含量从100%降到0。
如果经过上述处理～交换柱的工作情况仍没有恢复～可以使用蛋白水解酶～将仍滞留在介质内的蛋白质进行水解～使其脱离介质。可以采用含有1mg/mL
胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交换柱中～在室温下浸泡过夜～或在37?下浸泡一小时。根据污染物的情况～也可以采用DNA酶等
其它的酶类。无论使用哪一种酶处理后～都要重复上述清除污染物的清洗步骤～把酶清洗干净。
脂蛋白对分离介质的污染比较严重～因为脂蛋白及其它脂类物质～很容易粘附在层析柱内～最好在进行分离工艺前先将其去除。推荐使用硫酸葡聚糖、聚乙烯呗咯烷酮等沉淀剂～可去除高含量的脂蛋白。
2.6 介质的贮存:
各种分离介质在使用后都要进行清洗后再贮存～这对于多糖类分离介质尤为重要。分离介质在使用后～先用2个床体积的清水清洗～然后用2个床体积的20%的乙醇过柱。对于SP强酸性阳离子介质～要用含有0.2mol/L乙酸钠的20%乙醇溶液清洗～再用脱气的乙醇-水溶液以较慢的流速清洗。经过处理后～可在室温下贮存～或在4~8?下长期存放。贮存过程中必须将层析柱全部封闭～以防止水分的挥发～造成干柱。暂时不用的介质必须贮存在20%的乙醇溶液中。所有的离子交换分离介质～都要在4?~30?的条件下贮存～并防止冷冻。
离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可
单克隆抗体分离纯化中的离子交换层析介质 离子交换层析介质在生物技术制药中应用广泛。可以设计层析工艺中的各个步骤中使用，如：捕获，中度纯化、精细纯化等步骤。在抗体纯化工艺中广泛使用的三步法：protein A捕获-阳离子交换-阴离子交换。 2.1.阳离子交换CEX层析介质 在抗体纯化工艺中，CEX一般使用吸附模式（Bind-and-Elute BE）。阳离子交换可以去除HCP、脱落的Protein A以及部分高分子量的聚体等杂质。Protein A 的PI在5.1；而单克隆抗体的PI一般在4-9，大部分在PI超过6.0。更改上样的pH 可以使脱落的Protein A的或Protein A的降解片段在流穿中去除，也可在上样后 的中间清洗步骤中去除。文献报道阳离子交换的载量（Protein A捕获洗脱样品） 在几十mg/ml 以上。并且收率较高均>98%. Sp Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重要的。这些介质的常规线流速是100至400cm/h。 2.2.阴离子交换AEX层析介质 阴离子交换在抗体纯化工艺中可以去除DNA、病毒、Protein A脱落、内毒素、部分聚体以及酸性的HCP。 在抗体工艺中AEX层析一般采用流穿模式（Flow-through FT），既上样过 程中抗体在穿透峰，杂质吸附在层析介质上。对于PI比较高的抗体分子，pH在7-8.0左右时，抗体流穿。而DNA、内毒素以及病毒等可以吸附在层析介质上。文献报道，阴离子交换的载量在140mg/ml 以上。根据抗体的性质，选择适当的pH，在低电导下，抗体流穿。典型的结果：收率99%，DNA<10pg，protein A<10ppm. Q Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重要的。这些介质的常规线流速是100至 400cm/h。
离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。
四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。
离子交换层析介质的应用 离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程～主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、辯面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 1. 离子交换剂的选择 在进行分离纯化时～要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点～其中分离介质是最主要的影响因素～因此～分离介质的选择尤为重要。 1.1 品种的选择: 应根据被分离纯化目辬产物所带电荷的种类、分子的大小、物理化学性质及所处的微环境等因素～选择适宜的离子交换层析介质。对于无机小分子而言～分离介质的选择相对容易～但对于生物大分子就必须考虑更多的因素。 蛋白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的～在不同的pH条件下显示不同的电性～而生物大分子对最适宜的pH环境具有特定的要求～因此～必须首先了解目辬蛋白的等电点及适宜的微环境～根据这些条件选择合适的离子交换剂种类。 是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂～主要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷～如果带正电～则选择阳离子交换剂,如带负电～则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4～稳定的pH 范围为6~9～由于这时蛋白带负电～故应选择阴离子交换剂进行分离。 1.2 骨架的选择: 应根据目辬产品的产量、要求达到的纯度及经济价值等因素～选择合适骨架,基质,的离子交换剂。
通用型的聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点～适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有效成分等一般生化制品的提取分离工艺。而对于要求分辨率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品～仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化分离专用介质。 纤维素离子交换剂价格较低～但分辨率和稳定性都较低～适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中～但受外界影响较大～体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变～影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好～分辨率也较高～但价格较贵。 