Gateway?技术提供以下可能：
?通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间
?将您的基因转入到多个表达系统
?在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达
Gateway?技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的
克隆效率高达95％或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，
还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway?也有助于进行带不同数目纯化和
检测标签的表达。
Gateway?利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway?改造过的的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway?技术的灵活性
*目的基因克隆进入门载体后，
可以同时转移目的基因到多个目的载体。
一种强大而可靠的技术
Gateway?技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway?技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway?技术（表1和图2）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Gateway?技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。需要了解更多的有关ccdB的信息，请
参考术语表。
表1-反应和术语总结
完成构建Gateway?表达克隆仅需两步（图2）：
1.创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。
2.混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway? LR Clonase?酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主
中进行蛋白的表达和分析。）
图2-Gateway?技术总结
在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
可以通过以下几种方法构建Gateway?入门载体。无论您选择何种方法，创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。图
3-Gateway?定向TOPO?克隆
PCR克隆（定向TOPO?克隆至入门载体或与供载体BxP重组）
?限制性内切酶消化和连接进入入门载体
?使用pCMV·SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway?兼容cDNA文库
?Gateway?改造过的克隆资源*
( * 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Clonase?酶反应转换到入门载体。请登录https://www.doczj.com/doc/3a7156287.html,/获得已有克隆资源的更多信息。)
PCR-定向(PCR-Directional)TOPO?克隆
定向TOPO?克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生＞90％的重组子。您不仅会
比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。
定向TOPO?克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率＞90％，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶。
目前有两种定向TOPO?克隆载体:pENTR/D-TOPO? 和pENTR/SD/D-TOPO?（表2和图3），它们具有有以下特点：
?位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway?目的载体进行有效重组
?通用M13位点便于测序
?基于pUC的ori位点提供高产量质粒
?大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选
表2-两种pENTR/D-TOPO?载体的简单比较
构建入门载体的各种选择
A 限制性内切酶消化
作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway?入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway?入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR?11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。
B PCR重组克隆
重组是从PCR产物创建Gateway?入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育扩增
PCR产物和pDONRTM载体(包含attP位点)及Gateway? BP ClonaseTM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway?目的载体进行重组（参看图2）。
C Gateway?改造过的cDNA文库
如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONRTM载体和BP ClonaseTM酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway?入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。SuperScript cDNA 文库使用pCMV·SPORT（登录https://www.doczj.com/doc/3a7156287.html,获得更多信息）构建，有几种的人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。如要了解Gateway兼容文库的详细列表，请登录https://www.doczj.com/doc/3a7156287.html,/fulllength.
D 入门克隆的切入点――克隆资源
您可以从与10000个与人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70％以上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术，oligo dT引物，以及SuperScriptTM II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGenTM库或UltimateORF库。克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。
