酿酒酵母
酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）又称麫包酵母或者出芽酵母。
形态及大小：是一种直径为5微米
所属分类
域：真核域(Eukarya)
界：真菌界(Fungi)
门：子囊菌门(Ascomycota)
纲：半子囊菌纲(Hemiascomycetes)
目：酵母目(Saccharomycetales)
科：酵母科(Saccharomycetaceae)
属：酵母属(Saccharomyces)
种：酿酒酵母(S. cerevisiae)
酿酒酵母介绍
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称麫包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm。其繁殖的方法为出芽生殖。
酵母生活史
酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。酵母有两种交配类型，称作a和α，是一种原始的性别分化，因此很有研究价值。
酿酒酵母基因组
酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。
酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有5800个真正具有功能。据估计其基因约有23%与人类同源。酵母基因组数据库包含有酵母基因组的详细注释(annotation)，是研究真核细胞遗传学和生理学的重要工具。另一个重要的酿酒酵母数据库[1]由慕尼黑蛋白质序列信息中心维护。
在科学中的作用
因为酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细
胞周期的蛋白、信号蛋白和蛋白质加工酶。
酿酒酵母也是制作培养基中常用成分酵母提取物的主要原料。
The budding yeast Saccharomyces cerevisiae is aunicellular organism of widely recognized biotechnologicalinterest. It is used in a number of industrialfields such as baking, food manufacturing, brewing andin the production of chemicals and heterologous proteins. Moreover, itrepresents an important model organismin fundamental research.
In cells dividing by binary fission, cell division createstwo cells of equal size. In the budding yeast S.cerevisiae the cell mass at division is unequally partitionedbetween a bigger, old parent cell (P) and asmaller, new daughter cell (D). After each yeast cellbirth, the G1 phase begins and cell size exponentiallyincreases up to a critical threshold required to pass Start and enter the budded phase.The Ps threshold value is modulated according to thegenetic background, the genealogical age of the celland the physiological growth conditions, being stablefor a given status. A coordination mechanismbetween cell growth and cell division is required inorder to maintain this cell size homeostasis. The developmentof mathematical models and their evaluation againstexperimental data could help understand populationphenomena such as homeostasis.
酵母(yeast) 是一类单细胞低等真核生物, 它既具有类似原核生物的生长特性(易培养、繁殖快、
便于遗传操作等) , 又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酵母作为人类利用最早的微生物,
和人类的生活极其密切, 是酿造、食品、饲料等领域应用最广泛的工业微生物。酵母生物学研究的最显
著特点是基础理论研究与应用实践研究的内在统一, 酵母不仅是研究真核细胞各种生命过程的有用
模型和重要工具〔1〕, 而且也是外源真核生物基因表达的适宜宿主生物, 对现有工业酵母菌种遗传改良
和重组基因工程酵母生产外源蛋白显示出广阔的前景〔2〕。
酵母并非为一个严格的分类学概念, 它是一类单细胞世代较长的低等真核生物的统称。至少包括
80 个属, 600 个种, 10000 多个独立菌株。常将其分成3 大类〔3, 4〕:
(1) 酿酒酵母(S accharomycescerevisiae) , 又称面包酵母, 有真核生物中“大肠杆菌”的美名〔4〕, 主
要以发酵糖类产生乙醇和CO 2 为主要特征。一般人们讨论的酵母就是这一类酵母, 它们是工业酵母
应用中最重要的一类。(本文以下不特殊说明的酵母就指酿酒酵母) (2) 粟酒裂殖酵母(S chizosaccharomyces p om be) , 人们对其研究远远不及酿酒酵母, 其在分子及细胞生物学方面更加接近高等
真核生物, 以无性裂殖为特征, 其单倍细胞仅有3 条染色体。
(3) 非常规酵母(Nonconven t ional yeast) , 除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称, 近年这一
类生物资源引起了人们的强烈兴趣, 它的一些菌种为条件性致病菌, 如Cand id a albicans (白假丝酵母, 即“白色念球菌”),引起人们兴趣的主要原因是非常规酵母在生物工程方面的应用前景很广阔,对Pichiapastoris (巴氏毕赤酵母,即甲醇酵母)、Kluveromyces (克鲁维酵母)、Candida (假丝酵母)、
R a rrowia 和H ansenu la 等属酵母的一些菌株已建成了基因表达系统, 其中尤以P ichia p astoris和
