天津科技大学
《食品酶学》本科生课程论文
酶的非水相催化及其应用
non-aqueous enzymatic catalysis technology and its applications
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摘要
非水相酶催化反应是酶催化反应中的一个重要方面。非水相溶剂通常可增加底物溶解度, 减少水相中的副反应, 加快生物催化的速率和效率, 在药物及药物中间体和食品等方面具有较大的应用价值。以下主要分析了在非水介质中酶促反应的几个重要影响因素; 介绍了非水介质中酶催化反应的应用,以及其前景发展。
关键词：非水相催化，影响因素，实际应用，发展前景
Abstract It is well known that non-aqueous enzymatic catalysis has emerged as an
important area of enzyme engineering with the advantages of higher
substrate solubility, increased stereoselectivity, modified substrate
specificity and suppression of unwanted water-dependent side reactions.
As a result, non-aqueous enzymatic catalysis has been applied in the
biocatalytic synthesis of important pharmaceuticals and nutriceuticals.
The following main analyzed several important factors in non-aqueous
enzymatic catalysis：introduced in non-aqueous enzymatic catalysis in
front of the catalytic reaction，introduced the bright future of
non-aqueous enzymatic catalysis technology
Key words：non-aqueous enzymatic catalysis；important factors；
applications，Development prospect
目录
1 前言 (5)
2酶非水相催化的几种基本类型介绍 (6)
3 非水介质中酶促反应的几个重要影响因素
3.1 反应溶剂的影响 (7)
3.2 反应时间、温度和pH 值的影响 (8)
3.3 不同反应试剂的影响 (8)
3.4 反应时的物理因素 (9)
3.5 超声对非水介质中酶促反应的影响 (9)
4 非水介质中酶促反应的应用
4.1 非水介质中酶促反应基本应用范畴
4.1.1 在有机相中的应用 (10)
4.1.2 低共熔多相混合物体系中的酶促反应 (10)
4.1.3 固定化酶催化反应 (11)
4.2 非水介质中酶促反应的具体应用进展
4.2.1 微生物酶法拆分环氧丙醇丁酸醋 (11)
4.2.2 非水相酶催化拆分外消旋2-辛醇 (12)
4.2.3 固定化脂肪酶合成鲸蜡油工艺和设备 (13)
4.2.4 酶法生产类可可醋的开发和中试 (14)
4.2.5 非水相酶催化生产类可可脂技术 (15)
4.2.6 非水相酶法单甘醋生产专用脂肪酶 (15)
5 前景展望 (16)
6 参考文献 (17)
1、前言
酶已经在医药、食品轻工、化工能源、环保等领域广泛应用。这些应用大多数是在水溶液中进行的，有关酶的催化理论也是基于酶在水溶液中的催化反应而建立起来的，在其他介质中，酶往往不能催化，甚至使酶变性失活。因此，以往人们普遍认为只有在水溶液中才具有催化活性。
1984年，克里巴诺夫等在有机介质中进行了酶催化反应的研究，成功获得了多种有机化合物，明确指出了酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。在进行了一系列实验后，结果表明酶可以在有机介质中催化疏水性底物进行反应转化为产物，使酶在非水介质中的催化作用研究取得了进展［1］。
随后二十多年来, 非水相酶催化反应得到了快速的发展和应用。研究表明, 非水相体系酶催化反应具有许多优点, 例如,增加有机底物的溶解性, 改变反应的平衡方向, 提高反应的立体选择性, 抑制水参与的副反应, 易于消除底物和产物的抑制作用等。但是, 对于许多酶而言, 在有机溶剂中较易失活或降低活力。因此, 大多数酶在非水相中的催化反应速率远远小于水相,非水相酶反应的应用从而受到了很大的限制。为拓宽非水相酶反应的用范围, 提高酶在非水溶剂中的稳定性, 许多思路和方法已被运用于非水相酶催化领域, 主要包括蛋白质工程和溶剂工程。
2、酶非水相催化的几种基本类型介绍
