本科毕业论文
论文题目高产果胶酶菌株的筛选
学院食品科学与工程学院
专业食品科学与工程
目录
前言 .......................................................................................................................... - 2 - 1 材料与方法 .......................................................................................................... - 3 - 1.1材料..................................................................................................................... - 3 - 1.2试剂..................................................................................................................... - 3 - 1.3仪器设备............................................................................................................. - 3 - 1.4试验方法............................................................................................................. - 3 - 1.4.1技术路线.......................................................................................................... - 4 - 1.4.2菌种分离.......................................................................................................... - 4 - 1.4.3菌株培养条件的研究...................................................................................... - 5 - 2结果与分析 ........................................................................................................... - 6 - 2.1初筛结果............................................................................................................. - 6 - 2.2复筛结果............................................................................................................. - 6 - 2.3菌种形态观察..................................................................................................... - 7 - 2.4单因素试验结果................................................................................................. - 7 - 2.4.1碳源对菌株产酶能力的影响.......................................................................... - 7 - 2.4.2氮源对菌株产酶能力的影响.......................................................................... - 7 - 2.4.3表面活性剂对菌株产酶活性的影响.............................................................. - 8 - 2.4.4发酵培养基初始pH值对菌株产果胶酶的影响........................................... - 8 - 2.4.5发酵温度对菌株产果胶酶的影响.................................................................. - 8 -
2.5正交试验结果..................................................................................................... - 9 -
3 结论 .................................................................................................................... - 10 - 参考文献 ................................................................................................................ - 11 - 致谢 ........................................................................................................................ - 13 -