理想的分离介质应该不但易于吸附～还要易于洗脱～如果目辬产物对于离子强度和pH值的变化不敏感～可以考虑采用高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。如果对这些因素比较敏感～则应采用弱酸性或弱碱性的弱型介质。如果大分子物质被吸附后～结合比较牢固～往往难以洗脱～采用苛刻的条件又容易引起大分子的变性～则应选用功能基团密度低的介质。 强酸性或强碱性的强型介质～适用的pH 范围广～常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离～但由于电性较强～有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质～其选择性有较大的范围～且不易使蛋白质失活～故一般适用于分离蛋白质等大分子物质～但其适用的pH范围较窄。 1.3 粒径的选择: 分离介质粒径的大小对离子交换层析柱的分辨率和流速有明显的影响。一般来说分离介质的粒径小～分辨率高～但平衡离子的平衡时间长～流速慢,粒径大则柱的流速较快～压降小～但分辨率低～负载量也较小。所以大颗粒的分离介质适合于对分辨率要求不高的大规摻制备性分离～而小颗粒的分离介质适合于需要高分辨率的精细分离或产品的精制阶段。 2. 操作中注意事项
蛋白纯化离子交换层析 研究生的生活，单调的科研，重复的脚印，匆匆的轨迹，踩着早上的时光一如往常的走进实验室，摊开实验记录本，写上日期，就像每天写日记一样开始计划今天的实验日记，用笔似乎要绘制一副有关实验的画面。 如果你处在这样的科研氛围里，慢慢的就会体味到科学本身就像窗外的大自然一样的美，绿色撩人，诗意陶醉…… 今天，我们写下的实验日记——蛋白纯化离子交换层析法，文章详细的总结了离子交换层析的定义、离子交换层析的原理、离子交换剂的种类，似乎要提醒一下脑子要保持清醒了，不然，看完之后，你能分清楚阴阳离子交换剂的概念，熟知它们的区别么？ ————你会创造规律科研生活的美 我，生在春天里，刚发芽的地方是实验室 知了也睡了，而我刷夜实验室 因为我在等待秋天收获的季节 虽然有可能错过成功的喜悦，却收获心灵上的成长
离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静
离子交换层析技术 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。 表1-1 离子交换剂的类型与特点
实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面
离子交换层析 1、定义 2、发展 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。 3、基本信息 离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 4、具体操作 预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
离子交换层析实验原理及步骤 离子交换层析实验方法 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。 1. 剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 2. 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。 表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系 血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37
400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。 3. 平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。 4. 装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10∶1～20∶1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。 5. 上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的—球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
实验报告 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法 二、实验内容和原理 1、离子交换层析 由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色） 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂 ⑴ ⑵ 20 7.3 缓冲液 ⑶ 20 （1 ）7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器 （1）高速冷冻离心机 （2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）
（3）? （1套/组） （4）部分收集器及收集试管（4管）（1台/组） （5）－20℃冰箱（保存样品用） （6）微量移液枪 200、1000 （7）1.5离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） （8）7离心管（留样品Ⅳ用） （9）恒温水浴（50℃、100℃） （10）试管、移液管、试管架等 四、实验方法和步骤 1、仪器连接 （1）接通各仪器电源，将泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含溶液。 （2）点击电脑桌面上软件图标，打开软件。选择，点击，进入操作界面。点击 （3）在操作界面的工具栏，点击。出现窗口，调节为 1，确定。 2、装柱与平衡 （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（)相连，下端接头与样品阀（ )相连。 （3）平衡一个柱体积（约2020） 3、加样 停止加入20 7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱（梯度洗脱法） （1）加样后，先用进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20左右）； （2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏→ → → ，在两个框内均填入100，点击，最后点击一次，开始梯度洗脱。每2接一管，当上升至8 时，开始测定各管的蔗糖酶活力； （3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品Ⅳ），样品用7离心管－20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测