K luveromyces L actis 较为重要。
2 酿酒酵母分子生物学
酿酒酵母的工业应用比较广泛, 历史悠久, 遗传背景清楚, 不产生有毒物质, 生物安全性好, 易于
X 收稿日期: 2001- 09- 15
作者简介: 宋宏新(1959- ) , 男, 陕西兴平人, 副教授, 研究方向: 生物化学与分子生物学
推广应用, 现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型。
2. 1 基因组〔6〕
酵母细胞核内有16 条染色体, 基因组为12052kb, 核外线粒体m tDNA 为长约25Lm (约75kb) 的双链环状分子, 常见内源质粒为2L 双链环状DNA (6kb, 周长约2Lm ) , 每个单倍体基因组含质粒60
～ 100 个拷贝。
酵母基因组作为最简单、唯一最早完成全部基因组测序的真核生物, 具有里程牌的意义, 为人类基因组计划(HGP ) 的实施和完成奠定了坚实的理论、工具和方法学基础, 1996 年1 月建立了EU RO FAN (EuropeanFunctionalAnalysisNetwork) , 系统地分析酵母的新基因功能, 酵母基因组有
关资料参见: (1) 酿酒酵母基因组数据库(h t tp: ??genome- www. stanfo rd. edu?S accharomye) ; (2)
慕尼黑蛋白质序列信息中心(h t tp: ?? speedy. M ip s. b iochem. mpg. de?mips?Yeast?) ; (3) 酵母蛋白质
数据库(h t tp: ??WWW. P roteome. com?Yed home. h tm l)。
酵母基因组与高等真核生物基因组相比, 最突出的特点是其紧密性(compactness) , 共有6138个ORF s, 编码蛋白质的基因预计共有5800 个, 约有6%～7% 为不编码蛋白质的基因。
2. 2 染色体结构功能序列及人工染色体——YAC〔7〕
酵母细胞染色体在有丝分裂或减数分裂期间能高度有序地传递给子细胞, 已知有3 种结构成分对染色体有效、稳定遗传是必需的: (1) ARS (autonomou sly rep licating sequence 自主复制序列) , 染色体自主复制序列, 是从酵母中克隆的真核细胞DNA 复制起点序列。酵母每条染色体由多个复制子组成, 复制子平均长度为36kb,
整个基因组约由400 多个复制子组成。
(2) CEN (cen t romere sequence 着丝粒序列) , 着丝粒是真核
细胞染色体在细胞分裂中精确分离
的必需结构, 每个染色体都具有一个着丝粒, 现已分离了多个CEN 序列, 其大小为900～ 600bp ,
CEN 不具有染色体专一性, 却具有种属专一性。
(3) TEL ( telomeric sequences 端粒顺序) , 线性染色体DNA 保持复制稳定性所必须的端粒顺
序, 为富含TG 的长约3000～ 4000bp 的序列, 酵母和四膜虫的TEL 基本相似, 可以通用。YAC (yeast
art if icialchromo some 酵母人工染色体) 将上述酵母染色体3 种基本功能性成分及选择标记基因有效
组合构建了酵母人工染色体(M u rray, Szostak 1983) , YAC 实际应用中都以穿梭载体的形式构建, 含
有pBR322 中的Amp r 和O ri, 酵母中常用的选择基因为TRP1,U RA 3 和SU P4, YAC 中的TEL 序
列也可来自四膜虫。YAC 承载的外源基因片段为200～ 1000bp。
2. 3 酵母基因表达特点〔5～ 9〕
酵母基因组虽小, 但其表达调控过程与其它真核生物相似, 酵母作为真核基因表达载体, 用于大
量生产外源蛋白质, 是真核生物基因表达研究的理想工具。
(1) 酵母的转录由3 种RNA 多聚酶催化, 编码RNA 聚合酶的基因与其它真核生物3 种RNA
聚合酶基因同源性很高。对酵母反式作用因子(转录因子)GAL 4、
ADR1、PPR I 等研究, 发现绝大多数
酵母转录因子的特征激活结构域能促进哺乳动物细胞的基因转录, 然而若干哺乳动物转录因子的激
活结构域并不促进酵母基因的转录。
(2) 酵母ê 类基因调控区的基本结构特点: 结构基因上游大约100bp 处含一个或多个TA TA盒
作为核心启动子, 在位于Cap 位点上游几百bp 处是上游激活序列(UA S) ,UA S 结构和功能方面类
似于哺乳动物中的增强子, 转录总是在TA TAbox 下游80～ 120bp 的特定位置开始。结构基因3′末
端有效的终止子终止转录。
(3) 酵母mRNA 具有典型的真核结构: 5′- 帽子, 3′- polyA , 成熟的mRNA 以初级转录物经拼
接后成熟产生, 酵母只有很少的基因具有内含子, 且无操纵子结构。酵母基因的翻译效率受基因编码
序列上游DNA 序列的影响, 一般要求起始密码子A TG 前保留一段短的、不变的前导序列, 它对转录
的起始并非必需, 但对mRNA 的高效翻译却相当重要。
第4 期宋宏新等: 酵母分子生物学理论及应用研究进展·79·
(4) 酵母作为真核生物的另一特征是能对翻译产生的前体蛋白质进行加工以产生功能性产物,
而且加工往往与分泌作用相偶联: a. 酵母表达载体构建中常用的分泌信号为酵母的M FA1前A一因子
前导序列(p rep ro- 2- facto r 或ppAf l) , 分泌表达多肽的分子量范围为24～ 842 个氨基酸, 一般不大
于30KD, 其它分泌信号有: 蔗糖酶信号肽、PH05 碱性碱酸酶信号序列、黑曲霉糖化酶信号序列, 酵母
不但能利用自身的分泌信号(较多) , 也能利用异源的分泌信号; b. 酵母有与真核生物相似的表达蛋
白加工转运途径, 在分泌表达时, 能正确形成二硫键和糖基化加工, 外源蛋白在酵母中能发生N —C
和O —C 连接的两种不同糖基化, 每条糖侧链平均50～ 150 甘露糖残基, 即存在过度糖基化倾向, 且
有时在核心多糖末端存在A- 1. 3 糖链, 从而使得有的糖蛋白呈较高的抗原特性。
2. 4 酵母基因工程操作
1978 年H innen〔12〕等及B tggs〔13〕完成了外源DNA 引入酵母原生质体的实验, 酵母2L质粒及其
它载体也相继完善, 酵母转化技术有了突破, 酵母的分子克隆技术及分子遗传学也迅速深入发展。为
了克服大肠杆菌表达系统的缺点, 发展了酵母细胞表达系统, 它除了对其基础研究起了很大作用外,
也为基因工程药物和疫苗的产业化做出了巨大的贡献。现有许多关
于细菌、真菌和高等动植物基因在
酵母中成功克隆和表达的报道, 其中有许多重要蛋白已经应用酵母工程菌进行生产。
2. 4. 1 酵母基因工程的载体系统〔1, 5, 8〕
酵母细胞中基因克隆和表达的载体一般有5 种类型(见表1)。
表1 酵母菌质粒特性
质粒大小
大肠杆菌
复制子
酵母菌
复制子
大肠杆菌
选择表型
酵母菌
选择表型
转化频率
LgDNA - 1
拷贝数?
