酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌，外源蛋白的展示主要是借助于GPI锚的作用，GPI锚定蛋白的C端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成，前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上，其余蛋白则位于内质网腔中。在极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶的作用下ω位点裂开同时被GPI锚置换，并被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被切除，细胞蛋白被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C从细胞膜上释放并以GPI锚定形式与葡聚糖共价相连被转运至细胞壁外。图1展示的是通过α-凝集素系统转运目的蛋白到细胞表面的分泌途径。酵母表面展示技术具有表达偏差小，展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多，筛选、纯化、活性测定方便等优点。
目前，最常见的酵母表面展示系统包括：凝集素展示表达和絮凝素展示表达[5]。如图2所示，α-凝集素展示表达系统(图2A)是将外源基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接后插入质粒载体的分泌信号肽(Secretion signal，SS)下游，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌，由于融合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号(GPIanchor attachment signal)的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁上，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面；a-凝集素展示系统(图2B)与α-凝集素展示系统不同的是其具有由二硫键连接的Aga1和Aga2两个亚基，目的蛋白通过与Aga2形成融合蛋白，再通过Aga1末端的GPI结构使目的蛋白表达于细胞表面；絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因(flo1p)与外源基因融合，并将融合蛋白展示表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统：GPI锚定系统(图2C)和絮凝结构域(Flo1p flocculation functional domain)锚定系统(图2D)。GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI结构锚定外源蛋白，此系统与α-凝集素展示相似；絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并通过非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。进而使外源蛋白表达于酵母细胞表面。
近年来，S.cerevisiae细胞表面展示技术迅速发展并在多个领域得到应用，展现出广阔的发展前景。可通过使外源蛋白固定化于S.cerevisiae细胞表面，从而生产微生物细胞表面蛋白，包括淀粉酶、纤维素酶等在生物乙醇生产中起关键作用的酶蛋白，从而使酵母表面展示技术在生物乙醇生产应用中不断发展与完善，本文着重介绍了近年来酵母细胞表面工程在生物乙醇菌种开发中的应用与研究进展。
1酵母细胞表面技术展示淀粉分解酶
以淀粉类生物质为主要成分的蔗糖和糖蜜可以实现大规模的乙醇生产，然而，以淀粉为原料生产生物乙醇要经历多步反应而且生产成本偏高。导致成本偏高的原因主要有两个：一是由于S.cerevisiae不能直接利用淀粉类物质，因此在发酵过程中需要额外添加大量的葡糖淀粉酶(Glucoamylase)和α-淀粉酶(α-Amylase)；二是为获得较高的乙醇产量，首先要将淀粉在140℃~180℃的高温下进行糊化，而这也就增加了能耗。为此，大量的研究集中尝试在S.cerevisiae细胞表面展示淀粉分解酶，从而实现以淀粉类物质为底物的大规模乙醇生产，并
取得了一定的成果。
利用细胞表面展示技术构建能利用淀粉的全细胞催化剂，可将编码淀粉酶的外源基因导入酵母细胞内使其能够分泌淀粉酶[7]。已经构建好的质粒pGA11带有编码米根霉Rhizopus oryzae的葡糖淀粉酶基因，转化子细胞能够在以1％可溶性淀粉为唯一碳源的培养基中迅速生长并产生乙醇，葡糖淀粉酶活力稳定至少100h，而且所表达的酶，其酶学性质与天然酶相当[8]。
