实验原理：
1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。
2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。
实验步骤：
一、标本的制备：
1、涂片：
取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。
2、干燥：
目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。
3、固定：
手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。
二、染色
1、初染：
将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。
2、媒染：
加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。
3、脱色：
在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。
4、复染：
用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。
5、镜检。
实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，
成为假阳性。
还有一些组将葡萄球菌染成红色，这又可能是由于脱色时间过长，冲洗的时间过短所导致的。
G+葡萄球菌（100*）
G+链球菌（100*）
G—大肠杆菌（100*）
G—霍乱球菌（100*0
实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察 一、实验目的： 1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。 2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。 3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。 4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。 5、学习并掌握芽孢染色法。 6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。 二、主要仪器设备及材料： 1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面 2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿 3、仪器与材料： 生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉 三、原理： 微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用与细菌的单染色法基本原理一样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同
姓名班级13级生命基地班学号同组者： 科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3 【实验题目】 细菌芽孢染色 【实验目的】 1.学习并掌握芽孢染色法 2.了解芽孢的形态特征 【实验器材】 1、菌种： 枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 2、溶液和试剂： a) 5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水 b) 香柏油、二甲苯 3、仪器及其它用品： 普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等 【实验原理】 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。 与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。 【实验内容及步骤】 2、具体步骤： 1)洗片、干燥 取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。方便以后水洗染料，避免洗去细菌。 2)涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多） 3)加热固定
革兰染色液 【产品名称】 革兰染色液 【包装规格】 货号：DM0016 单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：4×20ml/盒、4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 用于细菌或真菌的涂片染色。 【检验原理】 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是由肽聚糖层厚度和结构决定的，经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时显现红色，红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来；在革兰阳性细胞染色中乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁不易脱色，所以保持着紫色。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法(属复染法)，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以临床分类鉴定，染色结果将细菌分为革兰氏阳性菌(紫色)和革兰氏阴性菌(红色)两大类。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分 1、结晶紫染色液结晶紫、乙醇 2、碘溶液碘、碘化钾 3、脱色液乙醇、水 4、沙黄染色液或复红染色液沙黄染色液：沙黄、乙醇 复红染色液：品红、乙醇 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀；制备的涂片应自然干燥，采用加热固定时，固定温度不宜过高，以背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变影响观察结果。 【检验方法】 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与水混合均匀，涂成一薄层； 2、干燥、固定：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，也可以用甲醇或乙醇固定； 3、初染：滴加结晶紫染色液染色分钟，水洗，甩干； 4、媒染：滴加碘溶液覆盖载玻片分钟，水洗，甩干； 5、脱色：滴加脱色液摇动秒，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，甩干； 6、复染：滴加沙黄染色液或复红染色液染色，水洗； 7、滤纸吸干或在空气晾干，镜检。 【检验结果的解释】 革兰氏阳性菌呈蓝色至紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）
◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。
实验四细菌的芽孢染色 生物112 周泓兆1102040226 一、目的 学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。 二、原理 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。芽孢具有厚而致密的壁，因此想要将芽孢染色需要在较高的温度（煮沸）的条件下，用强染色剂（孔雀绿）将菌体和芽孢同时染色。而同时，实验利用了孔雀绿可经水洗脱色的特点，通过水洗将菌体的着色洗脱，而芽孢因具有致密的壁而不会被水将染色洗脱。接下来用番红染色，将菌体染为红色，而在常温下品红无法将芽孢着色，因此在显微镜下形成了芽孢为绿色而菌体为红色的现象。而实验中如果要观察芽孢在菌体中的着生位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。 三、材料 1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26℃-28℃，培养2-3天。 2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液。 3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，酒精棉球，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种环，酒精灯，镊子。 四、实验步骤 1.制片：将枯草芽孢杆菌涂片并干燥固定。 2.染色：撕取一块比载玻片略窄的吸水纸，覆盖在涂片出，在吸水纸上滴加孔雀绿直至饱和。用酒精灯加热是染液保持微沸，其间不断添加适量孔雀绿染液，保持吸水纸湿润，染色5min。 3.水洗：待玻片冷却后，用镊子出去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 4.复染：用番红染液染色1-2分钟，水洗。 5.镜检：涂片干燥后，滴加香柏油置于油镜下观察。 6.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片放入废片缸，将固体垃圾放入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。 五、结果与讨论： 这个实验成功率很高，主要原因是步骤简单，染色效果明显而且影响因素少，洗脱时间对结果影响要比革兰氏染色中酒精脱色时间的影响小很多。最后结果的小遗憾是孔雀绿绿色的着色较浅，我觉得可以通过适当增加涂片的菌体密度和增加染液煮沸时间，可能会获得更好地效果。 六、思考题： 1.为什么在孔雀绿加热染色时，要待玻片冷却后才能冲洗？ 答：我推测的原因如下：①菌体在突然遇冷之后会变形甚至破裂，影响观察。②在沸腾的情况下染料能更方便地进入芽孢，那么高温下染料也应该更容易从芽孢中被洗出，所以等到冷却使得孔雀绿尽可能留在芽孢内。③防止载玻片在高温下突然遇冷而炸裂。