一．有机介质中的酶催化
有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。
二．气相介质中的酶催化
酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。
三．超临界介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。
四．离子液介质中的酶催化
酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。
3、非水介质中酶促反应的几个重要影响因素
3.1 反应溶剂的影响
首先, 非水介质并不是指完全没有水。如果完全除去水将会导致酶构象的剧烈变化而失活研究表明, 只有与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活
性是至关重要的。我们把维持酶活性这层水称为必需水( essent ial w ater)［2］。不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不相同的。不同的脱水方式同样会影响转化率, 并且对产物产生一些影响。有些情况下在反应体系中加入适当的添加剂代替必需水, 也有助于提高酶的柔性( flexibility ) , 从而提高酶的立体选择性。其次, 在不同的溶剂中, 酶会表现出不同的甚至相反的立体选择性。有机溶剂影响酶催化的途径有三种: 一是有机溶剂与酶直接发生作用, 通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象, 从而导致酶的活性被抑制或酶的失活; 二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用, 影响正常反应的进行; 三是有机溶剂还可直接和酶分子周围的水相互作用[ 3]。一般认为, 在非水相反应体系中, 添加亲水性或水互溶性的有机溶剂对酶的催化活性不利, 因为它们会夺去酶表面微环境中的水从而使酶失活, 所以所选择的有机溶剂的疏水性越强越好。例如, 在水相酶促酯化法拆分dl- 薄荷醇的连续操作中有机溶剂对酶性能的影响如下表所示[ 4]:
有机溶剂对酶性能的影响
表中: a) 反应条件: 100mmol/ Ld- 或l- 薄荷醇, 50mmo l/L 丙酸酐, 100mg 脂肪酶, 10微升去离子水, 10ml 有机溶剂; 30 , 24h; b) 相对活力测定采用纯l- 薄荷醇作底物,根据其转化率计算; c) 分别以l- 薄荷醇和d- 薄荷醇作底物,计算二者的转化率之比; d) 以l- 薄荷醇为底物, 计算其第二批反应的转化率与第一批之比。
3.2 反应时间、温度和pH 值的影响
通常来说, 酶促反应需要在一定的温度下经过一定的时间才能达到最好的效果, 因此反应时间、温度及pH 值对酶促反应有显著的影响。例如在研究不同的酶促反应条件及热处理对木聚糖酶的影响是得到如下结果: pH = 5. 85, 温度40时各酶样的最佳反应时间为10min; pH= 5. 85,反应时间为10min 时最佳反应温度为60摄氏度; 在40摄氏度反应10 min 的条件下, 1#---3# 酶样的最适pH 值为6. 35[ 5]。可看出, 大多数酶制剂产品获得最高木聚糖酶活的酶促反应条件是
10min、60 和pH6. 35.
3.3 不同反应试剂的影响
在酶促反应中, 不同的反应试剂也对酶的催化活性有显著影响。在酶促酰化反应中, 酰化试剂的结构对酶的立体选择性有明显的影响。实验结果表明, 不同的饱和直链脂肪酸对脂肪酶PSL ( Pseudomonassp. Lipase) 催化的2- 辛醇酰化反应的立体选择性有显著影响。在正己烷、甲苯和环己烷中, 随着酰化试剂( 脂肪酸) 链长的增加酶的活性和立体选择性都呈现一个由低到高、再由高到低的变化趋势。
3.4 反应时的物理因素
酶促反应所处的物理条件会影响酶的催化活性。同样在非水相酶促合成癸酸偏甘油酯的实验中, 将酶粒抽干溶剂后在真空干燥箱中常温下干燥2h。重复使用5 次后Candidaantarict ica 脂肪酶( CAL) 仍表现出较好的稳定性。实验发现酶粒粒度渐次减小, 自第3 次起的反应现象提示酯合成酶活的降低可能与载体脱落
有关。用研钵将未使用过的酶颗粒研碎并筛分, 取不同目数的酶粒进行催化反应, 反应时间为8h。在酶促反应合成蔗糖棕榈酸酯的研究中也发现摇床速度对转化率的影响[ 6]。
3.5超声对非水介质中酶促反应的影响
一些实验表明, 许多酶促反应在有机溶剂中进行时如果在其上加以超声作用,
反应速率明显增加。Vulf son 等人报道了超声对有机溶剂中枯草杆菌蛋白酶催化N- 苯丙氨酸乙酯( APAEE)转酯反应的影响。实验表明, 在几种不同的醇溶液( 丁醇、己醇、辛醇) 中, 超声处理对转酯反应的速率都有大幅的提高, 而且有机溶剂碳链越长, 处理效果越显著。如在丁醇中反应速率约提高50% , 而在辛醇中反应速率可提高6- 8 倍。超声处理能提高有机溶剂中酶活力, 其原因可能有: ( 1) 超声作用使酶的有效表面积增加; ( 2) 持续的超声作用会导致有机溶剂中少量水分子的重新分布, 阻止了酶分子周围水膜的形成[ 7 ]。