Murai等[9]是研究细胞表面表达淀粉酶工作的先驱，他们创造性地通过在S.cerevisiae 细胞表面展示淀粉酶来开发重组酿酒酵母的研究策略，构建了带有S.cerevisiae MT8-1的GAPDH启动子及含有信号肽和glucoamylase/α-凝集素融合基因的载体，glucoamylase来自于R.oryzae，能有效切割淀粉α-1,4和α-1,6糖苷键。随后，Kondo[10]等在具絮凝功能特性的酵母细胞表面展示了葡糖淀粉酶，他们的工作表明，展示在细胞表面的葡糖淀粉酶对酵母的正常生长及乙醇产生无任何影响；厌氧发酵150h后乙醇浓度达到20~30g/L。但Kondo 等构建的展示葡糖淀粉酶的重组絮凝酵母在发酵300h的情况下还能保持较高的乙醇产率(0.6~0.7g/(L·h))[10]，同时，发酵培养基中低浓度的葡萄糖对减少污染也极为有利。展现了在S.cerevisiae细胞表面展示淀粉酶的优越性。
在批式补料发酵过程中，由于缺少溶解酶——α-淀粉酶，单一展示葡糖淀粉酶的酵母菌株在发酵过程中会有不溶性淀粉的积累。为克服这一问题，Shigechi等[11-14]构建了共展示来自R.oryzae的glucoamylase和来自嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的α-amylase基因，并以可溶性淀粉为底物，进行补料批式发酵。结果表明，将淀粉颗粒处理到与酵母细胞大小相近时可极大程度地提高乙醇产率，发酵100h后乙醇浓度达到60g/L，而且共展示葡糖淀粉酶和α-淀粉酶菌株的絮凝能力与只展示葡糖淀粉酶的菌株基本相同，发酵过程中酵母絮凝能力并不发生改变。在后续的研究中，Shigechi等[14]构建了含有葡糖淀粉酶结合结构域(SBD)突变子的酵母展示株系，结果发现，带有突变子SBD葡萄淀粉酶的菌株较野生型菌株的淀粉降解能力提高1.4倍。
Shigechi等[13]又利用低温糊化的淀粉(80)℃取代可溶性淀粉作为唯一碳源进行乙醇发酵，结果表明：共展示葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的菌株与单展示葡糖淀粉酶的菌株相比，乙醇产率明显增加，尤其是共展示菌能更快速地产生乙醇且无延滞期，说明随机水解淀粉α-1,4糖苷键的α-淀粉酶在淀粉水解过程中起关键作用。比较共展示两种淀粉酶的菌株在低温和高温糊化情况下的发酵效率，无论是最大乙醇浓度、乙醇产率还是底物消耗率，两种发酵系统都基本相同，乙醇产量为0.5g/g，相当于理论值的97.2％。更好地说明了共展示两种淀粉酶菌株的优势。
从牛链球菌Streptococcus bovis中分离的淀粉酶为生料淀粉的高效水解提供了新的研究思路[15]。Shigechi等[12]分别以α-凝集素和絮凝素为基础，共展示来自R.oryzae的葡糖淀粉酶和来自S.bovis148的α-淀粉酶，并以生料淀粉为底物进行发酵试验，结果表明α-淀粉酶活性依赖于锚定蛋白，而葡糖淀粉酶活性则独立于锚定蛋白；对于α-淀粉酶活性，以絮凝素系统为基础构建的菌株要比以凝集素为基础构建的菌株酶活性高40倍。目前已经报道了一些α-淀粉酶具有结合生料淀粉的能力，且降解淀粉的区域位于C-末端[16]。
以α-凝集素为基础的共展示菌能以生料淀粉为原料生产乙醇[17-19]。另一方面，基于
α-凝集素和絮凝素Flo1p共展示的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶在生料发酵过程中不需要额外添加淀粉酶，在发酵过程中，淀粉浓度迅速下降，72h乙醇浓度达到61.8g/L，乙醇产量为0.44g/L，相当于理论值的86.5％。
利用酵母细胞表面展示技术从最初的单展示葡糖淀粉酶到共展示葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，均取得了较好的成果，为利用淀粉类物质实现大规模乙醇生产提供了新的思路。不过随着生物乙醇生产技术的不断发展，人们开始着眼于利用木质纤维素生产燃料乙醇，从而避免了第一代生物乙醇存在的与人争粮的缺陷。
2酵母细胞表面技术与第二代生物乙醇
由于第一代生物乙醇的生产存在着与人争粮、与粮争地的缺陷，发展第二代生物燃料是人们面对能源、环境与粮食问题所采取的积极措施。利用丰富廉价的可再生木质纤维素生产乙醇，是规模化发展车用燃料乙醇的基础。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，占地球总生物量的40％左右，高效、廉价地利用木质纤维素转化为如燃料乙醇等化工产品，是由石油基向生物基经济社会过渡的基础。
为此大量的研究开始转向展示纤维素分解酶、木糖代谢酶等，从而实现新的突破与尝试，为实现第二代生物燃料的开发与利用提供了一定的理论依据。
2.1展示纤维素分解酶
在纤维素乙醇生产经历的糖化步骤形成葡萄糖的过程中，S.cerevisiae不能直接利用纤维素类物质，因此在S.cerevisiae中稳定表达纤维素酶是降低生产成本的有效方法。基于α-凝集素C端构建的pCMC11含有来自棘孢曲霉Aspergillusaculeatus的内切羧甲基纤维素酶CMCase)编码基因，Murai等[20]通过一系列方法证明了cmcase基因成功地锚定在细胞表面，内切羧甲基纤维素酶活性稳定至少120h。当pCMC11和含有β-bgl1的载体(pBG211)共表达时，可以快速地将纤维低聚糖转化为葡萄糖，从而显著地提高了利用纤维素的效率。目前已报道了很多在S.cerevisiae中表达多种纤维素酶基因和能够糖化可溶性纤维寡糖的重组酿酒酵母[21-22]。