细胞
在非选择
培养基中
稳定性
YIp5 (整合型) 5541bp PMB1 无Ap r, Tetr U ra+ 1～ 100 1 很稳定
YRp 17 (复制型) 7002bp PMB1 ARS1 Ap r, Tetr T rp+ ,L eu+ 103～105 3～ 30 很不稳定
YEp13 (附加体型) 10. 7kb PMB1 2Lm Ap r, Tetr L eu+ 103～ 105 5～ 40 较稳定
YCp 19 (着丝粒型) 10. 1kb PMB1 ARS1 Ap r, Tetr T rp+ ,U ra+ 103～ 104 1 稳定
YLp21 (线性型) 55kb 无ARS1 无T rip, H is 102～ 104 5～ 30 很不稳定
其中以2L环为基础构建的YEP 最常用。
表达载体与克隆载体不同的是除复制子和选择基因外, 还需包含表达必须的DNA 区段: (1) 一
个或多个供插入外源蛋白质编码序列的限制性酶切位点; (2) 核心是其上有一个可调控转录表达的
酵母启动子; (3) 启动子下游是先导序列(和翻译效率有关) , A TG (起始密码) ; (4) 往往还含有编码
有用蛋白质结构域的序列: 信号肽序列, 核定位序列, 某种抗原表位或其它标签蛋白序列。
常用的酵母高效表达载体多是YEP 类型的质粒, 其中包含的酵母强启动子有PGAL I. (半乳糖激
酶启动子)、PPHO (碱性磷酸酶启动子)、PAPL I (乙醇脱氢酶启动
子)、PPGK (3- 磷酸甘油酸激酶启动子)。
启动子上游往往包含了其上游激活位点(UA S 序列)。
可诱导启动子用于质粒编码蛋白的条件控制性表达, 特别是当某基因产物对宿主酵母有毒性时,
最好作诱导表达, 如PGAL I, 在培养基含有葡萄糖时, PGAL I转录活性低(每细胞少于1 个转录物) , 而在
以半乳糖为唯一碳源的培养基上时, PGAL I可大量转录。对于PPHO 5, 当培养基富含无机磷时, PPHO 5活性
很低, 当培养基缺乏无机磷时, 则可诱导PPHO5的转录活性。
组成型启动子中PADH1最常用, 也可用PPDK。随细胞所处的代谢状态(生长培养基) 的改变, 组成型
启动子的活性也可改变, 但这种活性的改变没有诱导的启动子那么剧烈。
2. 4. 2 酵母细胞的转化及筛选培养〔1, 5〕
构建好的载体质粒都要通过转化将外源DNA 导入宿主酵母细胞中, 再通过筛选操作分离得到
转化体。酵母转化系统的选择标记基因(M + ) 与相对应的突变基因(M - ) 的菌株配套使用, 不同选择
标记有不同的筛选方法(多为营养缺陷互补) , 转化方法可分以下两种。
(1) 完整细胞壁的酵母细胞的直接转化〔14〕: 最常用的转化方法是乙酸锂转化法, 操作快捷, 转化
·80·西北轻工业学院学报第19 卷
效率高(可达105～ 106 转化体?LgDNA ) , 分为一般法和快速法两种。快速法省时实用, 转化频率却较
低。
在乙酸锂转化法中,L i+ 的最适浓度为100mmo l?L , 受体酵母浓度为5×107 细胞?m L , pH 为
7. 0, 为维持高转化频率, 体系中需加聚乙二醇(PEG4000 或PEG3350) , 乙酸锂可用硫氰化锂代替。
(2) 酵母原生质体转化: 首先将酵母用酶法去壁成原生质体后再进行外源DNA 导入, 筛选出的
转化子再使细胞壁再生, 操作过程需将原生质体保持在一定合适渗透压的培养基中。操作步骤多而费
时, 原生质体非常脆弱, 不能直接筛选(药物) , 且原生质体可能融合产生多倍体细胞, 对依其表型筛选
造成困难, 而直接法就不存在这些问题。
酵母细胞亦可通过电脉冲穿孔法转化。在酵母转化过程中, 特别是使用乙酸锂方案时, 转化时添
加变性的单链相对高分子量单体DNA 对提高转化效率十分重要, 一般是将从鲑鱼睾丸制取的双链
DNA Ш钠盐用TE 溶液溶解并经超声波处理成2～ 15kb (最好为平均7kb) 的片段, 在转化时同质粒
DNA 同时加入转化体系。
3 甲醇酵母表达系统
酿酒酵母作为一种基因工程表达系统存在一定的局限性: (1) 酿酒酵母是一种以发酵为主的酵
母, 多不适于高密度培养, 而大多数外源基因表达需要的是以好氧条件下的营养生长蛋白质合成为条
件, 用酿酒酵母系统表达外源基因很难达到很高的水平; (2) 酿酒酵母缺乏强有力的受严格调控的启
动子; (3) 酿酒酵母对外源基因表达产物的分泌不够理想; (4) 表达菌株不够稳定, 表达质粒易丢失,
此外在翻译后加工方面也与高等真生物有所不同。
3. 1 甲醇酵母表达系统的优点〔2, 9, 10〕
甲醇酵母(P ichia p astoris) 的生物学特点: 甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶(AOX) 作用
下被氧化成甲醛。调控AOX 的启动子是强启动子, 用来调控外导源蛋白质的表达, 在以葡萄糖或甘
油为碳源的培养基上生长时抑制转录, 而在以甲醇为唯一生长碳源时, 诱导基因转录, 常用的受体菌
为GS115, KM 71 和SMD1168, 都为组氨酸缺陷型。
甲醇酵母作为真核表达系统的优点: (1) 具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX I) 启动子, 可严格
调控外源蛋白的表达; (2) 可对表达的蛋白进行翻译后的加工和
修饰, 糖基化程度低, 糖链长度平均
每条侧链为8～ 14 个甘露糖残基, 较之酿酒酵母50～ 150 甘露糖残基短得多, 核心多糖末端不存在a
- 1. 3 糖苷链; (3) 营养要求低, 生长快, 培养基廉价, 便于工业化生产; (4) 可高密度发酵培养, 表达
量高, 在发酵罐中细胞干重甚至可达120g?L 以上, 许多蛋白可达到每升克以上水平; (6) 表达的蛋白
既可存在于胞内, 又可分泌至胞外, P ichia 自身分泌的蛋白非常少, 十分有利于纯化。
3. 2 载体、转化及筛选〔15～ 17〕
P. pasteu r 质粒主要应用Y IP 整合性载体, 转化最常用的仍为乙酸锂法。其转化体筛选以H is,
U ra3 营养缺陷型筛选为主, 特征载体(PPTC3K, PPTC9K) 可用抗G418 筛选。典型的pasteu r 表达质粒
结构仍为穿梭性载体, 载体的一般结构为: (1) 5′AOX1, 含AOX1 启动子及调控序列, 同时也是载体
和宿主发生重组的位点; (2) MCS; (3) Sig 信号肽; (4) TT 转录终止和polyA 序列; (5) 3′AOX1,
TT 下游区及同源重组位点; (6) 筛选标记及E. co li 中的克隆基因。
为了提高外源基因整合到基因组中的拷贝数, 常在表达质粒中串联几个“启动子+ 外源基因+ 转
录终止区”这样的表达单位, 一次整合, 即可有多个表达单位插入基因组。
4 研究及应用展望
4. 1 酵母(酿酒酵母) 作为一种模式生物是分子生物学研究的重要工具
(1) 在生物信息领域, 通过对酵母基因组数据库的检索、类比分析, 在人类基因组研究中已显示
出巨大潜力。在酵母中进行功能互补实验是一种研究人类基因功能的捷径, 为高等真核生物提供了一
个可以检测的实验系统, 酵母成为其它生物新基因的筛选工具。期望构建的酵母最小基因组将会更加
方便和有用〔6〕。
第4 期宋宏新等: 酵母分子生物学理论及应用研究进展·81·
(2) 以酵母为主的不断完善发展的分子生物技术已成为真核分子生物学研究的重要工具。主要
包括: 酵母单杂交系统(one- hyb rid System ) , 双杂交系统( two - hyb rid system ) , 逆向双杂交系统
( reverse two - hyb rid system ) , 三杂交系统( three- hyb rid system ) , 作为研究蛋白质(转录因子) 与
DNA , 蛋白质与蛋白质, 两个蛋白质与另外的蛋白、RNA 和小分子药物等相互作用重要的生物体内
试验方法以及筛选顺式作用元件等的重要工具。酵母的单倍体- 双倍体可控制生长和产子囊孢子生
长特性, 为遗传研究带来许多方便。
4. 2 酵母基因工程在食品和发酵工业中的应用
各种酵母在生产领域有着广泛的应用历史与前景。酵母作为各种特殊蛋白的表达系统, 在生产特
殊活性肽(疫苗、药物等) 方面已取得成功应用, 并且随着研究的深入还会得到更广泛的应用, 这里仅
对酵母基因工程在食品和发酵工业几个方面的应用作以简述〔3〕。
4. 2. 1 适用发酵广谱碳水化合物的酿酒酵母改良〔20, 21〕