图4-进入G ateway?系统的各种路线* 目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组
触手可及的最高级表达系统
一旦您构建好Gateway?入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway?技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。
为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。无论您选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway?目的载体。此外，你可以很容易地把你自己最喜欢的表达载体转换成Gateway?目的载体。
图5-在Gateway?系统表达全长开放阅读框
大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移
进目的载体，在Sf9昆虫细胞(杆状病毒)或大肠杆菌
BL21-SITM菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融
合蛋白。在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而
MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表
达。在Hartley, J.L. et al. (2000) Genome Research
10(11):1788-95 可以找到更多的细节。
表3-Gateway?技术入门选择
体外表达
Expressway in vitro蛋白合成系统简化当前市场上的体外（无细胞）表达系统。仅需两小时，您就可以在一个反应管中获得高达50μg 的表达蛋白，而无须传统细胞表达体系的烦琐和花费。仅需加入优化构建的超螺旋或线性DNA模板到Expressway反应管，DNA模板由T7启动子驱动。每一个反应管中包括大肠杆菌（E.coli）抽提物（可以同时进行转录和翻译）和强大的ATP能量更新系统（保证连续高水平活跃蛋白表达的能量水平要求）。
Gate way?技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法。您可以通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体，pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST（表4）（包括在系统中），然后开始体外蛋白合成。pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST载体中的T7启动子，核糖体结合位点（RBS）(仅pEXP1-DEST)以及T7终止子之间的间隔的序列搭配都为Expressway的蛋白表达专门优化（图6），从而用Expressway进行蛋白表达。转移的基因定向、阅读框正确，并随时可以用于表达。
图6 pEXP1-DEST? 和pEXP2-DEST?载体
表4-Gateway?体外蛋白合成目的载体
大肠杆菌表达
大肠杆菌提供了几种有利于重组蛋白生产的优点，包括容易操作、生长迅速和培养基要求简单。大肠杆菌非常适于表达用于抗体生产和结构研究的蛋白。
目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体（表5），从而为您提供一系列表达选择。Gateway?目的载体也会为您提供N端或/和C端融合标签的选择，从而简化表达蛋白的纯化和检测。
5－Gateway?大肠杆菌表达目的载体
* 6xHis标签来自Qiagen授权
酵母表达
酵母是最简单的真核生物之一。基因组了解清楚，生长迅速，并且非常适于大规模发酵。由于酵母是真核细胞，它可以进行高等真核细胞的一些翻译后修饰，因而可以在廉价、易于操作的宿主中，为您提供一些哺乳动物表达的优点。Invitrogen 的Gateway?酵母表达目的载体（表6）允许您利用酵母表达的优势生产目的蛋白。
表6-Gateway?酵母表达目的载体
在酵母中进行功能分析
除了在酵母中表达蛋白，现在用于研究蛋白－蛋白相互作用的ProQuest?酵母双杂交系统也是Gateway?-改造过的（表7）。这种双杂交系统允许您：
?通过重组反应转移目的基因到bait载体或prey载体
?使用基于GAL4转录因子重建系统确定相互作用
?筛选完整文库或单一克隆
?通过提供低拷贝数质粒，具有独立启动子的三种报告基因，阳性和阴性对照，及一组扩展的酵母对照菌株降低假阳性率。
?快速转移DNA序列进其它系统进行多种应用
表7-ProQuest?双杂交系统
* 3个载体全部是Gateway?-改造过的，而且具有att重组位点。
昆虫细胞表达
昆虫可以提供重组蛋白高水平、可溶性的表达。由于昆虫细胞是较高等的真核细胞，它可以提供很多哺乳动物的翻译后修饰及悬浮状态下生长的优势。由于杆状病毒和果蝇表达系统（DES?·）的改进，蛋白在昆虫细胞中表达已经大大简化。Invitrogen Gateway?昆虫表达目的载体允许您在您选择的昆虫系统中生产蛋白，并且获得您想要的表达结果。
Bac-to- Bac?杆状病毒表达系统通过应用与bacmid的体内重组，简化了杆状病毒的表达。这将允许您快速、简便地生产可以在昆虫细胞中表达的重组杆状病毒载体。目前有3种Gateway?目的载体可以满足Bac-to- Bac?杆状病毒表达系统的应用。这些载体允许裂解病毒系统中多角体(polyhedron)启动子控制下的天然蛋白、6xHis融合蛋白或GST融合蛋白的表达。
果蝇表达系统（DES?）允许在果蝇S2细胞中进行非裂解稳定或瞬时重组蛋白的表达。DES?使用简单的载体及直接的转染方法，然而却生产高水平的重组蛋白。最早自转染后两天就能够观察到瞬时表达，而仅仅两周就可以建立稳定的多克隆细胞系。我们提供的产品正在不断的扩展。如需要广泛的信息资源，请联系技术服务或登录https://www.doczj.com/doc/3a7156287.html,/gateway
表8- Gateway?目的载体
﹡6xHis标签来自Qiagen授权。
哺乳动物表达
哺乳动物表达系统通常用来生产较高等的真核细胞蛋白。由于转录、mRNA加工和翻译的信号是保守的，因而哺乳动物细胞一般会产
生正确加工的、有活性的蛋白。哺乳动物表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，这些天然蛋白可以用于功能的研究和应用。
许多Invitrogen高级哺乳动物载体已经被改造，以使用Gateway?技术（表9）。可以得到高水平诱导和组成表达Gateway?目的载体。这些载体提供各种N-或C-端融合标签，从而对表达蛋白进行方便和可靠的检测和纯化。
表9- Gateway?哺乳动物目的载体
* 6xHis标签来自Qiagen授权。
** pCMV·SPORT6 包含attB位点，而且可以用限制性内切酶和连接酶进行传统的克隆。
使您的最喜欢的载体与Gateway?兼容