Fujita等同样基于α-凝集素系统在S.cerevisiae细胞表面展示来自丝状真菌里氏木霉Trichoderma reesei的内切葡聚糖酶Ⅱ的融合蛋白，酵母菌株能明显提高对大麦β-葡聚糖的水解能力；随后，构建了共表达内切葡聚糖酶Ⅱ和来自A.aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ的酵母株系，这种酵母能在以大麦β-葡聚糖为唯一碳源的培养基上生长，在50h内将β-葡聚糖发酵生成乙醇，乙醇产量为0.48g/g，相当于理论值的93.3％，且发酵培养基中的β-葡聚糖能在酵母细胞表面连续水解为葡萄糖，在胞内酶的作用下，立即被利用，转变为乙醇。同时，酵母细胞的酶活测定结果和流式细胞计数分析结果表明：共展示菌中内切葡聚糖酶Ⅱ和β-葡糖苷酶Ⅰ分子的数量大于单展示菌中内切葡聚糖酶Ⅱ或β-葡糖苷酶Ⅰ分子数的总和[23]。其后，Fujita研究小组[24]将来自T.reesei的纤维二糖水解酶Ⅱ也增加到展示系统中，从而使酵母细胞真正具有水解无定形纤维素能力，同步糖化发酵生成乙醇，结果显示共展示内切葡聚糖酶Ⅱ和纤维二糖水解酶Ⅱ的菌株比只展示内切葡聚糖酶Ⅱ的菌株对无定形纤维素的水解能力高，且主要产物是纤维二糖，单展示纤维二糖水解酶Ⅱ的菌株主要产物是少量的纤维二糖，单展示内切葡聚糖酶Ⅱ的菌株主要产物是纤维二糖、纤维三糖，而共展示β-葡糖苷酶
Ⅰ和内切葡聚糖酶Ⅱ的菌株无乙醇产生。
在以葡萄糖为碳源的培养基里，虽然在40h内所有无定形纤维素不能被完全利用，但其发酵能力也达到10g/L纤维素可产生3g/L的酒精。即每克碳水化合物可产0.45g/g酒精，相当于理论值的88.5％，可他们并没有报道在纤维素为唯一碳源的条件下该酵母的发酵能力。Shuhei等[25]以共展示三种纤维素酶的重组酵母(内切葡聚糖酶Ⅱ、纤维二糖水解酶Ⅱ、β-葡糖苷酶Ⅰ)和共展示两种纤维素酶的菌株(内切葡聚糖酶Ⅱ和纤维二糖水解酶Ⅱ)的发酵效果进行比较，结果表明前者的乙醇产量明显优于后者。
姚淑敏等[26]也成功地将来自裂殖酵母的β-葡糖苷酶Ⅰ以其活性形式展示在S.cerevisiae细胞表面，诱导表达后的β-葡糖苷酶Ⅰ酶活测定显示，重组酵母菌株诱导培养12h后有酶活，到48h酶活达到最高，最适作用的pH为7.0，最适作用温度为45℃。
目前，利用酵母细胞表面技术展示纤维素酶，无论单展示还是共展示，均取得了一定的进展，虽然现阶段局限于实验室阶段，但相比较而言，在底物利用上已经取得了一定的突破。
2.2展示木糖代谢途径关键酶
S.cerevisiae是传统的乙醇发酵生产菌株，由于没有专一性转化木糖为木酮糖的酶系，不能很好地利用木糖。其中木糖的跨膜运输被认为是工程菌利用木糖的障碍之一。S.cerevisiae 没有专一性木糖转运蛋白，木糖运输是由非专一性的已糖转运蛋白完成，而此类蛋白对于木糖的亲和力远低于葡萄糖[27]。目前也有部分研究集中于展示木糖代谢途径的关键酶，以填补S.cerevisiae不能利用木糖的缺陷，更好地利用底物生产燃料乙醇，提高底物利用率。Satoshi Katahira等[28]将来自T.reesei的木聚糖酶和米曲霉Aspergillusoryzae的β-木糖苷酶成功地展示在S.cerevisiae细胞表面，改变了S.cerevisiae的代谢途径，实现了酵母直接发酵来源于白桦木的木聚糖生产乙醇的工艺。结果表明这两个酶缺一不可，只有在两者同时存在的情况下才能将木聚糖转化为木糖。因为S.cerevisiae不能直接利用木糖生产酒精，所以要向S.cerevisiae导入来自毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以及S.cerevisiae本身的木酮糖激酶，它们共同作用再将木糖转化成木酮糖-5磷酸，从而使S.cerevisiae能利用木糖；该重组酵母经62h发酵后产生酒精浓度为7.1g/L，表明每克碳水化合物可产0.30g酒精，是理论值的58％。虽然该重组酵母产酒精能力明显不足，但该实验为今后开发利用半纤维素指出了一条出路。
侯进等[29]基于α-凝集素系统，将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因xylA，插入到S.cerevisiae蔗糖酶信号肽序列与α-凝集素的C端编码序列之间，形成融合表达框，构建重组质粒pSY-xy222，转化S.cerevisiaeH158。含重组质粒的菌株H158-SXI木糖异构酶活性测定表明，细胞壁上酶活测定值为1.53U，木糖异构酶在S.cerevisiae细胞壁上得到活性表达。木糖葡萄糖共发酵结果显示，重组菌株木糖利用率较出发菌株提高了17.8％。陈璐菲等[30]利用S.cerevisiae表面展示系统，将来源于C.tropicalis的木糖还原酶基因xyll嵌入带有His-Tag的S.cerevisiaea-凝集素展示载体pICAS-His，构建重组质粒pICASHis-Ctxyll，并转化宿主菌S.cerevisiaeMT8-l，通过流式细胞仪快速检测和筛选，得到重组菌株MT8-1/pICAS-His-Ctxyll。将重组酵母用于葡萄糖(15g/L)和木糖(5g/L)的混合糖发酵实验。
结果表明，重组酵母MT8-1/pICAS-His-Ctxyll细胞具有良好的生长和产酶特性，同时能转化木糖产生木糖醇，将2.5g/L木糖转化生成2.5g/L木糖醇，转化率达98.7％。