国内外最早的研究都集中在对酿酒酵母利用淀粉、寡聚糖和糊精的分泌酶进行基因工程改良上,
最早被克隆并引入的是Saccharomylesdiastaticu s (糖化酵母, 但不耐酒精) 的STA 1, STA 2 和
STA 3, 基因引进后以PGK 为启动子,ARS1 为复制子, 但2Lm 质粒存在稳定性不好的问题。Yocum
(1986) 将黑曲霉的葡糖淀粉酶(GA ) 基因通过Y IP 整合在酵母染色体上, 遗传稳定性及酶活能满足
生产要求, 存在问题是真菌糖化酶耐热, 不能为巴氏灭菌灭活。Schiw an iomycesoccidentacis 的
GAM 1 基因整合剂ADH1 (乙醇脱氧酶) 在基因启动子下, 可达正常工艺要求, 生产出低糖(干) 啤酒。
分泌B- 葡聚糖酶可降低啤酒汁粘度, 改善过滤性能, 该酶基因来自木霉(T richodermareesci) 的
EGL 1 或大麦, 分泌融合表达, 整合入PPGK1下可改善过滤, 不影响持泡特性。
4. 2. 2 啤酒酵母的双乙酰控制〔22〕
双乙酰作为啤酒成熟的主要标志, 它来自丙酮酸经A- 乙酰乳酸合成缬氨酸途径的副产物, A-
乙酰乳酸为双乙酰的主要前体。通过引入A- 乙酰乳酸脱酶(ALDC) 基因(来自醋酸杆菌或乳酸菌) 整
合到酵母的U RA 3 或rDNA 上,ALDC 则氧化A- 乙酰乳酸为3- 羟基丁酮, 从而达到降低双乙酰的
目的, 缩短后熟时间和对缬氨酸生物合成途径的基因( ILV ) 克隆和遗传操作使ILV 2 缺失, 且插入
ILV 3, 使酵母双乙酰产量明显降低。
啤酒酵母工艺性状是一个复杂的多基因群体作用, 对其联合综合改良, 是否会超出酵母的生理承
受极限, 搅乱其自身的遗传特性, 这将是“途径工程”面临的新挑战。
4. 2. 3 干酵母生产〔23, 24〕
酵母细胞营养丰富, 一直作为人类及其它动物重要的营养强化剂。按其应用主要分为食用营养酵
母(food yeast) 和饲用酵母(feed yeast) , 具有很大的市场发展
空间。
酵母作为最重要的单细胞蛋白(SCP) 微生物, 应用基因工程, 改良酵母蛋白质也作了不少工作。
H inch liffe 等将编码治疗用的人血清血蛋白(HA S) 的基因包括其调控表达系统转化到啤酒酵母中,
在发酵后期分泌表达HA S, 可生产出富含HA S 的啤酒新品种, 也可生产含HA S 的食用优质蛋白酵
母; 也有人将鸡卵清蛋白基因转入酵母, 而生产大量含优质卵清蛋白的干酵母。
饲料酵母产量大, 近年在饲料酵母生产菌中引入植酸酶基因, 植酸酶可分解植酸(环己六醇六磷
酸) 为肌醇和磷酸, 将饲料中普遍存在的抗营养因子——植酸分解, 释放无机磷、铁、钙、锌等, 提高饲
料的矿质营养, 并改善动物消化道消化酶活性, 该酶已作为饲料业的高档添加剂。从黑曲霉
A spergillu s n iger 963 克隆核酸酶基因, 转化P ichia 酵母, 可获得高产植酸酶(分泌) 酵母。
4. 3 食品安全性及食品级分子生物学操作系统
酵母基因工程发展前景十分看好, 在食品工业中, 它与医药工业有很大的不同, 食用或饲用酵母
往往以菌体或产品中存留有菌体, 其食品安全性就是一个重要的问题, 国外只有有限的几种工程菌
(STA 2) 应用, 如英国的BA SSH 和NH IIBREAD 公司等, 我国还未见工业应用, 1999 年青岛啤酒集
团与中科院微生物所鉴定了“利用基因克隆技术构建青岛啤酒酵母工程菌”项目合作研究合同, 将填
补我国啤酒行业在分子生物学应用上的空白。
从食品安全性出发, 在研究中应用“食品级分子生物学操作系统”。“食品级”系统是do. VO S. W.
M 在1989 年研究食用乳酸菌时提出的, 其意义是能最大限度地应用于食品工业, 或产生用在食物中
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的产物的系统, 其核心是建立和使用食品级的标记, 主要是以排除抗生素抗性基因做标记, 食品级标
记应可在食物中被人们接受, 应用范围广, 能稳定存在, 优势显著, 标记基因应当来自于有目的要进行
基因修饰的宿主, 达到自我克隆, 以营养缺陷互补作为最常用的标记。
What are yeast?
Yeast are unicellular fungi. The precise classification is a field that uses the characteristics of the cell, ascospore and colony. Physiological characteristics are also used to identify species. One of the more well known characteristics is the ability to ferment sugars for the production of ethanol. Budding yeast are true fungi of the phylum Ascomycetes, class Saccharomycetes (also called Hemiascomycetes). The true yeast is separated into one main order Saccharomycetales.
Yeast are characterized by a wide dispersion of natural habitats. Common on plant leaves and flowers, soil and salt water. Yeast are also found on the skin surfaces and in the intestinal tracts of warm-blooded animals, where they may live symbiotically or as parasites. The common "yeast infection" is typically Candidiasis is caused by the
yeast-like fungus Candida albicans. In addition to being the causative agent in vaginal yeast infections Candida is also a cause of diaper rash and thrush of the mouth and throat.
Yeast multiply as single cells that divide by budding (eg Saccharomyces) or direct division (fission, eg. Schizosaccharomyces), or they may grow as simple irregular filaments (mycelium). In sexual reproduction most yeast formasci, which contain up to eight haploid ascospores. These ascospores may fuse with adjoining nuclei and multiply through vegetative division or, as with certain yeast, fuse with other ascospores.
The awsome power of yeast genetics is partially due to the ability to quickly map a phenotype producing gene to a region of the S. cerevisiae genome. For the past two decades S. cerevisiae has been the model system for much of molecular genetic research because the basic cellular mechanics of replication, recombination, cell division and metabolism are generally conserved between yeast and larger eukaryotes, including mammals.