高产果胶酶菌株的筛选
巩亚莉
（甘肃农业大学食品科学与工程学院05级食科班）摘要：本试验采用平板分离法，从腐烂的水果（苹果、梨、枣、甜瓜、籽瓜）中进行高产果胶酶菌株的筛选。同时，通过单因素试验和正交试验对菌株的培养条件进行了优化。试验结果表明：菌种的最适碳源为葡萄糖，浓度为1.5%；最适氮源为蛋白胨，浓度为0.6%；最佳表面活性剂为吐温-60，浓度为0.01%；最适pH值为3.8；最适发酵温度为43℃。在此条件下菌株的产酶能力可以达到10758 u/.mL。
关键词：果胶酶，筛选，培养条件优化
前言
果胶酶（pectinases）是指能分解果胶质的多种酶的总称，不同来源的果胶酶其特点也不同，微生物来源的果胶酶主要有聚半乳糖醛酸酶(PG)，聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL）和果胶酯酶(PE)[1]。PG在果胶酶系中发现较早，它可以水解D-半乳糖醛酸-1,4糖苷键，产物为单半乳糖醛酸和二半乳糖醛酸；PGL通过切断果胶分子-1,4糖苷键，生成具有不饱和键的半乳糖醛酸酯；PMGL可以切断果胶分子-1,4糖苷键，产物为2～8个糖醛酸单位的不饱和的甲基半乳糖酸低聚物；PE能够使果胶中的甲酯水解，生成果胶酸和甲醇[2]。
产果胶酶的菌种一般可以从腐烂的果蔬以及果园泥土中的微生物中利用果胶为唯一碳源的分离培养基中筛选出来。野生菌株的酶活力往往很低，必须对其进行诱变及发酵条件的优化等以改善菌株的产酶性能。
果胶酶的工业化生产均采用微生物发酵方法进行。产生果胶酶的微生物如表1所示[3]。
表1 常用产果胶酶菌种
微生物产果胶酶菌属
霉菌Aspergillus、Penicillium、Rhizopus、Fusarium
细菌Erwinia、Pseudomonas、Bacillus、Clostridium
酵母Trichosporm、Kluyveromyces、Saccharomyces、Aureobasidium
商品酶制剂的生产菌主要是一些真菌。包括Aspergillus Niger，Rhizopus oryzae，Rhizomucor meihei等。Reddy(1997)概括了曲霉属中产果胶酶的一些菌种，主要有A.flavus，A.niger，A.terreus，A.sydowii等。其中黑曲霉是国际公认的安全菌株，它的代谢产物可以直接应用于食品[4]。
果胶酶在工业中的应用十分广泛，主要集中在果汁果酒的澄清、果蔬汁的提取[5]、对水果和蔬菜进行浸解、液化以生产单细胞果汁和菜汁、果实脱皮、木材防腐、棉织物精炼加工等方面[6]。国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代。八十年代以来我国学者对果胶酶菌种选育进行了广泛的研究。田英华等选育了一株高产果胶酶的黑曲霉突变株HYA4，在优化的发酵条件下酶活力达1285 U/g[7]。全桂静等利用平板菌落法，从腐烂的南果梨样品中分离筛选得到果胶酶高产菌株As2，果胶酶活性达到6 635U/g干曲[8]。Albert等人利用不同真菌之间的协同效应将Aspergillus niger和Fusarium moniliforme进行混合培养，产生的果胶酶的活性可以达到1，041.6units/g dry weight)，是单独培养Aspergillus nige r的1.7倍[9]。
试验采用平板分离法，从腐烂的水果（苹果、梨、枣、甜瓜、籽瓜）中进行高产果胶酶菌株的筛选。同时，通过单因素试验和正交试验对菌株的培养条件进行了优化，旨在为降低企业生产成本，实现果胶酶的国产化提供一定的技术支撑。
1 材料与方法
1.1材料
苹果、梨、枣、甜瓜、籽瓜：市售。
1.2试剂
果胶（美国sigma公司），硝酸铵，硫酸钠，硫酸镁，氯化钾，硫酸铁，磷酸氢二钾，硝酸钠，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，硫代硫酸钠，碘，碘化钾，可溶性淀粉，硫酸铵，马铃薯，蔗糖，葡萄糖等。
1.3仪器设备
微量移液器（Finnpipette，上海雷勃分析仪器有限公司），摇床（SHA-C，金坛市恒丰仪器厂），高压灭菌锅（YX-280B型，上海绿宇精密仪器制造有限公司），电磁炉，水浴锅，烧杯，试管，培养皿，接种针，碘量瓶，酸式滴定管等。1.4试验方法
1.4.1技术路线
采样→富集培养→初筛→复筛→培养条件优化
1.4.2菌种分离
1.4.
2.1 培养基配方
富集培养基：果胶2%，硝酸铵0.2%，硫酸钠0.05%。
选择培养基：果胶0.1%，蔗糖2.0%，硫酸镁0.05%，氯化钾0.05%，硫酸铁0.001%，磷酸氢二钾0.1%，硝酸钠0.3%。
菌种保藏培养基：PDA培养基
液体培养基：橘皮粉4 g，硫酸铵2g，三水磷酸氢二钾0.3g，氯化钾0.6 g，七水硫酸镁0.55g。
1.4.
2.2 筛选
参考张浩森（2008）方法[10]，进行产果胶酶菌株的筛选：
（1）增殖培养：取采集的果园土及果蔬的腐烂部分少量，放入500mL装有增殖培养基的三角瓶中，于30℃、180 rpm条件下摇床培养3天，得增殖培养液。
（2）菌株的初筛：取增殖培养液，采用稀释涂布法涂布于选择培养基平板上，30℃培养3天，加质量分数为1%十六烷基三甲基溴化铵(多糖沉淀剂)，静止10min，菌落周围出现透明圈的为产果胶酶的菌株。
（3）菌株的复筛：挑取Dp/Dc较大的几个菌落，划线接种于选择培养基上于37℃条件下培养3d，测定粗酶液酶活。
1.4.