4、非水介质中酶促反应的应用
4.1 非水介质中酶促反应基本应用范畴
4.1.1 在有机相中的应用
酶可以催化酯化反应。如脂肪酶在非水介质中催化酯化反应以及酯交换反应。Shuji Akai、To shiaki T sujino 等人在研究2- 糠酸盐在酶催化酯化中的应用时, 发现脂肪酶催化形成酯时, 非对映异构产物的产率达到79%, 而对映异构产物则为21%, 且ee 值为77%[ 8]。
酶也可以催化酰胺键形成反应、过氧酸形成反应、氧化还原反应等。酰胺键的形成有两种方式, 一是酯的酶催化氨解, 一是酶催化合成多肽。过氧酸的形成可以直接由羧酸和过氧化氢在适当的有机溶剂中脂肪酶催化下制备。氧化还原酶通常是极性化合物, 在有机溶剂中不能溶解, 因而影响了酶的活性, 这时将酶固定
在一些载体上就可以完成各种反应了。
4.1.2 低共熔多相混合物体系中的酶促反应
低共熔酶促反应技术是90 年代初继常规的水溶液中酶促反应及有机相中酶促反应发展起来的又一酶促反应新技术[ 9]。低共熔固- 固底物体系酶促反应新技术的核心思想是在保持酶活和酶的立体选择性前提下,尽可能提高反应底物的浓度, 促进平衡向生成产物方向移动, 并大大提高反应速率。低共熔多相混合物体系中的酶促反应不需溶剂, 成本低、污染少、纯化过程容易, 避免了有机溶剂对酶活性的影响, 有广阔的应用前景。
4.1.3 固定化酶催化反应
在有机酶促反应中, 固定化有利于增大酶与底物的接触面积, 阻止酶分子团聚, 从而使酶活性增大。同时, 在使用固定化酶时, 载体会改变酶的微环境, 并影响到酶的活性。通过改变载体的性质( 如亲水性、带电性等) , 可以很容易达到改变酶的微环境的目的。常见的固定化方法都可以用来制备有机酶促反应的固相酶。但由于酶在有机溶剂中不同于在水中, 不存在脱落流失问题, 因此吸附法最为常用。固定化酶的应用, 能有效地改善酶在有机溶剂中的分散状态, 降低底物或产物转移时的扩散限制, 提高催化效率。
4.2非水介质中酶促反应的具体应用进展
4.2.1微生物酶法拆分环氧丙醇丁酸醋［10］
(S)-环氧丙醇及其衍生物（R）酯作为一类重要的C3手性合成中间体，在光学活性阻断剂（如：倍他乐克、心得安等）和L一肉碱(康丽亭)等手性药物、液晶中间体、昆虫信息素的合成中具有十分广泛的应用前景。该成果的技术关键是筛选高度选择性的微生物酶催化剂, 并通过对外消旋(R,S)-环氧丙醇丁酸酯的对映选择性水解，回收获得回收获得光学活性的（R）一环氧丙醇丁酸醋。研究内容包括底物的化学合成、拆分路线的确定、酶催化剂的筛选、反应。
工艺条件的优化、反应器的选择及扩大试验。工艺特点如下①反应底物可自行合成, 成本低廉②催化用酶为自制, 来源不受限制, 可以进行大规模的发酵培养③所产酶为胞外脂肪酶, 不用提取分离, 可以直接在发酵液中加底物进行酶促转化, 工艺简单④产品易于分离精制。该成果解决了产品的提取和精制技术, 所得一环氧丙醇丁酸醋和一环氧丙醇填补一了国内空白。
4.2.2非水相酶催化拆分外旋2-辛醇
酶催化拆分外消旋化合物是制备高光学纯度手性化合物的一种简单有效的新技术, 但是绝大多数天然酶催化这些非天然底物的活性和立体选择性都不理想, 因此国际上许多学者都设法通过控制酶催化条件来提高酶的催化活性和立体选择性, 如采用固定化技术和化学修饰技术。该成果首次开发了应用固定化酶和双亲分子, 非共价修饰酶相协同的新方法, 有效地改善了有机相中酶的催化活性和立体选择性。
该成果利用非水相酶催化技术筛选出催化外消旋一2-辛醇拆分反应的最适酶源, 开发了一种适用于非水介质中提高酶催化效率的固定化新技术, 使酶的催化效率提高了1.7倍, 反应达到平衡的时间由110h缩短为8h。设计合成了一种双亲分子, 并建立了改善酶立体选择性的新方法, 使酶的立体选择性值提高了近27倍。固定化酶与双亲分子同时应用后, 酶的催化效率提高了1.8倍, 选择性提高了25倍多, 拆分所得的(S)-2-辛醇的光学纯度达98.0﹪e.e。
该成果采用酶催化技术, 反应条件温和, 为液晶生产和手性药物的开发提供了重要的手性中间体,也为精细有机合成, 特别是手性中间体的制备建立了新方法, 提供了新技术。酶催化拆分法制备手性一辛醇具有很好的应用前景。
4.2.3固定化脂肪酶合成鲸蜡油工艺和设备[11]
其技术关键是选用合适的脂肪酶在有机溶剂中催化高级脂肪酸与长链脂肪醇的醋化, 制备类同于鲸蜡油的产品, 涉及酶种选择、酶的生产、固定化酶制备、有机溶剂中反应和反应调控、产物分离提取、非标反应器研制等, 并要放大到中试规模和进行工业性试验。