The most well-known and commercially significant yeast are the related species and strains of Saccharomyces cerevisiae. These organisms have long been utilized to ferment the sugars of rice, wheat, barley, and corn to produce alcoholic beverages and in the baking industry to expand, or raise, dough. Saccharomyces cerevisiae is commonly used as baker's yeast and for some types of fermentation. Yeast is often taken as a vitamin supplement because it is 50 percent protein and is a rich source of B vitamins such as niacin, folic acid, riboflavin, and biotin.
In brewing, Saccharomyces carlsbergensis, named after the Carlsberg Brewery in Copenhagen, where it was first isolated in pure culture by Dr. Emil Christian Hansen (1842-1909) in 1883, is used in the production of several types of beers including lagers. S. carlsbergensis is used for bottom fermentation. S. cerevisiae used for the production of ales and conducts top fermentation, in which the yeast rise to the surface of the brewing vessel. In modern brewing many of the original top fermentation strains have been modified to be bottom fermenters. Currently the S. carlsbergensis designation is not used, the S. cerevisiae classification is used instead.
The yeast's function in baking is to ferment sugars present in the flour or added to the dough. This fermentation gives off carbon dioxide and ethanol. The carbon dioxide is trapped within tiny bubbles and results in the dough expanding, or rising. Sourdough bread, is not produced with baker's yeast, rather a combination of wild yeast (often Candida milleri) and an acid-generating bacteria (Lactobacillus sanfrancisco sp. nov). It has been reported that the ratio of wild yeast to bacteria in San Francisco sourdough cultures is about 1:100. The C. milleri strengthens the gluten and the L.
BY4741酿酒酵母菌 BY4741Strain BY4741菌信息： 培养基：YPD 菌株类别：酵母菌 培养条件：28℃，有氧，YPD 质粒转化：电激 保存方式：30%甘油，-20℃ 基本应用：用于蛋白表达 BY4741菌使用说明： 四区划线培养，挑单菌落接种培养使用并保存甘油菌。 BY4741操作说明： 1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。 2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。 冷冻管开封： 用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。 BY4741菌株复溶： 无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml左右复溶液，加入到冷冻管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。 BY4741菌株复壮： 用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。细菌在30-35℃培养箱中培养24-48h，真菌在23-28℃培养箱中培养24-72h（必要时，可适当延长培养时间）。 BY4741菌株传代： 将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注意事项： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致
菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要5-10%CO2促进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 BY4741菌保藏条件： -20℃保存（复溶液于2-8℃保存） 保藏时间： 2-10年，应根据菌种状况及时转接
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
发酵乳中酵母菌和乳酸菌生长的相互影响 李先胜姜铁民陈历俊* (1 大连工业大学大连 116034 2 北京三元食品股份有限公司北京 100085) 摘要：探讨了乳酸菌和酵母菌之间的相互作用。在发酵过程中，酿酒酵母对乳酸菌的生长有抑制作用。乳酸菌能促进酿酒酵母和马克思克鲁维酵母的生长。酿酒酵母和乳酸菌共同接种有利于保持产品冷藏期间活菌数的稳定，菌株之间可能存在共生作用。 关键词：乳酸菌，酵母菌，相互作用 The growth interaction between lactic acid bacteria and yeast in fermentation milk LI Xian-Sheng JIANGTie-Min CHEN Li-Jun* （1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034; 2. Beijing Sanyuan Foods CO., Ltd, Beijing 100085）Abstract：Various interactions between lactic acid bacteria and yeasts yeasts were investigated.In details,the growth of lactic acid bacteria during fermentation was inhibited by the addition of Saccharomyces cerevisiae．The addition of lactic acid bacteria advanced the growth of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus.A positive interaction between Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria was observed during cold storage to improve the viability of each other. Key word：lactic acid bacteria;yeast;interaction 酵母菌广泛存在于自然界中，它们经常存在于商业和传统的发酵乳制品中。有研究报道在发酵乳制品中酵母菌的数量在103-107之间[1-5]。在酸奶中酵母菌被认为是污染物，它们是酸奶变质的主要原因[6]，但在一些商业化的乳制品（kefir和koumiss）中，酵母能够为产品带来期望的香气和风味[7]。在发酵乳制品生产加工过程中起主要作用的是乳酸菌的乳酸发酵，酵母菌所产生的风味物质等代谢产物也能影响乳制品的品质。近年来，不断发现酵母菌作为附属发酵剂对乳制品发酵和成熟过程中的风味影响、抑制有害菌的生长及对人体的潜在益生 基金资助：国家科技部“十一五”支撑计划（2009BADB9B06）； 国家“863”计划(2011AA100903)； 北京市科技计划(D10110504600000)。 作者简介：李先胜，男，硕士 *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/4e660947.html,
