课程设计说明书
课程名称：发酵工程
设计题目：大肠杆菌的高密度发酵
院系：生物与食品工程学院
学生姓名：******
学号：201006030051
专业班级：10生物工程（2）班
指导教师：*****
课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵
学生姓名所在院系生物与食品工
程学院
专业、年级、班10生物工程
设计要求：
1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。
2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。
3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、设计标准要求规范、实用、切合实际。
5、设计应严格按有关设计规范进行。
6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：
1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。
2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。
3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实
验法验证。
4、给出检验规则。
5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。
参考文献阅读：[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251
[2] 刘子宇，李平兰，郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业，2005，12:47~51
[3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991，2: 380~384
工作计划：
2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务，查阅相关文献。
2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料，进行产品标准的应用设计。
2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容，完成课程设计报告。
任务下达日期：2013年5月27日
任务完成日期：2013年6月9日
指导教师（签名）：学生（签名）：
大肠杆菌的高密度
摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值
目录
1.设计背景 (1)
1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)
1.2高密度发酵定义 (1)
1.3 规定标准 (1)
2.设计方案 (2)
3.方案实施 (3)
3.1 大肠杆菌简介 (3)
3.2 菌种选材 (3)
3.3 种子扩大培养 (3)
3.4 发酵培养基配比 (3)
3.5 发酵过程 (4)
4.结果与结论 (7)
5.收获与致谢 (9)
6.参考文献 (10)
1.设计背景
1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状
目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义
高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。根据硒计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Makel等认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 um，宽1um的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。
1.3 规定标准
我国质量标准规定，根据大肠杆菌的高密度发酵，发酵罐中生物量达到150—200g/l。根据这一标准，制定出整个试验生产计划。
微生物的发酵方式主要有分批、连续和补料分批3种。在本次大肠杆菌发酵中，我们采用补料分批培养。
分批补料发酵定义：补料分批发酵以分批发酵为基础，是介于分批发酵与连续发酵之间的一种发酵技术。在分批发酵培养开始，投入较低的浓度底物，当微生物开始消耗底物后，间歇或连续地补加新鲜培养基，而不从发酵罐中放出培养液的一种发酵方式。
这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式，能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象，另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。
在此过程中，我们使用50L发酵罐采用分批补料方式对大肠杆菌进行培养。实时监测培养过程中的溶氧，PH以及温度等发酵参数，每隔两小时取料测定料液OD值，氨基氮，还原糖等数据。直至大肠杆菌停止生长。
3.1 大肠杆菌简介
在自然界分布很广，是人和动物肠道中的正常菌群。正常情况下一般不致病，但它是条件致病菌。大肠杆菌是单细胞原核生物，具有原核生物的主要特征：细胞核为拟核，无核膜，细胞质中缺乏象高等动植物细胞中的线粒体、叶绿体等具膜结构的细胞器，核糖体为70S，以二分分裂繁殖。其大小为：0.5～0.8μm×1.0～3.0μm。周身鞭毛，能运动，具致育因子的菌株还具性菌毛。其代谢类型是异养兼性厌氧型。
3.2 菌种选材
实验室保存大肠杆菌菌种
3.3 种子扩大培养
培养基：LB培养基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl10，PH7.0
液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 的无菌种子培养基的液体试管中，摇匀，置于37℃培养箱24h。
三角瓶扩大培养：将上述培养好的液体试管种子接种入250ml含有灭过菌的100ml 培养基的三角瓶中，37℃培养箱中18h。
摇瓶培养：按照1%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃ 200r/min振荡培养
3.4 发酵培养基配比
培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏11.5，蛋白胨19.5，(NH4)2SO4 4、K2HPO4 18、MgS04 1.2（单独灭菌），微量元素液1mL。。
流加培养基I(g/L)：葡萄糖600,7水硫酸镁10。
ph调节剂：0.5mol/L氨水
3.5 发酵过程
将已调配好的新鲜培养基注入发酵罐中，设定温度121℃，时间25 min，对发酵罐，培养基，葡葡糖溶液氨液和消泡剂进行同时灭菌操作。
如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。
开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,直到冷却到发酵温度37 ℃。
利用硅皮管将25 g/100ml葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。
在发酵过程中，通气量控制在4L/min，搅拌转数为400rpm。向发酵罐中接种之前已经扩大培养的菌种。