该成果的创新之处及特点如下①采用自行研制的高活力中性脂肪酶生产菌, 经培养条件优化, 发酵液活力达到制备固定化酶指标的要求, 即每3L发酵液制1kg 固定化酶, 且成本低廉②比较了多种固定化载体, 筛选出硅藻土、柞蚕丝绸布、桑蚕绸布、棉绸和维尼龙布等廉价载体, 所得固定化酶性能优良、催化效率高达800~1000kg液蜡/kg固定化酶③考察了不同溶剂系统的影响, 最后采用无溶剂系统, 对反应条件进行了优化和调控, 整个过程无污染物形成, 对环境友好④产品分离简单, 收率达到90﹪, 纯度可达95﹪⑤设计安装了63L的主反应器, 进行了中试放大试验, 酉旨化率达到90﹪-95﹪,固定化酶可重复使用巧一批次, 产品含蜡量达到95﹪, 每批可得到17-19kg鲸蜡油产品。
4.2.4 酶法生产类可可醋的开发和中试
该成果的技术关键是利用,1,3位选择性的脂肪酶及有机相中酶促反应的高新技术, 从较为廉价的乌柏脂生产高级类可可脂。主要技术经济指标有①类可可脂纯度达到95﹪②类可可脂的生产成本低于元8000元/t③类可可脂质量达到国外同类产品水平, 即熔点33-36℃, 碘价33-40, 皂化价200~120, 固体脂肪指数(SFI)35℃时<5﹪。国外都以棕桐油为原料, 用脂肪酶在有机相中酶促反应生产高级类可可脂。但我国棕桐油原料相当贫乏, 而乌柏脂原料非常丰富, 且乌柏脂的主要组成为棕桐酸一油酸一棕桐酸的对称甘油三脂结构, 非常适用于生产类可可脂。乌柏脂的市售价格为3000元/t, 远低于棕桐油元8000元/t的价格。因此该研究采用廉价的乌柏脂为原料, 通过有机相中酶促反应生产类可可脂。该成果还进行了放大10倍的研究, 所得产品各项指标与小试结果相仿。对国内外6种不同的商品酶制剂进行了筛选,考察了它们的稳定性与催化性能, 确定了一种具有, 1,3-位专一性、活力最高的脂肪酶。研究了水与主体溶剂对酶催化效率的影响, 也考察了反应温度、酶浓度、底物比及转速对反应的影响, 确定最佳反应温度为60℃。考察了不同有机溶剂的影响, 选出正己烷作为酶促转醋反应的有机溶剂。对反应过程中各组分的时变规律进行了跟踪分析, 并对反应的动力学进行了数学模拟。设计制造了2L固定化酶反应器, 实现了部分自动化监测和控制, 酶的重复利用可达到批次以上。最终得到的类可可脂与天然可可脂的化学结构、组成及物理性质十分相近, 产品的纯度超过, 综合化学性能明显优于现有的国产化代可可脂。
4.2.5 非水相酶催化生产类可可脂技术
该成果以我国特有的植物油资源—廉价的乌柏醋为原料, 采用有机相酶促反应技术, 开发出一整套类可可脂生产工艺, 使产品性能符合国际类可可脂质量标准。研究中筛选出一种具有结构专一性和催化高效性的脂肪酶, 发酵单位在5000u/ml以上,可完全取代Novo公司的进口酶制剂Lipozyme, 并实现了该脂肪酶的自行生产, 大大降低了生产成本。通过对非水相酶动力学特性及固定化酶技术应用的一系列研究, 优化了非水相酶催化转醋反应的溶剂体系、反应温度、酶浓度、底物投料比和搅拌转速等工艺条件, 使多批反应周期在10h以内。设计并制造了2L和20L生物反应器, 酶反应过程实现了部分自动化检测和控制。脂肪酶的连续使用时间可达480h以上, 间歇反应批数规模达次以上, 在20L规模达30批以上, 维持酶活百分之九十左右。建立了产品分离工艺, 在中试水平上获得了理化性能与天然可可醋相近的类可可脂产品。经HPLC分析, 产物中硬脂酸和棕桐酸含量在0.05﹪左右, 产品纯度超过百分之九十。
4.2.6 非水相酶法单甘醋生产专用脂肪酶
单甘醋广泛用作食品和化妆品的助乳化剂。化学法生产单甘醋时需要在碱性催化剂作用下于220~240℃通氮保护反应, 所用油脂原料需预先加氢氢化, 对其碘价有严格要求, 否则会导致产品色泽加深。酶法生产单甘醋具有反应条件温和、产品色泽好等优点, 在生产高含量单甘醋时无需昂贵的分子蒸馏设备, 生产过程中没有废气废料排出, 因此酶法单甘醋属于绿色表面活性剂。
经初筛和诱变育种筛选出一株具有较好产酶能力的铜绿假单胞菌JW12, 通过产酶条件的优化, 使得30L发酵罐中发酵酶活达到以上230u/ml, 产品中单甘酷含量不低于75﹪。此外, 在反应器中进行了放大试验, 终产品中单甘醋含量为76.0﹪,与小试结果一致。在专题任务要求之外进行了合成产品的应用研究, 其结果表明, 酶法单甘醋用作膏霜类化妆品的助乳化剂时, 膏霜结膏点比加化学法单甘醋的结膏点低, 且75﹪酶法单甘酩加人量为1.5﹪时, 或酶法单甘醋加人量为1.5﹪~2﹪时, 乳化效果与加入量为3﹪的40﹪化学法单甘醋相当。
5 前景展望[12]
目前非水相中的催化正在由理论研究阶段向实际应用阶段过度，它使的应用领域由“生物圈”拓展到了非生物领域(化学、物理、电子、材料等学科)。在化工生产中，非水相中的催化可以取代一些反应条件苛刻、产物分离困难的传统化工工业，例如酚树脂、旋光性聚脂和新的脂肪衍生物的合成等。总之，非水相中的催化是一個很有实际意义和开发前景的领域。