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
酵母菌在人类生活中的应用 摘要：涉及到人类食品中的酵母菌种类繁多，其中不同种类有不同的功能，这使得酵母菌在食品中有着广泛的用途，与人类的生活息息相关，随着科学技术的发展，酵母菌一定可以为人类的生活做出更大的贡献。 关键字：酵母菌应用前景 酵母菌是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。依照荷兰科学家Loddoy在1970年提出的分类系统，将有无形成有性孢子作为分类的起点，属上的分类主要依据形态，种的规划主要依据生理的特性，将酵母菌分为三个亚门：1.能形成子囊孢子的酵母属子囊亚门，共4个科22个属139种酵母。2.能产生冬孢子和担孢子的酵母菌，属于担子菌亚门、冬孢子纲、黑粉菌目、黑粉菌科共9个科。3.能产生掷孢子的酵母菌，属于担子菌亚门、东孢子纲、掷包酵母科、科内有三属。4.不能产生有性孢子，尚未发现有性过程的酵母属于半知菌亚门，共12个属170个种。但就我国目前所常用的分类是将酵母菌分为：鲜酵母、活性干酵母、即发酵母。酵母菌在生物界中的种类繁多，其在人类生活中也得到广泛的应用。据科学家推测，早在史前三千多年，人类就已经懂得酵母的发酵技术，虽不知原理，但却已有相当丰富的经验。据考古学家考证，在史前2500年的埃及Theban法王填墓内找到经发酵的面包实体和证明酒和啤酒酿造的壁画和宝物，以及在公元前2698年中国史记记载了自黄帝开始已有教民烹煮面食的记载，都证明人类在这之前就已懂得种植稻米、小麦以及储存、磨粉和利用酵
母调制不同的食物。由此看来，酵母菌的利用已深入人类的发展史。 1.酵母菌在发酵乳制品中的应用 随着科学技术的发展，酵母菌在酿造、奶制品、焙烤食品等有着飞速的发展。内蒙古农业大学的贺银风教授探究了国内外传统的发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的相互作用关系，指出了酵母菌在发酵品中的与乳酸菌有着同样的作用，菌种间相互促进和相互制约控制产品的风味特点、营养特征、医疗和保健作用。这为研究酵母菌在乳制品中的应用提供了理论的参考，不同的乳制品中的酵母菌存在着多样性，往往是多种酵母菌的共同作用形成不同的风味，不同的品质，而不同地区也有着自己特有的酵母菌，这是由于酵母菌的多样性所决定的。酵母菌在发酵乳制品中存在着许多的优点，主要是对于干酪的成熟有着诸多作用，例如：“（1）酵母菌能利用凝乳中由于乳酸菌的乳糖发酵所产生的乳酸，使凝乳的pH值有所提高，由起初的5到6左右。酸度的降低，刺激了对干酪成熟也有促进作用的细菌的生长繁殖；（2）某些酵母菌能产生胞外蛋白分解酶和脂肪分解酶，分解干酪中的蛋白质和脂肪，加速干酪的成熟，使干酪中可溶性含蛋物和辛酸、癸酸等其他高级脂肪酸增加L3J，对干酪的风味和结构起着至关重要的作用；（3）干酪内部的某些酵母菌能发酵牛奶中的乳糖，产生少量的CO，影响干酪的组织结构；（4）某些酵母菌能影响干酪某些风味物质如甲基酮的形成[IJ]；(5)酵母菌能产生多种水溶性维生素，增加干酪的营养价值；（6）酵母菌在干酪中的生长繁殖和代谢作用，还能抑制腐败微生物和梭状芽孢杆菌的生长LIJ5。酵母菌在乳制食品中的主要
酵母 英语名称：yeast 酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌主要的生长环境是潮湿或液态环境，有些酵母菌也会生存在生物体内。 【生理】 和乙醇来获取能量。 酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳 C6H12O6 （葡萄糖）→2C2H5OH + 2CO2 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 【特征】 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落。 【生殖】 酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行有性生殖。无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子（一般是四个），在条件适合时再萌发。一些酵母，如假丝酵母（或称念珠菌，Candida）不能进行无性繁殖。 【酵母菌的生长条件】
目录 1酵母菌的种类 (3) 2 选育技术 (4) 2.1 自然选育 (4) 2.2杂交育种 (4) 2.3原生质体融合育种 (4) 2.4诱变育种 (4) 2.5分子生物学育种 (5) 2.6基因工程育种 (5) 3鉴定及筛选 (5) 3.1 传统鉴定 (5) 3.2 现代分子鉴定 (5) 4 酵母的应用 (5) 4.1 食品工业上的应用 (6) 4.1.1 传统食品 (6) 4.1.2 调味剂 (6) 4.2医疗保健行业上的应用 (6) 4.2.1保健品和营养品 (6) 4.2.2制药 (6) 4.3饲料工业上的应用 (6) 4.3.1酵母培养物 (6) 4.3.2单细胞蛋白 (7) 4.3.3生产食用色素 (7) 4.4酿造工业上的应用 (7) 4.4.1酿酒 (7) 4.4.2制酱油、醋 (7) 5.展望 (7) 参考文献 (8)
酵母菌的研究概况 摘要：对酵母的种类及其育种技术、鉴定及筛选方法、行业中的应用情况等方面作了综述。 关键词：酵母菌；选育；鉴定筛选；生产应用 酵母菌(Yeast)是一类单细胞微生物,但不同于细菌,是一类以出芽生殖为主要繁殖方式的真菌,属真核微生物,yeast源自希腊语zestos,意思是“沸腾”，指酵母利用糖发酵产生二氧化碳形成泡沫的现象。 “酵母菌”这一名词不是分类学上的名词，而是一种习惯上的叫法。酵母菌这一微生物最早是由列文虎克在1680年观察酒精发酵液时发现的。1938年Schwann将此微生物命名为糖真菌(Sugerfungus)。1937年Meyen将葡萄酒酵母命名为Sacharomyces，迄今沿用为酵母属。在分类学上酵母菌属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)[l,2]。因此,给酵母菌下一个定义很难，目前认为具有以下特点的真菌即为酵母菌：(l)个体一般以单细胞状态存在；(2)多数出芽繁殖，少数裂殖；(3)能发酵糖产能；(4)细胞壁常含甘露聚糖；(5)喜在含糖量高、酸度大的水生环境中生活。 酵母菌广泛分布于自然界，主要生长在偏酸性含糖丰富的环境，必须以有机碳化物，主要是葡萄糖等单糖为碳源物质[3]，特别喜欢聚集于植物的分泌液中，如水果、蔬菜、花蜜、蜜饯上，在果园的土壤中也大量存在[4]。数千年来，酵母就和人类的日常生活有着紧密的联系，人们虽然没有见过酵母是什么样子，但却利用酵母的发酵能力来酿酒、发面。早在史前时期，人类祖先就从成熟的落果自然发酵现象中学会了酿酒，6000年前埃及人就有利用酵母菌生产酸啤酒的记载，公元前1200年，埃及建立了酿酒和制作面包的工艺技术。公元前1000年，我国已有蒸馏乙醇饮料的记载[5]。随着现代微生物学和生物技术的发展,酵母菌在我们的生活中变的越来越重要。 1酵母菌的种类 目前，国内外一般按产品的用途进行分类。根据酵母产品分为以下几大类： （一）面包酵母类 包括鲜酵母（压榨酵母）和活性干酵母两类。根据面团含糖量的不同，又可分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。 1.压榨酵母：采用酿酒酵母生产的含水分70～73%的块状产品。呈淡黄色，具有紧密的结构且易粉碎，有强的,发面能力。在4℃可保藏1个月左右，在0℃能保藏2～3个月产品最初是用板框压滤机将离心后的酵母乳压榨脱水得到的，因而被称为压榨酵母，俗称鲜酵母。 2.活性干酵母：采用酿酒酵母生产的含水分8%左右、颗粒状、具有发面能力的干酵母产品。采用具有耐干燥能力、发酵力稳定的醇母经培养得到鲜酵母，再经挤压成型和干燥而制成。发酵效果与压榨酵母相近。 3.快速活性干酵母：水分含量为4～6%。它是在活性干酵母的基础上,采用遗传工程技术获得高度耐干燥的酿酒酵母菌株，经特殊的营养配比和严格的增殖培养条件以及采用流化床干燥设备干燥而得。与活性干酵母相同，采用真空或充惰气体保藏,货架寿命为1年以上。 （二）酿酒用活性干酵母类 按产品的用途分为：酒精活性干酵母，白酒活性干酵母，葡萄酒活性干酵母，黄酒活性干酵母和啤酒活性干酵母等。其中白酒活性干酵母分为很少产酯的酒精活性干酵母和产酯能力较强的生香活性干酵母两类。 按发酵温度，酿酒酵母又可分为两类：常温活性干酵母，耐高温活性干酵母。 （三）药用酵母类 用糖蜜，粮食为原料，经啤酒酵母，葡萄酒酵母或产沅假丝酵母发酵，未经提取其他成分，