通过展示木糖代谢途径关键酶的重组酿酒酵母在发酵木糖生产乙醇的过程中，木糖异构酶虽有一定的活性表达，但利用木糖产乙醇的木糖利用率并没有太大的改善，虽然此部分研究工作依旧面临着很多的问题与挑战，但这些工作为解决S.cerevisiae代谢工程菌株的木糖利用问题做出了新的研究与尝试。
2.3基于展示技术的纤维素乙醇统合加工
为了降低生产成本，可以将纤维素糖化和发酵等几步反应过程合并在一步反应里完成，即统合生物加工(CBP)。CBP要求某种“超级”微生物具有既能水解纤维素又能利用水解纤维素产生的糖类发酵产酒精，可自然界中没有哪个已知微生物能满足CBP这样的要求。改造现有微生物也就成为唯一的选择[31]。在S.cerevisiae细胞表面分别表达T.reesei的两种编码纤维二糖水解酶：纤维二糖水解酶Ⅰ和纤维二糖水解酶Ⅱ的纤维素结合结构域(CBD)基因，同时也构建了两个串联排列的CBDI和CBDⅡ融合基因，在细胞表面表达两种CBD。表达CBDⅠ和CBDⅡ的两种酵母展示细胞的CBD具有相似的结合纤维素的能力，而表达CBDⅠ和CBDⅡ融合蛋白的酵母细胞比单表达CBD的酵母细胞具有更强的纤维素结合力。展示酵母细胞的结合率主要依赖于展示在细胞表面的CBD分子多少。有CBD和突变CBD酵母展示细胞可用于分析CBD与纤维素的结合机制。而构建共展示CBD和靶酶的酵母细胞，将可以实现在纤维素滤器上构建连续的或多步酶反应的生物反应器系统。
纤维小体是近年来研究的较热门的一个话题，根据细胞表面展示技术把纤维小体展示在产酒精微生物表面，在纤维素乙醇的生物转化中具有重要的价值，纤维小体实际上是一个微型而高效的纤维素降解机器。现在已经有学者提出了通过人工设计并通过工程手段改造天然纤维小体的新思路[32]。Tsai研究小组[33]利用来自厌氧菌的纤维素酶构建了迷你纤维小体并重组到酵母细胞中。他们首先选择热纤梭菌Clostridium thermocellum的内切葡聚糖酶和解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶构建迷你纤维小体，这个纤维小体仍有水解纤维素的协调能力。而一旦将C.cellulolyticum的内切葡聚糖酶换成β-葡糖苷酶，就可使新的纤维小体具有了纤维素酶的三大酶组分，其水解纤维素能力不但得到提高而且还能发酵产酒精。在以无定形纤维素(PASC)为唯一碳源的培养基里，该酵母发酵能力为每10g/L的PASC可产生3.5g/L的酒精。即每克碳水化合物可产0.49g酒精，相当于理论值的95％。而同样是以PASC为唯一碳源，Den Haan研究小组[34]因没有采用纤维小体形式改造酵母，其效果大打折扣。Den Haan等尝试将来自T.reesei的egl1和扣囊复膜孢酵母Saccharomycopsis flbuligera的bgl1整合到S.cerevisiae中表达。虽然都检测到有酶活并能利用PASC发酵生产酒精，但其发酵酒精的浓度只为1g/L。从这两个小组的实验结果可以明显看出纤维小体的优势。
开发应用这种集纤维素水解和发酵于一身的共展示酵母株系，对发酵工业的发展具有重要的意义。这些实验证明了利用共展示纤维素降解酶的S.cerevisiae发酵生产乙醇的高效性和同步糖化发酵法的可行性。表1中列出了部分研究中已构建的共展示纤维素酶的菌株或质粒。
本实验室一直致力于纤维素乙醇生产菌种的构建，并且已经成功地构建了基于专利菌株S.cerevisiae Y5的共代谢葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母[36]。在以往的研究中，利用野生型工业菌株S.cerevisiae进行纤维素降解酶的展示研究还未见报道。在前期的工作中，本实验室利用了野生型二倍体工业菌株S.cerevisiae Y5，基于a-凝集素构建了一个能够有效地接受外源基因，并可以在宿主细胞表面特异性表达的展示系统，并成功展示了来自A.aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ，该展示菌株能够在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长，首次实现了野生型二倍体菌株为宿主的纤维素酶展示。在今后的研究工作中，我们将来自丝状真菌与纤维素降解有关的酶类展示在酵母表面，并尝试在野生型二倍体工业菌株中实现多种纤维素酶的展示，以期进一步阐述纤维素的作用机理。实现细胞的自我固定化，并研究以纤维素为唯一碳源的底物利用情况，对比展示前后酶的活性变化，通过消除或减少添加纤维素酶才能完成的糖化步骤，努力实现全细胞催化纤维素乙醇的生物转化过程，以期大大地降低生物乙醇的生产成本。
3展望
利用S.cerevisiae细胞表面技术展示纤维素降解酶的研究已取得一定的研究成果，该系统已经得到成功开发，但是在这一领域里仍有许多亟待解决的问题，例如：展示在细胞表面的纤维素酶的活性与游离酶相比有所下降；成功展示的纤维素酶稳定性有待提高；对于该技术的研究目前仅停留在实验室阶段，还未实现工业化等。今后，此领域的研究还需更多的发展和完善，包括开发更多的具固定化展示功能的细胞壁甘露糖蛋白；进一步提高现有展示的纤维素酶的稳定性、表达量及活性；建立更多的展示酶筛选技术；克服生产中扩大培养、乙醇抑制等难题。相信随着分子生物学和生物技术的飞速发展，该领域必将取得更大的进步，以酵母细胞表面展示系统为基础的纤维素乙醇工业将更大程度地服务于人类社会。