从目前的研究进展来看，对非水相催化过程的研究大部分仅限于对最佳反应条件(体系中的含水量、反应温度、pH、底物摩比、有机溶剂的选择等)的探索以及对所观察的现象作出一般机理性的解释。而从定量的角度上提出非水相中影响活性的参量、对非水相催化过程中水的具体作用作進一步考察的研究较少。因而通过一些新颖的实验方法对以往的机理假说提供进一步的实验证据，在一定的范围內提出一些定量的参数，将会为今后的工业应用进一步奠定基础。另外，对酶的化学修饰将大大提高酶的活力、稳定性和适用范围，这正是在酶的工业应用中亟待解決的问题，因此对这方面进行进一步的研究也是十分必要的。考察在非水相中的催化反应动力学，设计合适的反应器形式也都是非水相中酶催化在工业化应用中需要进一步解決的问题。
6 参考文献
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酶催化技术在医药工业中的应用 摘要：近10年来随着生物技术的发展，酶催化技术已愈来愈多地用于有机合成，特别是不对称合成、光学活性化合物及天然产物的合成,已在医药、食品、轻工业、纺织等行业中得到越来越广泛的应用。本文介绍了酶和细胞固定化、非水相介质中的酶催化、低共熔酶催化反应和酶催化反应与分离的祸合等酶催化技术的研究进展,以及酶催化技术在制药工业和临床诊断及治疗上的应用。 关键词：酶催化医药工业应用 酶作为一种高效生物催化剂,具有高度的特异立体选择性及区域选择性,并在常温、常压和pH值中性附近条件下具有十分高效的催化活力。利用酶的高效选择性催化作用可制造出种类繁多的目的产物,避免了化学法合成中的许多不足。目前,酶催化技术在医药方面的应用是当前最为关注的领域之一,这主要是因为医药产品一般附加值高，且大多是光学活性物质，作为十分优良的手性催化剂—酶,用于多种高效手性药物的合成及制备将十分有效,潜力巨大。在生物学和化学领域中,作为绿色化学和手性技术的总要组成,酶催已经成为重点研究对象。 1、酶催化简介 酶催化可以看作在酶的表面吸附了反应物,或者是酶与反应物形成了中间化合物后进行反应。酶催化是酶的减慢或者加速化学反应作用。在多数情况下,化合物作为底物的能力的丧失,其原因是因为底物分子中微小结构产生变化所致。作为一种绿色的手性技术,酶催化工艺已经是化学制药领域重点研究的课题之一。酶催化剂催化的反应可在水中进行,其具有较高的立体选择性和区域选择性,反应条件较为温和是没催化剂催化的特点。随着人类环保意识的提高,制药工业对手性化合物需求的增加,使人们进一步认识了没催化剂。现代基因工程的应用以及生物技术的高速发展,也降低了生产酶成本。作为有机化学合成工具,没催化剂的优点在于选择性好、合成步骤少、多数能够在水相中进行、反应条件温和、催化效率高等。为了进一步提高酶催化剂的适应性和稳定性,利用生物工程改造和筛选酶催化剂。 2、酶催化技术的研究进展 随着生命学科的迅速发展和人们对生物大分子结构与功效认识的不断深人,对酶催化技术的研究及创新已取得了长足的进步。主要表现在以下几方面: 2.1 酶和细胞固定化技术 在实现酶催化生化或化学反应过程中,酶固定化技术可使酶长期反复和连续运行、大幅降低酶的应用成本、精简下游分离工艺,这已成为一个最主要和基础的酶催化技术,现已发展了吸附、共价、交联、包埋、微胶囊、膜法等数十种固定化方法（1）,而对多酶系统的共固定化及完整细胞的固定化则是对酶固定化技术的重要发展（1）。多酶系统的共固定化比单酶固定化成本更低、稳定性更高,并可
天津科技大学 《食品酶学》本科生课程论文 酶的非水相催化及其应用 non-aqueous enzymatic catalysis technology and its applications 学生姓名： 学号： 专业： 任课教师：
摘要 非水相酶催化反应是酶催化反应中的一个重要方面。非水相溶剂通常可增加底物溶解度, 减少水相中的副反应, 加快生物催化的速率和效率, 在药物及药物中间体和食品等方面具有较大的应用价值。以下主要分析了在非水介质中酶促反应的几个重要影响因素; 介绍了非水介质中酶催化反应的应用,以及其前景发展。 关键词：非水相催化，影响因素，实际应用，发展前景
Abstract It is well known that non-aqueous enzymatic catalysis has emerged as an important area of enzyme engineering with the advantages of higher substrate solubility, increased stereoselectivity, modified substrate specificity and suppression of unwanted water-dependent side reactions. As a result, non-aqueous enzymatic catalysis has been applied in the biocatalytic synthesis of important pharmaceuticals and nutriceuticals. The following