开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖流加混合液，使发酵罐内葡萄糖浓度达到25g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH为7.0，充入适量的消泡剂。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在30％左右。
每隔2h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度，并做记录。
取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。
当菌种停止繁殖时，菌种浓度不再增加，葡萄糖浓度不再改变时，停止发酵反应。
取发酵液样品，测定酵母菌浓度，还原糖，氨基氮，DO含量参数。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。
3.6 实验数据的测定
3.6．1斐林法测还原糖
试剂：①斐林试剂② 0.1%标准葡萄糖溶液
测定步骤：
①斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5Ml。置于250mL三角瓶中，加
入10mL水，并从滴定管中预先加入约24mL0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液1mL以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4～5秒每滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min
中内完成，总消耗量为V 0 mL。
②定糖：
预备试验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5mL，置于250mL三角瓶中，加入V 1 毫升试样稀释液（含葡萄糖量为 5 ～ 15 毫升）及适量多0 .1% 标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作。总耗糖量为 V 2 毫升。
正式实验：吸取斐林试剂甲、乙液各 5 毫升，置于 250mL 三角瓶中，加入 V 1 毫升试样稀释液和（ V 2 － 1）毫升 0.1% 标准葡萄糖溶液，补加 [（V 0 +10 ）－（ V 1 +V 2 ）] 毫升水，摇匀，以下操作同标定时操作，总耗糖量为 V 毫升。
3.6.1.3计算
葡萄糖 =（ V 0 -V ）×C×n×1/V 1（ g/mL ）。
3.6.2氨基氮的测定
基本原理
氨基酸是有氨基与羧基得两性化合物，在溶液中以两性离子状态存在。如：R-CH--COO-+2HCHO
-NH3是弱酸，完全解离时pH在11-12之间或者更高，若用碱滴定- NH3释放出来的H+来测定氨基酸，一般指示剂的变色范围＜10，很难指示滴定终点。
但是用甲醛处理后，由于甲醛能与氨基结合使氨基上的氢离子游离，使溶液中的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色区域内（8.0-10.0）。因此可用酚酞作指示剂，用碱来滴定，从而计算氨基酸的含量。
试剂：1mol/l盐酸，0.1mol/l氢氧化钠标准溶液，0.5mol/l氢氧化钠标准溶液，12%中性甲醛，0.2%甲基红指示剂，1%酚酞指示剂。
仪器及器具：100ml三角瓶，10ml刻度吸管，25ml刻度吸管，碱式滴定管取发酵离心上清液2.5ml至100ml三角瓶中，加水50ml，甲基红指示剂2滴，1mol/l盐酸1-2滴，调节溶液至红色，静置5分钟，再用0.5mol/l的氢氧化钠标准溶液调节溶液至橙色（体积不计），使呈中性。加12%中性甲醛10ml(每次用之前用氢氧化钠溶液调至微红色，酚酞作为指示剂)，摇匀静置10min,加1%酚酞指示剂5滴，用0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定至微红色为终点。
计算：氨基氮（mg/100ml）=C×V×14.01×100/2.5
C:氢氧化钠滴定液浓度，mol/l
V：氢氧化钠滴定液消耗体积，ml
3.6.3 OD法测菌体密度
原理：OD表示被检测物吸收掉的光密度。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
实验步骤
首先对配好的培养基进行检测光密度，以此作为对照。
其次，用三支试管取10的样品液，分别用磷酸盐缓冲液稀释稀释不同的倍数，用wfj7200可见分光光度计在波长600nm下测定不同稀释不同稀释倍数的菌悬液以及对照样品的OD值。
计算:OD=㏒10(入射光/透射光）
4.结果与结论
表4.1大肠杆菌发酵液的OD值，氨基氮，还原糖数据
从整个实验过程中测得的实验数据可以观察到：氨基氮和还原糖的含量从开始略有上升到后来维持稳定。主要原因是大肠杆菌在繁殖中需要碳源转化为葡萄糖为其提供能量，将氮源转化为氨基酸为其提供合成自身产物的原料，随着菌体密度的不断增大，两者的含量也不断升高，知道菌体密度维持稳定后两者的含量才稳定下来。在测量OD数据时，第二次测得的数据具有失真现象，应当不予考虑，从实验数据的整体来看整个OD 值的走势还是符合大肠杆菌生长曲线的。大肠杆菌起初被接种在发酵罐内，由于对发酵罐内的生活环境还不适应，菌体的繁殖速率降低，代谢物产量几乎处于停滞阶段，此时期被定为适应期；接着菌体对整个生存环境有了适应，其数目呈现几何级数增长，代谢产物也在不断积累，此时期为对数期；处于稳定期的菌体其繁殖的菌体数与衰亡的细胞数达到动态平衡，菌体产量达到最高点，其次生代谢产物也在此时期进行积累；最终军中衰老，活的菌种数量逐渐下降。
5. 收获与致谢
首先，本次课程设计是在****老师精心指导下完成的。并且老师为我们组修改并制定了最佳课程设计的方案，每次我们有疑惑或者不是很懂的地方就会立即为我们讲解，让我们学到了很多的东西，并且也让我深深体会到只有动手去操作才能检验我们学到的东西。最终，我们历经坎坷终于完成了本次的实验，我想，若没有他的指导，我们也没有今日的成功。其次，我也非常感谢我组成员及其他同学的帮助，在我们的团结努力下，我们才能够顺利的完成了整个实验的筹备工作与发酵过程及最后的数据测定和分析。经过本次实验，我懂得了实践能很好的检验我们的理论知识学习的好与坏，并且团队合作也是非常重要的。
6. 参考文献
[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251
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[5] Markl H., zermeck C.，DubachA，et al. Gultivatiun of Escherichian coli to high cell denstities in
a dialysis reator. Appl Microbio Biotechnol，1993,，39: 48~52
[6] LeeS Y.，Chang H N.J. High cell-density culture of Escherichian coli. Environ Polymer Degrad，1994，2:169~174
[7] 李民，陈常庆.基因工程菌高密度发酵研究进展[J]，生物工程进展，2000，20(2): 26~31
[8] Jong Hyun Choi，Ki Chang Keum，Sang Yap Lee. Production of recombinant proteins by High cell density culture of Escherichia coli[J]. Chemical Engineering Science，2006，61:875~876
[9] 刘晓铭, 林玉. 基因工程菌发酵中pH 值对包涵体形成及目的蛋白表达的影响. 生物技术, 1998, 8(5): 16?18.