2.3酶活测定
参考孙越（1997）、陈静（1999）方法[11,12]，进行酶活测定：
（1）酶液制备：将发酵液于4℃，8000r/min离心10min后取上清液作为粗酶液。
（2）1%果胶溶液配制：取果胶粉1g，加热溶解，煮沸，冷却后过滤，调节pH值至3.5，定容至100mL。
（3）酶活测定：取两个100mL三角瓶，一个为酶液瓶(A瓶)，一个为空白瓶(B瓶)，并分别在A瓶、B瓶中各加入10mL的1%果胶溶液，A瓶加5mL重蒸馏水和5mL酶液后调整pH值至3.5，B瓶中加10mL重蒸馏水，40℃水浴，准确计时1h，立即加热煮沸使酶失活，冷却至室温。取上述A瓶、B瓶中溶液各5mL，分别加入另外两个三角瓶A1、B1瓶中，然后各加1mL浓度为1mol/L
的碳酸钠溶液摇匀，再各加5mL浓度为0.05mol/L碘-碘化钾溶液于两个三角瓶中，摇匀，加塞，放置20min，再分别吸取2mL浓度为1mol/L硫酸加入上述两个三角瓶，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时停止滴定，加入1mL浓度为0.5%的淀粉指示剂，此时溶液呈兰色，继续滴定至兰色消失为止，记下消耗的硫代硫酸钠体积：A1瓶为AmL，B1瓶为BmL。
（4）数据处理：在上述条件下，将每小时酶促催化果胶分解成1mg游离的半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活性单位，具体计算公式如下；
活性单位数/毫升酶液=[(B-A)×M×0.51×20]/(5×1×5)
式中：B—空白消耗硫代硫酸钠溶液体积(mL) A—试样消耗硫代硫酸钠溶液体积(mL) M—硫代硫酸钠摩尔浓度0.51—1摩尔硫代硫酸钠相当于0.51g游离半乳糖醛酸20—反应液体积(mL) 5—吸取反应液体积(mL) 1—反应时间(h) 1.4.3菌株培养条件的研究
1.4.3.1 单因素试验
（1）葡萄糖对菌株产果胶酶的影响
分别以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%葡萄糖添加量作为发酵培养基中的碳源进行产酶试验, 同时测定酶活，以确定发酵碳源最适添加量。
（2）蛋白胨对菌株产果胶酶的影响
分别以0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%蛋白胨添加量作为发酵培养基中的氮源进行产酶试验, 同时测定酶活，以确定发酵氮源最适添加量。
（3）发酵培养基中表面活性剂对菌株产果胶酶的影响
分别向发酵培养基中加入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%Tween-60表面活性剂，进行产酶试验，以确定发酵培养基中添加表面活性剂最适添加量。
（4）发酵培养基初始pH值对菌株产果胶酶的影响
调节发酵培养基的初始pH值分别为3.5、4、4.5、5、5.5，进行产酶试验。测定各个pH值下的菌株产酶能力。
（5）发酵温度对菌株产果胶酶的影响
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃对产酶菌株进行产酶试验，测定各个温度下的菌株产酶能力。
1.4.3.2正交试验
根据单因素试验结果，对碳源葡萄糖（A），氮源蛋白胨（B），表面活性剂
吐温-60（C），发酵培养基初始pH（D）和发酵温度（E）五个因素进行L16（45）正交试验，因素水平编码值如表2。以果胶酶活力为评价指标，确定菌株最佳的发酵培养条件，并进行验证试验。
表2 因素水平编码表
码值
因素
A(%) B(%) C(%) D E(℃)
1 1.9 0.6 0.04 4.4 47
2 1.7 0.5 0.0
3 4.2 45
3 1.5 0.
4 0.02 4.0 43
4 1.3 0.3 0.01 3.8 41 1.4.3.3 数据处理试验数据采用SPSS16.0进行处理
2结果与分析
2.1初筛结果
初筛结果透明圈大小及Dp/ Dc值见图1及表3。
图1初筛结果
表3 菌株透明圈Dp/ Dc值
菌株Dp(cm) Dc(cm) Dp/ Dc
A1 12.1 2.3 5.26
A2 9.6 4.4 2.18
A3 8.5 2.7 3.15
A4 4.3 2.5 1.72
A5 3.1 1.7 1.82
2.2复筛结果
对Dp/Dc值最大的三株菌株进行液体培养，测定其果胶酶活力。测定结果如表4。
表4 复筛酶活力比较
菌株酶活（u/mL）
A1 7692.1
A2 9632.5
A3 6543.5
2.3菌种形态观察
通过革兰氏染色在显微镜下观察到该菌株为革兰氏阴性短杆菌。
2.4单因素试验结果
2.4.1
图2葡萄糖添加量对菌株产酶能力的影响
由图2可知，随着葡萄糖含量的逐渐增加，菌株的产酶能力先急剧增强再缓慢下降，当碳源葡萄糖的浓度为1.5%时，菌株的产酶能力最高，达到7013 u/mL，因此可得，菌株的最佳碳源葡萄糖浓度为1.5%。
2.4.2氮源对菌株产酶能力的影响
由图3可知，随着蛋白胨添加量的逐渐增加，菌株的产酶能力表现为先上升后下降的变化，当氮源蛋白胨的浓度为0.6%时，菌株的产酶能力最高，达到8791 u/mL，因此可得，菌株的最佳氮源蛋白胨的浓度为0.6%。