main analyzed several important factors in non-aqueous enzymatic catalysis：introduced in non-aqueous enzymatic catalysis in front of the catalytic reaction，introduced the bright future of non-aqueous enzymatic catalysis technology Key words：non-aqueous enzymatic catalysis；important factors； applications，Development prospect
第六章酶的非水相催化 教学目的：使学生了解并掌握酶非水相催化的概念及意义，掌握酶非水相催化技术。 教学重点、难点：酶非水相催化机理。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节酶非水相催化研究概况 一、概念及分类 （一）、概念： 酶在非水介质中进行的催化作用。 1984年，美国A.M.Klibanov在《科学》上发表一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，并成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。指出，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，对酶只能在水溶液中起作用的传统酶学思想提出了挑战。 （二）、分类 1、有机介质中的酶催化 指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化作用 适用范围：底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。主要研究对象 2、气相介质中的酶催化 指酶在气相介质中进行的酶催化反应。 适用范围：底物是气体或者能够转化为气体物质的酶催化反应。研究较少。 3、超临界流体介质中的酶催化 指酶在超临界流体中进行的催化反应。 …绿色化学? ——无毒、无害要求，代替有机溶剂 4、离子液介质中酶的催化 离子液：有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好；酶反应具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等优点。 二、有机相酶反应的优点 ⒈有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续 生物转化。） ⒉可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。 ⒊能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中） ⒋可改变反应平衡移动方向（使许多热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酶 合成，酯交换等）主要朝着合成而不是水解的方向进行。 ⒌可控制底物专一性（不同底物反应所选最适溶剂不一定相同）。 ⒍可防止由水引起的副反应。 ⒎可扩大反应pH 值的适应性。 ⒏酶易于实现固定化。 ⒐酶和产物易于回收。（酶不溶于有机溶剂，有利于产物分离和酶的回收利用，且从低 沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。） ⒑可避免微生物污染。 仿水溶剂体系 原理: 可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。 仿水溶剂体系 极性添加剂对体系的影响
第六章酶的非水相催化 ◆人们以往普遍认为只有在水溶液中酶才具有催化活性。 ◆酶在非水相介质中催化反应的研究:在理论上进行了非水介质（包括有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等）中酶的结构与功能、非水介质中酶的作用机制，非水介质中酶催化作用动力学等方面的研究，初步建立起非水酶学（non-aqueous enzymology）的理论体系。 ◆非水介质中酶催化作用的应用研究，取得显著成果。 1.酶非水相催化的研究概况 ◆酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。 1.1有机介质中的酶催化： ◆有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 ◆适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。 ◆酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。 ◆酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。 1.2气相介质中的酶催化： ◆气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。 ◆适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 ◆由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。 1.3超临界流体介质中的酶催化：