酵母菌的生活史 上代个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程，称为该生物的生活史或生命周期。 各种酵母的生活史可分为三种类型： 1. 单倍体型 2. 双倍体型 3. 单双倍体型 1、单双倍体型 单双倍体型 以啤酒酵母为代表 特点：单倍体营养细胞和双倍体营养细胞均可进行芽殖。营养体既可以单倍体形式也可以双倍体形式存在；在特定条件下进行有性生殖。 单倍体和双倍体两个阶段同等重要,形成世代交替 2、单倍体型 单倍体型 以八孢裂殖酵母为代表 特点:营养细胞是单倍体；无性繁殖以裂殖方式进行；双倍体细胞不能独立生活，因为双倍体阶段短，一经生成立即减数分裂。 3、双倍体型 以路德类酵母为代表 特点：营养体为双倍体，不断进行芽殖，双倍体营养阶段长，单倍体的子囊孢子在子囊内发生接合。单倍体阶段仅以子囊孢子形式存在，故不能独立生活。 （六）上面酵母与下面酵母 并非分类学上的名称，而是在啤酒酿造业中根据酵母菌在容器内的情况而对酵母菌株进行的分类： 上面酵母——在发酵过程中细胞浮游在液体上层，是较活跃的发酵剂； 下面酵母——在发酵过程中细胞沉于容器底层，是较缓慢的发酵剂。 （七）噬杀酵母 噬杀酵母——是指某些在其生长繁殖过程生长能向菌体外分泌一种称作噬杀毒素的毒性蛋白的酵母菌株。噬杀酵母对噬杀毒素具有免疫力。噬杀酵母能杀死同族及亲缘酵母，这种特性为一般物质抗生物质所没有。 中性菌株——既不能杀死别的酵母，也不能被噬杀酵母杀死的酵母菌株。 敏感酵母——可以被噬杀酵母杀死的酵母菌株。 酵母菌的代表属 1、酵母菌属 例：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 2、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.) 3、假丝酵母属(Candida spp.) 例：热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂假丝酵母和产朊假丝酵母 4、球拟酵母属 5、红酵母属
酿酒酵母 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）又称麫包酵母或者出芽酵母。 形态及大小：是一种直径为5微米 所属分类 域：真核域(Eukarya) 界：真菌界(Fungi) 门：子囊菌门(Ascomycota) 纲：半子囊菌纲(Hemiascomycetes) 目：酵母目(Saccharomycetales) 科：酵母科(Saccharomycetaceae) 属：酵母属(Saccharomyces) 种：酿酒酵母(S. cerevisiae) 酿酒酵母介绍 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称麫包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10 μm。其繁殖的方法为出芽生殖。 酵母生活史 酵母的细胞有两种生活形态，单倍体和二倍体。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞（酵母的优势形态）也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能够进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。酵母有两种交配类型，称作a和α，是一种原始的性别分化，因此很有研究价值。 酿酒酵母基因组 酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。 酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有5800个真正具有功能。据估计其基因约有23%与人类同源。酵母基因组数据库包含有酵母基因组的详细注释(annotation)，是研究真核细胞遗传学和生理学的重要工具。另一个重要的酿酒酵母数据库[1]由慕尼黑蛋白质序列信息中心维护。 在科学中的作用 因为酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细
酵母菌 子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。可用于酿造生产，有的为致病菌。是遗传工程和细胞周期研究的模式生物。 酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。 生理 酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇（俗称酒精）来获取能量。 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 在有氧气的环境中，酵母菌将葡萄糖转化为水和二氧化碳.无氧的条件下，将葡萄糖分解为二氧化碳和酒精. 在温度适合时，氧气和养料充足的条件下，以出芽方式迅速增殖。 化学元素组分 酵母的化学组成与培养基、培养条件和酵母本身所处的生理状态有关。 一般情况下： 酵母细胞的平均元素组成(%)如下：碳-47 氢-6.5 氧-31 氮-7.5~10 磷-1.6~3.5 其他元素的含量很少（%） 钙-0.3~0.8 钾-1.5-2.5 镁--0.1~0.4 钠-0.06-0.2 硫-0.2 在酵母中发现的微量元素（mg/kg) 铁--90-350 铜：20-135 锌：100-160 钴：15-65 特征 各种酵母菌的菌落 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米或5~20微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的
Commonly used strains information include: ? ? used lab strains ? identity between common lab strains S288C Genotype:MATαSUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1 ho bio1 bio6 Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. It has an allelic variant of MIP1 which increases petite frequency. S288C strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically. The S288C genome was recently resequenced at the Sanger Institute. References:Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43. BY4743 Genotype:MAT a/αhis3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0 Notes: Strain used in the systematic deletion project, generated from a cross between BY4741 and BY4742, which are derived from S288C. As S288c, these strains have an allelic variant of MIP1 which increases petite frequency. See Brachmann et al. reference for details. References:Brachmann et al. (1998) Yeast 14:115-32. FY4 Genotype:MAT a Notes: Derived from S288C. References:Winston et al. (1995) Yeast 11:53-55.