离子交换层析说明书 CM Bestarose Fast Flow DEAE Bestarose Fast Flow Q Bestarose Fast Flow SP Bestarose Fast Flow CM, DEAE, Q and SP Bestarose 快速离子交换剂属于分离介质的一部分,主要为色谱工作服务，所有的介质都经过严格的控制生产从而保证其能够满足工业生产的需求。 为了正确操作以便得到最好的分离效果，请在使用前阅读该手册。 目录 1. Bestarose 快速离子交换剂的特性 3 2. 装柱指南12 3. 装柱评价14 4. 保养17 5. 疑难解答17-19 1.Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性 Bestarose Fast Flow离子交换剂是以高度交联的琼脂糖为基质，它的化学、物理性质稳定，即离子载量、洗脱情况、反压及流量等特性不受层析和清洗过程中溶液的影响，详见下表。高物理稳定性使它能在低背压下提供快速液流，在柱高15cm，1 bar压力下，它的流速可达300-700cm/h，见图1。另外，刚性介质体积基本不因pH和离子强度
的变化而变化。 线性 流速 图1. Bestarose 快速离子交换剂典型的压力/流速曲线。 CM Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性 CM Bestarose Fast Flow是一种弱阳离子交换剂，离子交换基团是羧甲基，如下：-O-CH2COO- 表一. CM Bestarose Fast Flow 特性。 项目指标 离子交换剂类型弱阳离子 总离子载量0.09-0.13mmol/ml 排阻限4×106（球形蛋白） 骨架6%交联琼脂糖 颗粒类型球形，45-165μm 流速300–600 cm/h* 工作温度4–40°C 工作pH 见图2 pH稳定性2-14(短期，CIP) 4-13（长期） 化学稳定性适合所有的缓冲体系 1M NaOH 8M Urea 6M GuHCl 70%乙醇 避免事项氧化剂 长期暴露（1星期，20°C） pH<4 *15cm柱高，1 bar压强，25℃，XK 50/30 柱。 图2的滴定曲线表明CM Bestarose Fast Flow的pH工作范围，例如CM基团的pH工作范围。 图2. CM Bestarose Fast Flow的滴定曲线
离子交换层析法（ion exchange chromatography，简称IEC） 是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。蛋白质由氨基酸组成，不同的氨基酸是具有不同的等电点的，因此每个蛋白质都具有等电点，不同的蛋白质，其等电点也不相同。这个决定了在同一pH下，蛋白质所带的电性和电荷量是有差异的，比如在pH在7.0的情况下，有些蛋白质带正电，有些蛋白质带负电，有些蛋白质不带电；在带正电的蛋白质中，不同的蛋白质所带的电荷量也是不同的，带负电的蛋白质也是如此。即使假设存在两种蛋白质所带的在同一pH下所带的电性和电荷量都相同，不同的蛋白质的分子量以及其折叠而成的空间结构决定了这两种蛋白质的表面电荷密度也是不同的。以上论述的结论就是每一种蛋白质在同等条件下都有唯一的特征常数。蛋白质的离子交换柱层析正是利用了这个蛋白质的特征设计的。蛋白质离子交换层析在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。蛋白质的特征常数决定了在相同pH下蛋白质与离子交换剂的亲和力是唯一的。也就是说，在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷密度存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离的目的。离子交换层析具有浓缩效应，可以实现低浓度蛋白质的提取，这是非常具有实际意义的。
离子交换柱交换层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。 树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。 本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。 二、实验器材 实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、 0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用 0.02mol/L的HCl配制） 三、实验操作记录 1、树脂的处理
干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。 2、装柱前的准备 选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。 将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。 3、装柱 向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。 待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续，均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。 4、平衡 层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。5、加样