[10] 尹淑琴, 范艳, 常泓. 基因工程菌的高密度发酵研究. 安徽农业科学, 2007, 35(11): 3175?3176,3192.
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[12] 陈坚, 李寅, 毛英鹰, 等. 生物工程学报, 1998, 14(4) : 452~ 455.
[13] 杨汝燕, 李民, 陈常庆. 工业微生物, 1998, 28(3) : 30~ 33.
[14] 徐皓, 李民, 阮长庚, 等. 工业微生物, 1998, 28( 2) : 20~ 25.
[15] 刘社际, 葛永红, 杨立明. 中国生物制品学杂志, 1999, 12( 1) : 29~ 31.
[16] 李会成, 李文辉, 等. 生物工程进展, 1997, 17( 2) : 40~ 43.
指导教师评语：
课程设计报告成绩：，占总成绩比例：
课程设计其它环节成绩：
环节名称：，成绩：，占总成绩比例：
环节名称：，成绩：，占总成绩比例：
环节名称：，成绩：，占总成绩比例：
总成绩：
指导教师签字：
年月日本次课程设计负责人意见：
负责人签字：
年月日
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：郑帅超 学号：201106040030 专业班级：11 生物技术 指导教师：李安华 2014年5月26日
课程设计任务书 设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化 学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班11生物技术 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的帮助下完成题目设计。 2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。 3、学生在实验室完成实验方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288. [2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455. [3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275. [4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33. [5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275. [6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28. [7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25. [8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31. 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2014年5月13日 任务完成日期：2014年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：
大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生： 比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养： 在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度： 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。 常用的控制方法主要有： 恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度 大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细
大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
大肠杆菌发酵经验总结-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，p H偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当
大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长繁殖浅谈 摘要：本文以发酵乳作为基础，其中添加一定浓度的以大肠杆菌为典型菌的大肠菌群，用以研究大肠杆菌在发酵乳中的生长情况。 关键词：大肠杆菌发酵型酸牛奶生长情况 一引言： 发酵型酸牛奶大致可以分为三个品类：第一类是满足营养需求的基础酸奶；第二类是满足美味休闲的大果粒、谷物酸奶；第三类是健康功能酸奶，如通畅、免疫、儿童成长等。其中基础酸奶的市场规模占60%以上，果粒（谷物）酸奶和功能性酸奶的市场规模相对较低。 因大肠杆菌对产品存在着污染隐患，现阶段没有相关文献说明大肠杆菌在发酵型酸牛奶中生长繁殖情况，为此，本文就大肠杆菌在发酵型酸牛奶生长情况进行了评述。 二术语和定义： 1.大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.发酵乳fermented milk：以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH 值降低的产品。 3.大肠杆菌：广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在4 4.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP实验、柠檬酸盐）生化实验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 三设备及试剂： 1.温箱:36±1度 2.冰箱:2-5度 3.恒温水浴:46±1℃ 4.天平：感量0.01g 5.均质器 6.振荡器 7.无菌培养皿:直径为90mm 8.无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度) 9.无菌锥形瓶:容量为500ml 10.移液器：20-200ul 培养基和试剂: 1.结晶紫中性红胆盐琼脂 2.煌绿乳糖胆盐肉汤 3.无菌生理盐水 4.无菌1mol/lNaOH和1mol/lHCL 四实验方法 1 收集发酵型酸牛奶，以大肠杆菌作为大肠菌群的典型菌落，其中添加10ml的复溶大肠杆菌(菌种编号为CCTCC AB91112)于样品中；
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施：
大肠杆菌培养基配制及培养方 法(总2页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除
大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。 2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。 五、大肠杆菌的培养