酵母菌，一群主要进行芽殖、低等的单细胞真菌的总称、酵母菌是人类应用比较甲的，也是应用最为广泛的人类第一种“家养微生物”，我国占代劳动人民就利用酵母菌酿酒、对酵母菌的甲期研究是出于对发酵现象的兴趣、现代人们经常利用它的发酵作用制造各种发面食品和酿酒。 酵母菌是一类单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。，酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性潮湿的含糖环境中，如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表而以及果园土壤中，日前己知的酵母菌有1000多种。根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。酵母菌除了应用于食品生产(如酒精饮料、酱油、食醋、馒头和而包的发酵等)中，其本身也具有很高的营养价值。 酵母菌的繁殖方式 酵母菌的无性繁殖 芽殖：酵母菌最常见的无性繁殖方式是芽殖。芽殖发生在细胞壁的预定点上，此点被称为芽痕，每个酵母细胞有一至多个芽痕。成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。如果酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。 裂殖：是少数酵母菌进行的无性繁殖方式，类似于细菌的裂殖。其过程是细胞延长，核分裂为二，细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个具有单核的子细胞。 酵母菌的有性繁殖 酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。两个临近的酵母细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个通道，两个细胞核在此通道内结合，形成双倍体细胞核，然后进行减数分裂，形成4个或8个细胞核。每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。 酵母的分类 酵母产品有几种分类方法。以人类食用和作动物饲料的不同目的可分成食用酵母和饲料酵母。食用酵母中又分成面包酵母、食品酵母、药用酵母和饲料酵母等。 面包酵母 又分压榨酵母、活性干酵母和快速活性干酵母。①压榨酵母：采用酿酒酵母生产的含水
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，
酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)一直作为面包和馒头以及酿造葡萄酒和啤酒等产品的发酵株．随着石油资源的日益枯竭以及环境的持续恶化，能源和环境问题成为了全球关注的焦点．为了缓解能源危机给经济和环境带来的影响，各国一方面提高能源的利用率，另一方面大力开发新型能源．由于生物能源具有绿色性和可再生性，因此成为研究的热点与重点．研究发现?，通过酿酒酵母发酵代谢生产乙醇，然后将乙醇进一步脱水后再加上适量的变性剂就可获得变性燃料乙醇．因此，利用酿酒酵母发酵技术将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇，已成为解决世界能源危机和开发生物能源的重要手段．燃料乙醇俗称酒精，是国民经济中十分重要的工业产品，用途十分广泛，如在食品行业用于配制各类白酒、果酒、药酒等[1]；在化工行业用于合成化工产品(橡胶、苯胺、乙二醇等)；在燃料方面用于替代日益匮乏的石油资源，可有效减少环境污染，市场前景广阔；在医药工业用于提取医药制剂和作为消毒剂；染料生产、国防工业等也需要大量酒精；同时酿酒酵母中还含多种生理活性物质和营养成分，可用于食品和动物饲料的添加剂，不仅能提高其营养价值，而且还具有医疗保健功能，治疗机体因消化不良或维生素缺乏而引起的一些疾病．此外，酿酒酵母与动、植物同为真核生物，具有很多相同的细胞结构，并且具有生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特点[2]，在生命科学研究中被用作真核生物研究的模式生物．选育出优良的酿酒酵母菌种不仅能提高产品的产量和质量、降低生产成本、增加企业的利润和市场竞争力，还能缓解能源危机、减轻环境污染．因此，对酿酒酵母进行研发与利用具有重要的经济价值和科研意义．人们急切盼望获得具有多种优良特性的酿酒酵母菌株，尤其是转化乙醇能力强的酿酒酵母，其研究意义十分深远． 不仅如此酿酒酵母还存在高效合成萜类的甲羟戊酸途径，可有效吸附废水中的Mn，具有表达人血清白蛋白(HSA)系统等，可以利用酿酒酵母的这些功能，将其应用于处理传统方法不能处理的低浓度重金属废水或用于避免人血生产HSA时造成的肝炎和艾滋病等疾病的传染以及将酿酒酵母改造为生产青蒿酸、丹参酮和人参皂苷等多种药用萜类化合物的工程菌[3]．此外，利用酿酒酵母作为底盘菌构建生产番茄红素细胞工厂也具有很大潜力[4]。 [1]汤晓宏，胡文效，魏彦锋，等．葡萄酒野生酿酒酵母的筛选及其生物特性的研究[J]．山东大学学报：理学版，2014，49(3)：12～17． [2]张强，郭元，韩德明，等．酿酒酵母乙醇耐受性的研究进展[J]_化工进展，2014，33(1)：187—191． [3] de LianosFrutos R，Fernandez—Espinar M T，Querol A．Identification of species of the genuscandida by analysis of the 5．8S rRNA gene andthe two ribosomal internal transcribe d spacers[J]．Antonie Van Leeuwenhoke，2004，85(3)：175-185． I20 J Coulon J，Husnik J I，Inglis D L，et a1．Metabolicengineering of Saccharomyces cerevisiae tominimize the production of ethyl carbamate inwine [J]．Am J Enol Vitic，2006，57(2)：113—124． [4] J Fell J W，Bockhout T，Fonseca A．et a1．Biodi—versity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large—subunit rDNA D 1／D2domain sequence analysis[J]．Int J SystEvolMicrobiol，2010，50(3)：1351—1371．
第四节酵母菌 三、酵母菌的繁殖方式与生活史 （一）酵母菌的繁殖方式 酵母菌的繁殖方式有无性繁殖和有性繁殖两类，其中无性繁殖又分为芽殖和裂殖。各种酵母的繁殖方式不尽相同。在发酵工业中常用的酵母以无性繁殖中的芽殖为主。 1.无性繁殖 （1）芽殖 1）酵母菌的出芽过程（图2-72，图2-73）。首先是细胞核邻近的中心体产生一个小的突起点，同时细胞表面向外突出，逐渐冒出小芽。然后部分已经增大的核、细胞质、细胞器（如线粒体等）进入芽内，最后芽细胞从母细胞得到一套完整的核结构、线粒体、核糖体、液泡等，与母细胞分离并成为独立的细胞。 2）酵母的出芽数。一个酵母能形成的芽数是受到限制的。在酿酒酵母中，若营养不受到限制，产生的芽即人为除去，则每个细胞可产生9～43个芽。然而在正常情况下，在达到平衡期的正常群体中，大多数细胞或没有出芽痕或只有很少的芽（1～6个），仅少量的细胞有12～15个芽，也有的研究者认为常见的是以20个芽为度。在群体中，最老的部分细胞出芽数小于最大值的原因是营养消耗和（或）细胞数量太大（图2-74）。 图2-72 酵母细胞的出芽过程
图2-73 酵母细胞出芽过程的核行为 3）酵母细胞的出芽位点。在双倍体酵母属中，芽的分布或多或少是随机的。在单倍体酵母属中，出芽痕多数以排、环或螺旋状出现。在产生3～4个子细胞后，细胞表面逐渐不规则，在产子囊的尖形酵母中，出芽点都在细胞的两极，出芽痕彼此重叠。由于细胞的极区被一系列环圈占据，因而具有特殊的芽痕特征。红酵母属的种株通常在同一位点重复形成芽，由于在原来细胞壁下面连续地出芽，于是形成厚厚的领圈状。 图2-74 酵母细胞的多个芽痕 一般当芽长到正常大小时，子细胞就与母细胞脱离，以典型的单细胞状态存在。但也有的酵母在芽长到正常大小时仍与母细胞相连，而且还继续产生芽。如此反复进行，最后成为具有发达或不发达分枝的假菌丝（图2-75，图2-76）。实际上假菌丝就是芽殖后的子细胞与母细胞之间极窄的相连面，像一细腰。而真菌丝横隔处两细胞的宽度是一致的。是否形成假菌丝在酵母分类上虽具有重要意义，但由于假菌丝的形态会随培养条件改变，因而它在分类上的参考价值不大。 图2-75 假菌丝的几种类型