Gateway?技术具有非常大的灵活性，它允许您把您最喜欢的载体作为目的载体。您可以使用Gateway?转换系统（图6），很容易地把任何载体变成G ateway?兼容载体。仅仅需要在您的载体的平末端限制性酶切位点插入一个包含attR重组位点的盒（cassette），用氯霉素抗性筛选转换子。目前有三种平末端的盒，可以将任何表达载体转化成目的载体，每个盒在5’端含有attR1位点，后面带氯霉素抗性基因(Cmr)和ccdB基因。attR2位点的盒的3’端，每个盒在三个可能的开放阅读框中的一个框架中连接N端和C端的融合蛋白。
图7- Gateway?载体转换盒
克隆多个片段的前所未有的灵活性
从以往来看，克隆多个片段到一个载体上一直是一个烦琐和耗时的过程。可以使用的限制性内切酶位点的局限和一次构建只能有一个的结果限制了成功。现在，多位点Gateway?技术（MultiSite Gateway?Techno logy）为您提供这种灵活性，可以使用不同的重组反应组装片段，同时利用重组克隆的优势，确保准确、有效和定向的组装。
使用多位点Gateway?技术：
?筛选来自不同启动子的表达
?添加启动子/标签元件到当前的Gateway?入门克隆
?转换编码蛋白结构域
?构建生物学或生物化学途径
多位点Gateway?载体构建试剂盒（MultiSite Gateway? vector construction kit）可以用于3个片段的克隆方案。当您希望将不同的5’和3’片段添加到开放阅读框或基因从而获得多重功能时，使用这个试剂盒组装多个表达克隆（图8）。多位点Gateway?技术使得复杂的克隆方案变得更加简单和有效。
图8-多位点Gateway?技术――前所未有的灵活性
产品名称目录号规格
MultiSite Gateway Three-fragment Vector 12537-023 20rxn
实验室定制服务
为了节省您在进行Gateway?克隆时的时间和精力，Invitrogen 提供广泛的定制服务。如果您打算使用定向TOPO?克隆或重组的方法来克隆您的目的基因，Invitrogen可以为您合成PCR引物。我们可以帮助您设计准确克隆和重组的引物，同时能保持基因的阅读框。引物通过Parallel Array Synthesis?技术合成，并且可以以两种形式获得－－2ml 离心管冻干形式或进行自动操作的96-孔的冻干形式。需要更多细节请登录https://www.doczj.com/doc/3a7156287.html,/订制服务。
除了引物合成以外，Invitrogen 提供还提供多种分子生物学服务，从而节省您宝贵的时间、精力和资源。利用我们训练有素的科学家完成您的全部或部分项目，这样将会增加您的能力和减少周转时间。我们提供的一些服务包括：
?定制Gateway?兼容表达载体
?PCR 优化、扩增和克隆
?Gateway?入门克隆重组进入任何数量的Gateway?目的载体
?具有高同量克隆能力的TOPO?克隆
?测序
?表达的检测和蛋白的生产
Gateway?――开放共享的系统
购买克隆技术产品（例如，TOPO? cloning，TOPO TA cloning?，TA cloning?，TOPO? Tools，Drectional TOPO? cloning，Zero Background?，Gateway? cloning Systems和Echo? cloning Systems）就可以获得如下的有限授权：您可以根据随产品的有限标签授权协议中所阐述的条款获得使用产品的知识产权。
克隆技术产品和它们的使用是U.S.专利No.5,888,732；6,143,557；6,171,861；5,766,891；5,487,993；5,827,657；5,910,438；6,180,407；5,851,808；6,270,969和/或其它未定的U.S和外国专利的主体，它们被Invitrogen 公司拥有和授权。使用这些产品要求Invitrogen 公司许可。购买这些产品可以获得一些有限的不可以转让的权利。
购买这些产品的价格包括有限和不可以转让的权利，只能单独使用所购量的产品进行内部研究。Invitrogen 保留其它所有权利，产品购买者不可以转让和出售所购产品或成分或衍生物到第三方，产品购买者无权对产品或组分或衍生物进行所限定的商业目的使用。
商业目的意味着某一团体获利的任何活动。这些活动包括，但并不限于：①在生产中使用产品或组分或衍生物。②使用产品或组分或衍生物提供服务、信息或数据。③使用产品或组分或衍生物用于诊断目的。④转让或出售通过产品或产品的组分或衍生物所制备的载体、克隆和文库，或⑤再一次出售产品或它的组分或衍生物，无论这一产品或它的组分或衍生物被再一次出售是否用于研究。
术语表
attL,attR,atttB，and attP Gateway?技术中使用的来源于λ嗜菌体重组位点。
·在LR Clonase?酶混合物介导的反应中，attL总是与attR重组，LR反应是入门克隆x目的载体反应的基础。attL 和attR 位点重组反应后，在产物质粒上形成attB和attP位点。
·在BP Clonase?酶混合物介导的反应中，attB总是与attP重组，BP反应是PCR克隆载体（pDONRTM）与包含有attB 位
点的PCR产物、克隆资源或cDNA文库克隆之间反应的基础。attB 和attP位点重组反应后，在产物质粒上形成attL和attR 位点。
BP Clonase? enzyme mix（BP Clonase?酶混合物）λ嗜菌体重组蛋白的全部混合物，介导attBxattP重组反应。
ccdB gene（ccdB基因）编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。这个基因存在于Gateway?目的载体、供载体（donor vector）和一些入门载体。当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。携带有ccdB基因的未反应载体、或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。这将允许高效回收那些想要的克隆。
DB3.1? Competent Cells（DB3.1?感受态细胞）这些细胞对于ccd基因的产物具有抵抗作用，因而用来扩增包含ccd基因的载体（例如pDONR?，超螺旋pENTR?,目的载体）。
Destination vector（目的载体）Gateway?适应载体，包含attR位点，允许与入门克隆重组。可以得到用于原核、酵母、昆虫、或哺乳动物系统及天然或融合蛋白表达的载体。
Directional TOPO? Cloning（定向TOPO?克隆）一种PCR克隆方法，PCR产物优先以5’→3’方向插入载体。参看TOPO?克隆，选择入门系统插页。
Donor vector(pDONR?)（供载体）包含attP位点的Gateway?载体。这个载体用来克隆两侧具有attB位点（表达克隆）的PCR产物或目的基因，产生入门克隆。当具有attB位点的PCR片段与pDONRTM载体在BP反应中进行重组时，它们会产生入门克隆。PCR片段（attB位点）＋pDONRTM载体（attP位点）→入门克隆
Entry clone（入门克隆）克隆DNA片段到入门载体或供载体（donor vector）的产物。入门克隆包含两侧具有attL位点的目的基因。可以用于随后的向目的载体的基因转移。
Entry vector (pENTR?)（入门载体）包含attP位点的Gateway?载体。通过使用定向TOPO?克隆或传统的限制性内切酶和连接酶的方法，克隆DNA片段。