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会 这个 是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由
于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以 的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微
镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等 有 的 余的 （起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
毕赤酵母表达系统步骤 （参考Invitrogen公司说明书）： 一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存 1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2挑取转化子，甘油保存。 二、载体构建 1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。 2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3载体测序 测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、线性化DNA 1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒43μl CIAP Buffer 5μl
CIAP酶2μl 四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱； 五、感受态细胞的制备 实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯； 1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d； 250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5； 41500g，4℃离心5min收集菌体； 540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀； 61500g，4℃,5min； 730ml无菌水重悬； 81500g，4℃,5min； 910ml 1M 山梨醇重悬； 101500g，4℃,5min； 11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)； 六、电击转化 15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移
Pichia酵母表达系统使用心得 摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System
产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统 （1）特点 自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲
酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌，外源蛋白的展示主要是借助于GPI锚的作用，GPI锚定蛋白的C端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成，前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上，其余蛋白则位于内质网腔中。在极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶的作用下ω位点裂开同时被GPI锚置换，并被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被切除，细胞蛋白被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C从细胞膜上释放并以GPI锚定形式与葡聚糖共价相连被转运至细胞壁外。图1展示的是通过α-凝集素系统转运目的蛋白到细胞表面的分泌途径。酵母表面展示技术具有表达偏差小，展示的融合蛋白相对分子质量范围大，分子数量多，筛选、纯化、活性测定方便等优点。 目前，最常见的酵母表面展示系统包括：凝集素展示表达和絮凝素展示表达[5]。如图2所示，α-凝集素展示表达系统(图2A)是将外源基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接后插入质粒载体的分泌信号肽(Secretion signal，SS)下游，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌，由于融合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号(GPIanchor attachment signal)的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁上，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面；a-凝集素展示系统(图2B)与α-凝集素展示系统不同的是其具有由二硫键连接的Aga1和Aga2两个亚基，目的蛋白通过与Aga2形成融合蛋白，再通过Aga1末端的GPI结构使目的蛋白表达于细胞表面；絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因(flo1p)与外源基因融合，并将融合蛋白展示表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统：GPI锚定