实验四革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌； 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
细菌的芽孢染色法 09级生命基地林剑锋（200900140065） 周三下午第四排 摘要 细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。通过芽孢染色和复染色，使细菌的菌体和芽孢呈现不同颜色，在显微镜下，我们就能够跟容易观察到芽孢，并对其特征进行识别，从而达到区分菌种甚至鉴定菌种的目的。 关键词 芽孢Schaeffer-Fulton氏染色法梭状芽孢 前言 芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用石炭酸，番红，结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颇色，很难观察。 1．实验材料与方法 1.1 实验材料 枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski），5%孔雀绿，0.5%番红，酒精灯，酒精，木夹，香柏油，二甲苯。 1.2实验方法 1.2.1 ．制片 按常规涂片、下燥、固定。 1.2.2 ．染色 加数滴5%孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时。维持5min。加热过程中及时补充染液。切勿让涂片干涸。 1.2.3 ．水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。 1.2.4 ．复染 用0.5%番红染液复染2min 。 1.2.5 水洗 用缓流水洗后，吸干。 1.2.6 ．镜检 先低倍镜，再高倍镜，最后油镜观察。
2．实验结果与分析 2.1 实验结果 芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。枯草芽孢杆菌芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，菌体基本无大变化；梭状芽孢杆菌芽胞呈圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。 图一枯草芽孢杆菌芽孢染色（x~400）图二梭状芽孢杆菌芽孢染色（x~400） 2.2 实验分析 由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用番红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圈。但是用着色力强的染色剂孔雀绿，在加热条件下染色，使染料不仅进人菌体也可进人芽孢内，进人菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经染色便难以被水洗脱。当用对比度大的复染色剂番红染色后，芽孢仍保留初染剂孔雀绿的绿色，而菌体和芽孢囊被染成复染色剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。 3．实验小结 此次芽孢染色实验，首先，收获到的当然是芽孢的染色方法。其次，对芽孢有了一个系统的认识。芽孢不仅仅是生物的休眠体而已。芽孢的各种特性还是进行生物物种鉴定和分析的重要依据。对细菌的芽孢的描述方法也有了一定的了解。 参考文献 【1】詹火元生物学通报1995年底30卷第2期p34 【2】沈萍，陈向东.微生物学.第二版.北京:高等教育出版社，2006 【3】沈萍，陈向东.微生物学实验.第4 版.北京:高等教育出版社，2007 【4】Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins ISBN 0-13-066271-2.
革兰染色 革兰染色原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 革兰染色步骤及结果 1. 涂片：首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。 2.固定：将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。 3.染色：在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗，注意水流不要直接对准薄层。 4.媒染：加碘液一滴，染1 min后用水冲洗，用过滤纸吸干。 5.脱色：用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。这一步是革兰氏染色的关键，必须严格掌握好，如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌；如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。水洗后用过滤纸吸干。 6.复染：滴加番红染色液一滴，染色10～30 s后，用自来水冲洗。
7.观察：干燥后，用油镜镜检观察，染成紫色的是革兰阳性菌，染成红色的是革兰阴性菌。 革兰染色的意义 1.鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类，便于初步识别细菌，缩小检查范围，并确定进一步的鉴定方法。 2.选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感性不同，如大多数革兰阳性菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数革兰阴性菌对链霉素、氯霉素、庆大霉素等敏感。可供临床实践中选用抗菌药物的参考. 3.与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素. 革兰染色的影响因素 1. 涂片太厚在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。 2.脱色时间阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。 3. 固定方法固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片上，保持原有的形态结构。固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。如果玻片在火焰上烤的太久、温度过高，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果。 4. 细菌培养时间细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，
革兰染色液说明书 【产品名称】 革兰染色液 【包装规格】 货号：DM0016 单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：4×20ml/盒、4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 用于细菌或真菌的涂片染色。 【检验原理】 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是由肽聚糖层厚度和结构决定的，经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时显现红色，红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来；在革兰阳性细胞染色中乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁不易脱色，所以保持着紫色。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法(属复染法)，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以临床分类鉴定，染色结果将细菌分为革兰氏阳性菌(紫色)和革兰氏阴性菌(红色)两大类。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分 1、结晶紫染色液结晶紫、乙醇 2、碘溶液碘、碘化钾 3、脱色液乙醇、水 4、沙黄染色液或复红染色液沙黄染色液：沙黄、乙醇 复红染色液：品红、乙醇 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀；制备的涂片应自然干燥，采用加热固定时，固定温度不宜过高，以背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变影响观察结果。 【检验方法】 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与水混合均匀，涂成一薄层； 2、干燥、固定：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，也可以用甲醇或乙醇固定； 3、染色。 4、滤纸吸干或在空气晾干，镜检。 【检验方法的局限性】 采用陈旧标本涂片时有产生假阴性的可能。 【注意事项】 1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。 2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在
微生物学实验报告 题目：细菌芽孢染色 姓名：学号：组别：年级班级： 同组者：时间： 【实验器材】 1．菌种：枯草芽孢杆菌。 2．染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液 3．仪器、材料：二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。 【实验目的】 1．学习并掌握细菌的芽胞染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征。 2．巩固显微操作技术及无菌操作技术。 【基本原理】 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子(endospore)，通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦被着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进如芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。 【操作步骤】 1．制片。 按常规方法涂片、干燥及固定。 2．加热染色。 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3．脱色。 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 4．复染。 用0.5%番红水溶液复染2min。 5．水洗。 用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 6．镜检。 将载玻片晾干后油镜镜检。 【实验结果】