Expression clone（表达克隆）通过重组反应，亚克隆入门载体中的目的DNA片段进入到目的载体后的产物。目的基因或DNA两侧具有attB位点。表达克隆可能是融合蛋白或天然蛋白。
入门克隆＋目的载体→表达克隆
LR Clonase? enzyme mix（LR Clonase? 酶混合物）λ嗜菌体独有的/特殊的重组蛋白混合物，介导attLxattR重组反应。Recombination site（重组位点）参看attL,attR,atttB和attP
TOPO?cloning（TOPO?克隆）一种快速、有效的PCR克隆方法，这种方法利用了DNA拓朴异构酶Ⅰ的再连接活性。
Gateway克隆技术，简单易操作 在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，在DNA连接酶的作用下，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。但是现如今我们再提到克隆的时候，远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA 序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。不要觉得Gateway克隆技术高深莫测，其实了解一下你就能懂。 Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。在体内，噬菌体（attP）和细菌（attB）的附着位点发生重组反应，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧为两个新的重组位点（attL-left-和attR-right-）。在某些条件下，attL和attR位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。 即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：BP反应和LR反应，通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆)，再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上，形成不同的表达载体。GeneCopoeia的EZShuttle?重组克隆体系应用E.coli 和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使DNA片段在载体间相互转换，其原理与Gateway 克隆技术相同。 BP反应-构建入门载体： 通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧，形成attB-PCR产物。用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。EZRecombinase BP混合物，货号：RCBM-1002-020
LR反应-构建表达载体： 制作表达载体时，选择适合的目标载体非常重要。这种选择取决于许多因素，如宿主类型，所需的表达水平和实验目的。选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。EZRecombinase LR混合液，货号：RCBM-1001-020
基于Gateway技术的表达载体构建 1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应 pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。 该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。 pGWC载体的酶切反应体系如下： pGWC 10 μl（约2μg） 10×Eam1105 I Buffer 5 μl Eam1105 I 2 μl ddH2O 34 μl 共计 50 μl 将反应混和液于37℃温育6h。取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。 2. PCR产物的回收与连接反应 PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。 DNA片段与pGWC-T的连接： pGWC-T 1μl（约50ng） DNA回收片段 4μl（600bp片段约需40ng） Solution I （TaKaRa） 5μl 共计 10μl 反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。 3. 连接产物的转化 取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。 4. LR反应与表达载体构建 表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（Entry
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。 图1 Gateway技术的灵活性 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客 目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。 Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内
切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。 二、一项强大而可靠的技术 Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 图2 Gateway技术总结 下载 (22.19 KB) 6 天前 19:23 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客 在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