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换
CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望 2010-08-06 21:01:48 来源：本站原创评论：0点击： CHO细胞表达系统存在的问题及前景展望 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解。 与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
酵母表达系统的研究进展和前景 ( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院) 摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。 关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物 引言 酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。其中毕赤酵母（P. pastoris）是继S. cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。 与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。
昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；
Yeast Expression System Lihong Xu, PhD Technical support Invitrogen corporation Hotline:8008208181-2-2 Email:cntechsupport@https://www.doczj.com/doc/5315123543.html,
Invitrogen Protein Expression Systems -Prokaryotic: E. coli -Cell-free (and Lumio technology) -Yeast: Pichia Pastoris -Insect: Baculovirus -Mammalian -Mammalian Viral
Expression hosts and their applications
酵母表达系统的优缺点
Invitrogen ’s Yeast Expression Systems ?Bioproduction ?Industrial ?Not as well known as P. pastoris ?High-level expression ?Amenable to large-scale bioproduction ?Licensing for industrial is less restrictive Pichia methanolica ?E. coli user who wants to move to a eukaryote ?Expression not as high as Pichia ?Typically uses nutritional markers rather than antibiotics ?Very commonly used –mostly for genetic studies ?Good alternative to E. coli if eukaryote needed ?Variety of vectors available Sacchromyces cerevisiae ?Need lots of protein ?Bioproduction ?Requires license by industrial ?High-level expression ?Amenable to large-scale bioproduction ?Thousands of publications about the system ?Wide range of products Pichia pastoris Customer ’s needs Disadvantage Advantage System