PH1237|标准革兰氏染色液 Standard Gramˊs Stain Catalog No：PH1237Size：?4×100mL|?4×250mL Store at RT 简介 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组份 名称4×100ml4×250ml Storage 试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光 试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光 试剂(C):脱色液100ml250ml RT 试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光 自备材料 1、接种环或挑取细菌的其他工具 2、酒精灯 3、载玻片 4、光学显微镜 操作步骤 (仅供参考)： 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。 5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。 6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验材料 1.菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。 革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。 四、操作步骤 1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。 2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。 4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载 玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。 6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。 7.用滤纸吸干，油镜镜检。 五、注意事项 为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。 六、实验内容 1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色 2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。 七、实验报告
革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。
微生物的革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理： 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10） 磷壁酸含量较高（<50）无 类脂质一般无（<2）含量较高（~20） 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较： 1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。 2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。 三、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗。 4、滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗 5、滴加脱色乙醇，脱色30~40s，不宜脱色太狠，否则菌种呈假阴性。 6、水洗，滴加番红复染液，复染1min，水洗，晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论： 1、结果： 高倍镜下观察的菌体图像：
实验四.细菌芽孢染色 一. 目的要求： 目的：掌握细菌芽孢染色方法 内容：１．学习并掌握芽孢染色法 ２．初步了解芽孢杆菌的形态特征 二. 基本原理： 芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。 三. 器材 1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃） 2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液石炭酸复红染液 0.05%碱性复红蒸馏水 3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等 二甲苯.香柏油 四. 操作步骤： 一）方法1： 1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。 2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液 3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料 4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗. 6.制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体呈红色。 二）方法2： 1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。 2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min . 4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。 5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 6.加复染液染2-3分钟，水洗。 7.干燥后用油镜观察，芽孢绿色，菌体红色。 五.实验报告： 1.绘图：枯草杆菌的芽孢形态，芽孢的着色位置。 2.芽孢染色的操作要点？ 资料介绍： 1、菌种培养：37℃、18-24小时为宜。 2、染色剂的配制： A.5%的孔雀绿水溶液 孔雀绿 5g 蒸馏水 100ml
标准革兰氏染色液 简介： 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 自备材料： 1、 接种环或挑取细菌的其他工具 2、 酒精灯 3、 载玻片 4、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 编号 名称 DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份
革兰氏染色法的过程及原理 一，过程 1 ．涂片 将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 二，原理 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的 B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分 解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流 出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷 的病毒蛋白直接结合，与DNA，RNA，脱辅
实验二细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色生物科学贺冰冰 040012010025 周二 9、0 节 一、实验目的 1 学习细菌的芽孢染色法 2 学习细菌的鞭毛染色法 3 学习细菌的荚膜染色法 二、实验原理 1 芽孢染色的原理: 细菌的芽孢具有厚而致密的壁。透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色但一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。 2 鞭毛染色的原理: 细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 3 荚膜染色的原理: 荚膜是细菌分泌到菌体周围的一层黏液状物质,通常是多糖和多肽类物质. 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定。以免荚膜皱缩变形。 三、实验器材 1菌种：培养24h的枯草杆菌（Bacillcus subtilis）、培养12-16h的变形杆菌斜面,培养3d的固氮菌。 2染色液和试剂：5％孔雀绿水溶液、番红水溶液, 鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液,绘图墨水或黑色素溶液． 3器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。 四、实验方法 （一）芽孢染色： 1涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 2晾干固定；待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过3次。 3 染色： A 加染色液。加5％孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片用试 管夹夹住，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽对开始计算时问，约维持４～５min。加热过程中要随时交替添加染色液和蒸馏水，切勿让标本干涸（加热时温度不能太高）。 B 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。