◆超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。 ◆用于酶催化反应的超临界流体应当对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；超临界流体要容易获得，价格要便宜等。 1.4离子液介质中的酶催化： ◆离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。 ◆离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 ◆在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。 ◆酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶，过氧化氢酶、过氧化物酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等氧化还原酶以及醛缩酶等转移酶中的十几种酶都可以在适当的有机溶剂介质中起催化作用。而且酶在有机介质中的热稳定性比水溶液中显著提高。 ◆在理论上进行了非水介质（包括有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等）中酶的结构与功能、非水介质中酶的作用机制，非水介质中酶催化作用动力学等方面的研究，初步建立起非水酶学（non-aqueous enzymology）的理论体系。 ◆并进行了非水介质中，特别是在有机介质中酶催化作用的应用研究，利用酶在有机介质中的催化作用进行多肽、酯类等的生产，甾体转化，功能高分子的合成，手性药物的拆分等方面均取得显著成果。 2.有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响
?第八章非水相酶催化 ?概述酶催化反应的介质 ?第一节有机介质中的酶促反应概述 ?第二节有机介质中酶促反应的条件 ?第三节有机介质对酶性质的影响 ?第四节有机介质中酶促反应应用举例 ?酶催化反应的介质 ?酶非水相催化的几种类型 ?酶非水相催化的几种类型 ?第一节有机介质中的酶促反应概述 ?一．有机相酶反应的优点： ?二．有机相酶反应具备条件 ?三．有机相酶反应的研究进展 ?四．有机相酶反应的应用现状 ?一．有机相酶反应的优点： ?1．有利于疏水性底物的反应。 ?2．可提高酶的热稳定性，扩大反应pH值的适应性。 ?3．可改变反应平衡移动方向,能催化在水中不能进行的反应。 Eg:脂肪酶在水中催化油脂水解，有机溶剂中催化酯化、转酯化、氨解多种反应。P179(2) ?一．有机相酶反应的优点： ?4．可控制底物专一性，可防止由水引起的副反应。 Eg：酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移。P179(3) ?5．酶易于实现固定化。 ?6．酶和产物易于回收。（低沸点溶剂更易分离纯化产物) ?7．可避免微生物污染。 ?有机介质反应体系 ?一、非极性有机溶剂?酶悬浮体系(微水介质体系) 用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。 酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。 ?二、与水互溶的有机溶剂?水单相体系 有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。 ?三、非极性有机溶剂?水两相/多相体系 由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。 ?反应体系中水对酶催化反应的影响 ?酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶 在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多 少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关 系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。 ?酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空 间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空 间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。 ?有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。 ?二．有机相酶反应具备条件