一、菌种 1.大肠杆菌 一种克隆感受态（JM109，DH5α，TG1，TOP10） 2.毕赤酵母菌. GS115,甲醇利用正表型(Mu+)。培养基含有甲醇时，菌正常生长，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子中，Mu+和Muts两种表型都有，需要在MM 和MD培养基上鉴定表型，转化整合效率高。 KM71H, 甲醇利用慢表型(Muts)。培养基含有甲醇时，菌生长比野生株缓慢，组表达载体转化KM71H后，长出的转化子中，都是Muts表型，不需Mu表型鉴定。 SMD1168(Mu+)，蛋白酶缺陷型宿主菌，降低了目的蛋白被蛋白水解酶降解的风险。 二、毕赤酵母菌分泌表达载体 诱导型启动子：pPIC9K，采用α因子信号序列，含卡那抗性基因，可用遗传霉 素筛选外源基因多拷贝转化子。（无标签） pPICZαA，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多 拷贝转化子。（有标签） 组成型启动子：pGAPZα，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易 于筛选阳性多拷贝转化子。（有标签） 另外，大肠杆菌表达载体pCold也可以进行诱导分泌表达蛋白。 三、实验试剂 限制性内切酶EcoRI，NotI，NcoI，Sac I，T4DNA连接酶，Takara公司 G418（遗传霉素），葡萄糖，生物素，甲醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203， 酵母氮源(YNB)，含His的补充培养基， 酵母基因组DNA纯化试剂盒，大肠杆菌质粒提取试剂盒，0.2μm无菌滤膜。 四、实验简要计划 用软件对pET28a-重组人胰岛素质粒进行EcoRI，NotI，NcoI酶切位点分析发现，NotI 在NcoI位点的上游，并且都是单酶切位点。所以可以通过EcoRI和NotI对重组大肠杆菌质粒双酶切获取目的基因，这对目的基因的阅读框无影响。 通过EcoRI和NotI对酵母表达载体双酶切，可以获得载体片段。将获得的载体片段与目的基因用T4 DNA连接酶4摄氏度连接过夜，并转化到大肠杆菌克隆感受态中，在抗生素培养基
甲醇酵母表达系统 甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种，其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛［1］。与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。 编辑本段外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达 目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍［2］。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍［3］。椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L［9］。 编辑本段实现外源蛋白质高效产生的关键因素 表达载体 首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%［2］，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高［14］。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。? 编辑本段应用前景 经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。
Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步： 抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS 115、X- 33、KM71和SMD1168的区别 GS 115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS 115、KM 71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可
酵母表达系统 基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。 1、酵母表达系统的特点 酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。 应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3. 0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。 2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统) （1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(a utomaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for mul tiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到1