蛋白质的离子交换层析 发布日期：2009-10-15 来源：生技网信息中心浏览次数：175 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl 一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。
离子交换层析法 一、原理 离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 二、方法与步骤： 1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂...... 2.实验步骤 （1）装柱： 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积; （2）柱的平衡与上样： 用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;
（3）洗杂蛋白： 用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; 分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； （4）解离目的蛋白（洗脱）： 分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; （5）柱的清洗与保存： 用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。 三、适用范围与应用 离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生
GE离子交换层析柱 protocol 5ml（举例 子） Preparation 1. Buffer: （pH 根据蛋白的 pI 进行调整，pH 尽量远离 pI。pH>pI,过 Q 柱；pH>pI,过 S 柱）A: 50mM Tris-HCl B: 50mM Tris-HCl 1M NaCl 过滤除杂质，4℃静置过夜除气泡。 2. Protein: 用滤器过滤除质；或者分装于 EP 管，14000rpm，4℃离心 20min，去除沉淀。 3 .Prepare enough tubes 有流速时，禁止将泵的探头暴露到空气中!!! 柱子在仪器上时，无论何时均要限压!!!
Procedure 1 打开仪器总开关，电脑。 检查：泵的探头是否放入纯水中。 洗泵：Manual--pump--pump basic wash--A on ,B on--insert--execute 洗系统：Manual--pump--flow--10ml/min--insert--execute Manual--other--End time--volume--40 ml 2 安装柱子 给流速：Manual--pump--flow--3ml/min--insert--execute(仪器显示系统压力为*Mpa)限压力：Manual--Alarms--Alarms pressure--+*)Mpa--insert--execute 是 Hitrap Q 柱子的最大限压) 装柱子：先装上面，再下面，装完后用纸巾擦干，观察是否漏液。 3 清洗柱子 限压力：Manual--Alarms--Alarms pressure--+*)Mpa--insert--execute 给流速：Manual--pump--flow--1ml/min--insert--execute（低流速下装柱子）Manual--other--End time--volume--10 ml
离子交换层析（色谱） 一、原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示： I — 流动相的离子强度，A 和B 为常数， 为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。 离子交换基： 阴离子：DEAE （二乙胺乙基）； QAE （季胺乙基） 阳离子：CM （羧甲基）；SP （磺丙基） 对于蛋白质等两性电解质，在物理意义上，B 为溶质的静电荷数与离子价数之比。在pH 偏离等电点的溶液中，蛋白质溶质的静电数常为两位数以上，故B 值较大，即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感。在同一离子强度下，不同蛋白质的分配系数相差非常大（几个数量级）。 洗脱方式： 恒定洗脱法：洗脱液（流动相）的离子强度不变； 缺点：对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法： 除GFC 以外的层析操作均采用此种方法。 在洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大或阶段梯度增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于脱附的溶质得到洗脱。 线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下： （1）线性梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。 （2）阶段梯度洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱，不需要特殊梯度设备，操作简单； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数（如盐浓度体积）的设计较困难。 离子交换(IEC)的应用及特点 GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段 IEC 分离的特点： （1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲合吸附剂。 疏水作用层析（色谱） 一、原理 疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 二、疏水性吸附剂：将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基：苯基、短链烷基（C 3~C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点： 疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修∞+=m I A I m B )(∞m