大肠杆菌发酵经验总结 首先， 补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响）所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果 。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制p H值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导， 1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达； 2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，p H偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易形成较低的p H，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比. 温度对大肠杆菌的影响:大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代谢
. 大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 o C冻存。-80 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒1 / 2 . 精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。 五、大肠杆菌的培养 1）将接种好的平皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养，大约十几小时后长出菌落。
附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所 产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份： 胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g 乳糖（Lactose） 5.0g 氯化钠（NaCl） 5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75g 硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g 试剂水1L 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭 菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培 养基。
大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
大肠杆菌的检测方法 大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
大肠杆菌培养 、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40即油，-80°C冻存。 、培养基制备 LB 培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton ）：10 g/L ；酵母提取物（Yeast Extract ）：5 g/L ；NaCl：10 g/L ；pH 7.4 ） 液体培养基 胰化蛋白胨10.0g 酵母粉5.0g 氯化钠10.0g 水1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH M pH至7.4左右，定容至1L,调pH 7.4 （若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）） 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%勺琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC 灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。 液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min 以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL （直径90mr）在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min 左右，待琼脂基本凝固可涂平板。 6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min,使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21 冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。 2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应
大肠杆菌高密度培养 生物1401谢宇忱2014018093 １大肠杆菌高密度培养的影响因素 １．１菌种 不同的E.coli菌株由于自身代谢系统的不同，在培养条件、对外界环境耐受能力等方面都存在着较大的差异。例如E.coli K系列菌株和E.coli B系列菌株均为较常用的培养菌株，进行了乙酸代谢研究，发现前者的乙酸积累仅为后者的1/4，菌体密度也高出25％。 １．２接种量 接种量会影响菌体在发酵罐中的生长速度。较大的接种量可以缩短菌体生长达到最高值的时间，这是因为种子液中含有大量胞外水解酶类，有利菌体对基质的快速充分利用，缩短生长延迟期。但是接种量过大也会使菌体生长过快，菌体生长持续的时间缩短，自溶也较快，反而影响后期的生长。 １．３培养基 高密度培养的目的是尽可能多地获得菌体生物量和表达产物，这就需要提供数倍于生物量的营养物质，才能满足菌体大量生长繁殖及分泌表达产物的需要。但基质中营养物质的浓度也不能太高，否则就会产生抑制效应，不利于高密度培养。 １．３．１碳源 不同微生物对碳源的需求各不相同，碳源的种类和浓度对菌体的生长代谢也有不同的影响。葡萄糖E.coli发酵中最常用的碳源。但以葡萄糖作为碳源易产生代谢抑制物质———乙酸，研究表明以甘油代替葡萄糖作为E.coli生长的碳源可以减少乙酸的积累，更易达到高密度。在发酵过程中补加麦芽糖和甘油，菌体密度和产物量都提高了2.5倍。 １．３．２氮源 大量研究表明应对发酵过程中的氮源加以控制，氮源浓度过高对菌体的生长和产物的表达合成都可能产生负面影响。培养E.coli时常用氨水作为主要的氮源，在培养过程中以流加的方式加入培养液，既可用来充当氮源又可用来调节发酵液的ｐＨ值，但氨水加入过多会导致细胞的产率下降。 １．３．３微量元素 E.coli对钙、钴、铁、铝、锰、锡等微量元素的需求量虽然很小，但微量元素对微生物的生长及活性所起的作用不可忽视，在高密度培养时应在培养基中添加适量的微量元素。１．４培养条件 １．４．１温度 温度对E.coli的生长繁殖有很大的影响E.coli的最适生长温度为37℃，但在近期的一些研究中，经常以低于37℃的温度来培养E.coli，当培养温度从37℃下降至30℃左右时，可使细胞的营养物摄入率和比生长速率减小，减少有害抑制产物的积累和代谢热的产生。 １．４．２溶氧 氧是一种难溶气体，常温常压下氧在纯水中的溶解度仅为７ｍｇ·Ｌ^－１。因此溶氧很容易成为E.coli高密度培养的限制因素，尤其是在高密度培养的后期，发酵液中菌体密度很大，耗氧量极大。在高密度培养时，可以通过提高发酵通气量、搅拌速度、通入纯氧等方法来控制溶氧；还可以通过使用氧溶解度高的载体来提高溶氧。 １．４．３ｐＨ值 微生物一般能够在３～４个ｐＨ值单位的范围内生长，细菌最适生长ｐＨ值为６．５～７．５，在ｐＨ值５．０以下或８．５以上就不能生长。培养液中ｐＨ值的变化会影响细胞