Gateway? Cloning Protocols The Basics of Gateway? Reaction ?BP reaction—to create a Gateway? entry clone ?LR reaction—to create a Gateway? expression clone ?One tube format—to create a Gateway? expression clone from a PCR product ?Gateway? Vector Conversion—converting your favorite cloning vectors to Gateway? Technology TOPO? TA Cloning - To Create a Gateway? Entry Clone Step One - Produce PCR product Produce PCR products using Taq polymerase and your own protocol. End the PCR reaction with a final 7 to 30 minute extension step. Step Two - Perform the TOPO? Cloning Reaction 1. Set up one of the following TOPO? Cloning reactions using the reagents in the order shown. For electroporation, dilute Salt Solution 4-fold to prepare Dilute Salt Solution. Reagent Chemical Txn Electroporation Fresh PCR product0.5 to 4 μl0.5 to 4 μl Salt Solution 1 μl-- Dilute Salt Solution -- 1 μl Sterile Water to a final volume of 5 μl to a final volume of 5 μl TOPO? Vector 1 μl 1 μl Total volume6μl6μl 2. Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature. 3. Place on ice and proceed to transform One Shot? chemically competent E. coli, below
Gateway?技术提供以下可能： ?通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 ?将您的基因转入到多个表达系统 ?在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 Gateway?技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。 这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的 克隆效率高达95％或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时， 还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway?也有助于进行带不同数目纯化和 检测标签的表达。 Gateway?利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway?改造过的的各种表达载体（目的载体）。 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway?技术的灵活性 *目的基因克隆进入门载体后， 可以同时转移目的基因到多个目的载体。 一种强大而可靠的技术 Gateway?技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway?技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway?技术（表1和图2）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 Gateway?技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。需要了解更多的有关ccdB的信息，请
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
Gateway? 重组克隆技术 经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。这种传统的方法限制了克隆的成功率。 例如，当其可能会在目的基因内部进行切割， 从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。采用传统的克隆方法， 需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低， 从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。 而Gateway? 重组克隆技术则不存在这些问题。 极好的通用性 相反，Gateway? 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。Gateway? 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应， 并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。Gateway? 技术自推出后便为研究界广泛采用， 仅参考文献便超过1500 篇。此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。 最后，MultiSite Gateway? 技术等最新进展使得Invitrogen 的 Gateway? 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。 Gateway? 技术的优点 只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上 无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆 从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致 使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体 （Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组 位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体 （Destination Vector，目的载体）上。 Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在 噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠 杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆 菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点 可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这 一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。 