1.1 酶催化概念 酶催化是介于均相与非均相催化反应之间的一种催化反应方式,它既可以看成是反应物与酶形成的一种化合物,也可以看成是酶表面产生的吸附物质,然后再进行反应的。酶在加速或者减慢化学反应方面发挥着重要的意义,在一个活细胞中同时进行着几百种不同的 反应,这都是借助于细胞内部相当数量的酶来完成的,它们的反应与其他催化反应一直,催化率与温度、酸碱值以及敏感性方 面都有着一定的关系。 1.2 酶催化特点 酶催化技术在应用的过程中存在着自己独特的方面,酶催化剂在通常情况下都具备着反应条件温和,具备着很高的区域选择性和立体选择性,并且反应大多数都可以在水中直接进行着。随着制药工业对手工业化合物需求量的不断增加、人类环保意识的不断增强,酶 催化技术越来越受到人们的重视,已成为化学制药领域研究最多的技术之一。同时,近年来,随着生物技术和基因工程的应用, 酶催化技术的性能也得到了很大的提升,酶催化反应以及生成成本也得到了显著的提升。在这种社会背景下,人们对酶催化剂 的认识越来越深入,极大的改变了传统酶催化反应要求提出了许多的新内容。 1.3 酶催化技术发展 传统的酶催化反应主要在水相中进行,但自1987年Kilibanov等用脂肪酶粉或固定化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽以及手性的醇、脂和酞胺以来,对酶在非水相介质的催化反应技术的开发及研究报道迅速增加,特别在手性药物的不对称合成及手 性药物拆分的生物技术开发中得到了很多应用。由于脂肪酶本身是一种界面酶,在非水介质中比较稳定,因此，具有良好的工 业化应用前景。 非水相酶催化反应是酶催化反应中的一个重要方面。非水相溶剂通常具有可增加底物溶解度,改变反应的平衡方向, 提高反应的立体选择性,抑制水参与的副反应,易于消除底物和产物的抑制作用，加快生物催化的速率和效率等优点，在药物及药物中间体和食品 等方面具有较大的应用价值。目前非水相中的酶催化技术已衍生出以下几类体系: 无溶剂系统 无溶剂系统是指以纯底物作为溶剂,没有其他溶剂的稀释和参与。通常在类似体系中,底物浓度高, 反应速度快,转化效率高, 并避免了溶剂使用和回收等问题。无溶剂系统与其他反应系统相比具有明显的优势,但局限于底物为液态的酶催化反应,在实际应用时受到 了较大的限制。 有机溶剂系统 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。 酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。它包括：非极性有机溶 剂--酶悬浮体系(微水介质体系)，与水互溶的有机溶剂--水单相体系，非极性有机溶剂--水两相/多相体系。 反胶束体系 反胶束是表面活性剂溶解于非极性溶液中形成一个围绕极性核的纳米聚集体,为一种低水含量的油包水微乳液。极性核中的水不同于普通水,其黏度较高,酸性和极性比普通水低,其中的水可以溶解原本不溶的物质,如脂肪酶等生物催化剂。 低共熔混合物 所谓低共熔混合物是指将两种纯净物按不同比例相混合,在一定组成下,相图上出现了一个最低熔化温度点,即低共熔点。此时形成的混合物叫低共熔混合物。低共熔点一般比任何一种纯净物的熔点都低。当体系温度高于低共熔温度时,体系中就会产生包含各种反 应物的液相。实验证明,以该体系为反应介质进行酶促反应时,反应正是在低共熔混合物中的液相发生的。 低共熔多相混合物体系中的酶促反应不需溶剂,成本低、污染少、纯化过程容易,避免了有机溶剂对酶活性的影响,有广阔的应用前景,对食品,制药等产品纯度要求较高的行业来说更具有深远的意义。但目前对它的研究主要限于肽类和酯类的合成。 超临界流体 超临界流体是一种超过临界温度和临界压力的特殊物质,物理性质介于液体和气体之间作为酶反应的介质。超临界流体具有黏度小、易扩散、溶解性好、无毒及产物易分离等特点。常用作超临界流体的有: CO2、SO2、C2H4、C2H6、C3H8、C4H10 、C5H12、CCIF6及 SF6等,其中最常用的是CO2。 离子液体 离子液体由有机阳离子和无机或有机阴离子构成, 在室温或室温附近温度下呈液态,不易挥发,不造成环境污染, 被誉为绿色溶剂。理论上改变不同的阳离子/阴离子组合可以合成多种不同的离子液体。离子液体易于与催化剂一起循环使用,为生物催化反应提供了新 的介质, 可提高催化剂的活性和选择性。对于易使酶失活的离子液体,通过改造其结构、加入缓冲液或调节pH 值等手段恢