2.4.3表面活性剂对菌株产酶活性的影响
图4表面活性剂添加量对菌株产酶能力的影响
由图4可知，随着表面活性剂添加量的逐渐增加，菌株的产酶能力变化幅度不大，当表面活性剂的浓度为0.03%时，菌株的产酶能力出现峰值，达到9224 u/mL，因此选择菌株发酵的最佳表面活性剂添加量为0.03%。
2.4.4
由图5可知，随着pH值的逐渐升高，菌株的产酶能力表现为先升高再降低趋势。当pH值为4.0时，菌株的产酶能力达到最大值为8653 u/mL，随着pH值的进一步升高，菌株的产酶能力逐渐下降。这主要是因为pH值的改变首先导致培养基的成分发生变化，不利于菌株的利用，另外是由于pH值升高超出了产物酶的最适pH值范围，致使测定结果偏低。
2.4.5发酵温度对菌株产果胶酶的影响
由图6可知，随着温度的逐渐升高，菌株的产酶能力表现为先升高再降低的变化。当温度为45℃时，产酶能力达到最大值为9865 u/mL，随着温度的继续升高，菌株的产酶能力表现为下降。
2.5正交试验结果
由表5可知影响菌株产酶性能的主次因子依次为D>C>E >A>B，即发酵培养基初始pH>表面活性剂吐温-60>发酵温度>碳源葡萄糖>氮源蛋白胨。选取最佳组合为：A3B1C4D4E3，即葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐温-60添加量0.01%，发酵培养基初始pH值3.8，发酵温度43℃。在此条件下菌株的产酶能力可以达到10758 u/·mL。
表5 正交试验结果
处理
（u/·mL）
A B C D E
1 1 1 1 1 1 5888.3
2 1 2 2 2 2 3031.6
3 1 3 3 3 3 10040.3
4 1 4 4 4 4 3206.5
5 2 1 2 3 4 5771.7
6 2 2 1 4 3 6354.7
7 2 3 4 1 2 4547.4
8 2 4 3 2 1 6471.3
9 3 1 3 4 2 1399.2
10 3 2 4 3 1 10552.3
11 3 3 1 2 4 2506.9
12 3 4 2 1 3 6762.8
13 4 1 4 2 3 5013.8
14 4 2 3 1 4 10463.3
15 4 3 2 4 1 3381.4
16 4 4 1 3 2 6063.2
K1 5541.675 7600.475 5203.275 3585.450 6373.325
K2 5786.275 4518.250 4736.875 4255.900 3760.350
K3 6320.425 5119.000 5830.000 6915.450 7042.900
K4 5305.300 3082.225 7093.525 8106.875 5487.100
3 结论
3.1由腐烂的大枣中筛选出的菌株初步鉴定为革兰氏阴性短杆菌。
3.2由单因素试验得出菌株的最佳碳源为1.5%葡萄糖，最佳氮源为0.6%蛋白胨，最佳表面活性剂为0.03%吐温-60，发酵培养基初始pH
4.0，发酵温度45℃。
3.3由正交试验得出菌株的最适发酵条件为：葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐温-60添加量0.01%，发酵培养基初始pH值3.8，发酵温度43℃。在此条件下菌株的产酶能力可以达到10758 u/·mL。
参考文献
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[5]赵允麟,赵莉.黑曲霉复合酶的调节与控制[M].工业微生物,2001.9,31(3):19-22
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Screening of Strain Producing Pectinase
Gong Yali
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, 05 Class
of Food Science and Engineering)
Abstract：Strain（G-）producing pectinase highly was screened through plate method from rotten fruit including apple, pear, Jujube, seed watermelon. Single factor test and L16(45) design were used to optimize the liquid submerged fermentation condition. The result showed that, carbon source concentration of fermentation 1.5%, nitrogen concentration 0.6%, surfactant concentration 0.01%;intial pH of fermentation 4.0 and fermentation temperature 40℃. The production under this condition can reach 10758 u/·mL.