在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小 均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产 物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化 时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体 以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表 达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。 同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即 目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为 125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。 当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1序列再和attR1序列重组， 融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发 生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点attP1、P2）。反应过程需要25 度保温1小时（时间越长，重组率越高，特别是较大的质粒，反应过夜能提高 5倍重组效率），蛋白酶K37度处理10分钟，转化。由于带自杀基因的载体不 能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。同样，转化用的菌 株必须是不含F附加体的。
Gateway 载体 Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间，同时将您的基因转移到多个表达系统，在任何您选择的系统-体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物-分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。 图1 Gateway技术的灵活性 目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。 二、一项强大而可靠的技术 Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 表1 反应和术语总结 图2 Gateway技术总结 在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
API Gateway实现API管理
编者按 数字化生态，以创新客户体验为核心，所有我们身边能感知到的变化都来自于渐近的创新。这些创新需要试错，需要不断的升级，并且创新往往与我们熟知的功能分离开来分别呈现。微服务对于传统单体架构的优势之一就在于，服务的拆分带来了更新、部署、管理的隔离性，让一些单独的服务可以进行创新和实验。从而支撑了用户体验的不断升级，为实现企业数字化转型的过程，提供了技术架构层面的支撑。 我们现在已经可以很方便的通过一些电子商城购买运营的合约机，而无需到营业厅亲自办理相关的业务，这就是API Gateway的一种底层支撑。由于运营商通过API Gateway向第三方的商务平台开放了与套餐、机型销售等服务，并通过流控、鉴权等机制保障相关的安全性，才使得这样方便流畅的购物体验得以实现。 对于MOBA手游类玩家来说，“王者荣耀”是一款颇受欢迎的游戏。在一些场景下，我们会感知到“不停机更新”“体验服更新”这两种不同方式的更新形态，在底层，就是API Gateway 或者类似技术的实现，支撑灰度发布，让一些新特性发布给体验服（比如传说中露娜的二技能变化，仅在体验服更新，实际上并未如传说中一样在S11赛季更新到正式服），或者特定的游戏用户，待功能完善或者稳定运行，再向正式服或者全部用户发布，让游戏玩家的体验可以更加流畅，甚至是无感知的升级。
这些只是微服务架构或者API Gateway所支撑的万千业务场景中的沧海一粟。 但微服务本身也会带来诸多问题，粒度小难以管理就是其中之一，本文即从这个角度，阐述了API Gateway所起到的作用和一些关键的技术要素。 以微服务为核心的分布式框架贯穿了普元数字化企业技术平台的APaaS层面，本文所介绍的API Gateway是其中的关键组成部分（图中标黄的部分）。
网络安全的几项关键技术 商用网络在互联网上得以运行, 首先应建立或使原有的网络升级为内部网, 而专用的内部网与公用的互联网的隔离则有赖于防火墙技术。有了防火墙, 商家们便可以比较安全地在互联网上进行相应的商业活动。 1. 防火墙技术 “防火墙”是一种形象的说法, 其实它是一种由计算机硬件和软件的组合, 使互联网与内部网之间建立起一个安全网关( scurity gateway),从而保护内部网免受非法用户的侵入。所谓防火墙就是一个把互联网与内部网隔开的屏障。 防火墙有二类, 标准防火墙和双家网关。标准防火墙系统包括一个UNIX工作站, 该工作站的两端各接一个路由器进行缓冲。其中一个路由器的接口是外部世界, 即公用网; 另一个则联接内部网。标准防火墙使用专门的软件,并要求较高的管理水平,而且在信息传输上有一定的延迟。双家网关(dual home gateway) 则是标准防火墙的扩充,又称堡垒主机(bation host) 或应用层网关(applications layer gateway), 它是一个单个的系统, 但却能同时完成标准防火墙的所有功能。其优点是能运行更复杂的应用, 同时防止在互联网和内部系统之间建立的任何直接的边疆, 可以确保数据包不能直接从外部网络到达内部网络,反之亦然。 随着防火墙技术的进步, 双家网关的基础上又演化出两种防火墙配置, 一种是隐蔽主机网关, 另一种是隐蔽智能网关( 隐蔽子网)。隐蔽主机网关是当前一种常见的防火墙配置。顾名思义,这种配置一方面将路由器进行隐蔽, 另一方面在互联网和内部网之间安装堡垒主机。堡垒主机装在内部网上, 通过路由器的配置, 使该堡垒主机成为内部网与互联网进行通信的唯一系统。目前技术最为复杂而且安全级别最商的防火墙是隐蔽智能网关, 它将网关隐藏在公共系统之后使其免遭直接攻击。隐蔽智能网关提供了对互联网服务进行几乎透明的访问, 同时阻止了外部未授权访问者对专用网络的非法访问。一般来说, 这种防火墙是最不容易被破坏的。 2. 数据加密技术 与防火墙配合使用的安全技术还有数据加密技术是为提高信息系统及数据的安全性和保密性, 防止秘密数据被外部破析所采用的主要技术手段之一。随着信息技术的发展, 网络安全与信息保密日益引起人们的关注。目前各国除了从法律上、管理上加强数据的安全保护外, 从技术上分别在软件和硬件两方面采取措施, 推动着数据加密技术和物理防范技术的不断发展。按作用不同, 数据加密技术主要分为数据传输、数据存储、数据完整性的鉴别以及密钥管理技术四种。 (1)数据传输加密技术。 目的是对传输中的数据流加密, 常用的方针有线路加密和端——端加密两种。前者侧重在线路上而不考虑信源与信宿, 是对保密信息通过各线路采用不同
Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。 Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。 图1、噬菌体位点专一性重组的机制