Key words: Pectinase, Screening, Optimizing of fermentation condition
致谢
本论文是在韩舜愈老师、祝霞老师、王媛师姐的悉心指导下完成的。他们从论文的选题到论文的审阅和定稿都付出了大量的心血。导师在科学探索中所表现出的敏锐洞察力和严谨的治学态度以及一丝不苟的敬业精神，给我留下深刻印象，在此特向导师致以深深的敬意和诚挚的感谢。
试验过程中还得到了刁望强等同学的亲切指导和热心帮助，在这里一并向四年来所有帮助与关心支持过我的老师和同学们表示衷心的感谢。
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二〇一〇年九月二十日
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毕业论文的基本教学要求是：
1、培养学生综合运用、巩固与扩展所学的基础理论和专业知识，培养学生独立分析、解决实际问题能力、培养学生处理数据和信息的能力。
2、培养学生正确的理论联系实际的工作作风，严肃认真的科学态度。
3、培养学生进行社会调查研究；文献资料收集、阅读和整理、使用；提出论点、综合论证、总结写作等基本技能。
毕业论文是毕业生总结性的独立作业，是学生运用在校学习的基本知识和基础理论，去分析、解决一两个实际问题的实践锻炼过程，也是学生在校学习期间学习成果的综合性总结，是整个教学活动中不可缺少的重要环节。撰写毕业论文对于培养学生初步的科学研究能力，提高其综合运用所学知识分析问题、解决问题能力有着重要意义。毕业论文在进行编写的过程中，需要经过开题报告、论文编写、论文上交评定、论文答辩以及论文评分五个过程，其中开题报告是论文进行的最重要的一个过程，也是论文能否进行的一个重要指标。
撰写意义：1.撰写毕业论文是检验学生在校学习成果的重要措施，也是提高教学质量的重要环节。大学生在毕业前都必须完成毕业
论文的撰写任务。申请学位必须提交相应的学位论文，经答辩通过后，方可取得学位。可以这么说，毕业论文是结束大学学习生活走向社会的一个中介和桥梁。毕业论文是大学生才华的第一次显露，是向祖国和人民所交的一份有份量的答卷，是投身社会主义现代化建设事业的报到书。一篇毕业论文虽然不能全面地反映出一个人的才华，也不一定能对社会直接带来巨大的效益，对专业产生开拓性的影响。但是，实践证明，撰写毕业论文是提高教学质量的重要环节，是保证出好人才的重要措施。
2.通过撰写毕业论文，提高写作水平是干部队伍“四化”建设的需要。党中央要求，为了适应现代化建设的需要，领导班子成员应当逐步实现“革命化、年轻化、知识化、专业化”。这个“四化”的要求，也包含了对干部写作能力和写作水平的要求。
3.提高大学生的写作水平是社会主义物质文明和精神文明建设的需要。在新的历史时期，无论是提高全族的科学文化水平，掌握现代科技知识和科学管理方法，还是培养社会主义新人，都要求我们的干部具有较高的写作能力。在经济建设中，作为领导人员和机关的办事人员，要写指示、通知、总结、调查报告等应用文；要写说明书、广告、解说词等说明文；还要写科学论文、经济评论等议论文。在当今信息社会中，信息对于加快经济发展速度，取得良好的经济效益发挥着愈来愈大的作用。写作是以语言文字为信号，是传达信息的方式。信息的来源、信息的收集、信息的储存、整理、传播等等都离不开写作。
论文种类：毕业论文是学术论文的一种形式，为了进一步探讨和掌握毕业论文的写作规律和特点，需要对毕业论文进行分类。由于毕业论文本身的内容和性质不同，研究领域、对象、方法、表现方式不同，因此，毕业论文就有不同的分类方法。
按内容性质和研究方法的不同可以把毕业论文分为理论性论文、实验性论文、描述性论文和设计性论文。后三种论文主要是理工科大学生可以选择的论文形式，这里不作介绍。文科大学生一般写的是理论性论文。理论性论文具体又可分成两种：一种是以纯粹的抽象理论为研究对象，研究方法是严密的理论推导和数学运算，有的也涉及实验与观测，用以验证论点的正确性。另一种是以对客观事物和现象的调查、考察所得观测资料以及有关文献资料数据为研究对象，研究方法是对有关资料进行分析、综合、概括、抽象，通过归纳、演绎、类比，提出某种新的理论和新的见解。
按议论的性质不同可以把毕业论文分为立论文和驳论文。立论性的毕业论文是指从正面阐述论证自己的观点和主张。一篇论文侧重于以立论为主，就属于立论性论文。立论文要求论点鲜明，论据充分，论证严密，以理和事实服人。驳论性毕业论文是指通过反驳别人的论点来树立自己的论点和主张。如果毕业论文侧重于以驳论为主，批驳某些错误的观点、见解、理论，就属于驳论性毕业论文。驳论文除按立论文对论点、论据、论证的要求以外，还要求针锋相对，据理力争。按研究问题的大小不同可以把毕业论文分为宏观论文和微观论文。凡届国家全局性、带有普遍性并对局部工作有一定指导意义的论文，称