人的外周血淋巴细胞培养
摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1]
关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析
前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。
1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3]
淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。
1.材料方法
1.1 材料
人的外周血淋巴细胞。
1.2 器具
采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
1.3 药品
1.3.1 RPMI“1640”培养基
称取“1640”粉末1.05 g，用100 mL的双蒸水溶解，溶解后pH 值调至 6.0。每1000 毫升溶液加NaHCO31.0克，校正PH到7.1。
1.3. 2 肝素
作为抗凝剂使用。称取该粉末8 mg（每mg含126 单位），用2 mL的生理盐水溶解，此溶液的浓度为504 单位/mL。
1.3.3 生理盐水
用0.9克NaCL加入100mL蒸馏水中，配制溶液。
1.3.4 秋水仙素
作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素1mg，用25mL生理盐水溶解，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1mL注射器吸取该溶液0.1mL加入5mL的培养物中，其最终浓度为0.8微克/毫升。
1.3.5 植物凝血素（PHA）
是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的PHA粉末，一个针剂为
0.2mL。将1瓶粉末溶在2mL的蒸馏水中。
1.3.6 抗菌素
青霉素（以每瓶80 万单位为例）：将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中，则每毫升含10万单位。取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为1000单位/mL。
链霉素（以每瓶100 万单位为例）：以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含100万单位，取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为100单位/mL。
1.3.7 吉姆萨染液
实验室中有现成染液
1.3.8 3.5%NaHCO3溶液
实验室有已配好的试剂。
1.3.9 0.1mol/L磷酸缓冲液
实验室有已配好的试剂。
2 方法步骤
2.1 分装培养液
用移液管将培养液和其他各试剂分装入培养瓶中，每瓶量为：
RPMI“1640”培养基4mL
小牛血清1mL
PHA 0.2mL
双抗（青霉素加链霉素）0.1mL
用3.5%NaHCO3溶液调pH到7.3，分装到20mL的培养瓶中，盖好盖子，用标签纸标清姓名，置于冰柜中保存。用前从冰柜内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。
2.2 采血
用酒精消毒手指皮肤，用采血针刺破皮肤，再用毛细管取血0.3mL全血，吹入瓶中,轻轻摇动几下，盖好盖子，直立置于37℃恒温箱内培养。
2.3 培养
置37℃温箱内培养72 小时——这个时间恰好是白细胞分裂的两个周期。
2.4秋水仙素处理
培养终止前在培养物中加入浓度为40μg/mL的秋水仙素0.1mL，最终浓度为0.8μg/mL，置恒温箱中处理4h。
2.5 低渗处理
秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液(蒸馏水)5 mL，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置37℃温箱处理20 min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。
2.6离心
以1000r/min，离心5min10s，弃去上清液，收集白细胞。
2.7 固定
加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶l，临时配制)3 mL，片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15 min后，离心，吸去上清液，留下白细胞。
2.8再固定
加入固定液2 mL，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15min （过夜也可以）。
2.9 再离心
以1000r/min，离心5min10s，除去上清液，留下白细胞制片。
2.10 制片
用吸管吸取细胞悬液自1m高处，滴在从冰柜中取出的一块干燥洁净的载玻片上,每片滴加悬液1—3 滴，用嘴轻轻吹散，在酒精灯火焰上微微烤干。
2.11 染色
用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释过的Geimsa 染色液(1︰10)染色20min，然后倒去多余染液。并用蒸馏水轻轻冲洗。
2.12 镜检
待稍干后，在显微镜下观察。先用低倍寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。选择染色体清晰、分散度好的细胞进行核型分析。
3 结果分析
3.1实验结果
该图为显微镜视野内所拍到的图
3.2 核型分析：人类每个体细胞有46 条染色体，22 对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。可以将人的46 条染色体分成A、B、C、D、E、F、G 七群，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。三个参数：（1）染色体的相对长度（2）臂比率（3）着丝点指数
4 分析讨论
4.1实验误差分析
实验利用的是植物凝血素(PHA)使停止分裂的细胞恢复分裂的原理来获得大量的有丝分裂细胞，从而便于对染色体经行观察。但淋巴细胞经过培养后，制成的标本质量不佳，染色体不明显,视野中除有染色体以外还有杂菌等,其原因可能为：
(1)未作灭菌处理，由于细胞培养是在37℃的环境中进行的，而此温度也是细菌繁殖的最适温度，所以杂菌会出现在视野中。
(2)秋水仙素处理不当，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。
(3)低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。
(4)低渗处理完后，细胞悬液可能并没有变浑浊，这有可能是用蒸馏水做低渗液没有使红细胞完全破裂，没有使白细胞充分的膨胀，从而会影响到观察的结果。
(5)在两次离心后，在离心管底没有看到明显的沉淀，有可能是培养基酸碱度没有调到最适的pH值或是培养时间短而导致白细胞量不足，从而影响了观察结果。
(6) 标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。
(7)载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流动而丢失。
(8)载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻
不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。
(9)核型图中染色体有的变粗，而有的很细小。造成这种结果的原因可能是秋水仙素处理不彻底，一部分染色体加倍，而一部分没有。
4.2 实验注意事项
4.2.1接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后24 小时内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,会影响细胞的活力.
4.2.2在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA 的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要.人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃.培养液的最适pH7.2～7.4.
4.2.3 适量的秋水仙素、适宜的处理时间，是获得良好分裂相的先决条件。这将影响分裂相的多少和染色体的长短。由于秋水仙素有强烈的毒性作用，用量过大，作用时间过长，可使缩短和发生异常分裂现象，甚至导致染色体破碎；反之，则染色体数量少而形态细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
4.2.4 低渗处理是获得分散良好的分裂相的关键步骤。低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。注意，低渗液在使用前需要在37℃温箱预温。
4.2.5 充分的固定是制备良好分散的染色体的重要步骤。如果染色体分散的不好，可在余下的细胞悬液中改为甲醇：冰醋酸=1:3的固定液，有时可改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷。固定时间可以延长数小时或过夜。特别要注意的是，固定液要新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定的效果。
4.2.6 固定液纯度要高，临用时新鲜配制，应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现毛刷状。
4.2.7 滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步。首先载玻片要非常干净，否则将会影响染色体的分散的效果。其次，滴片的距离、滴加量的多少、制片的方式都会影响到染色体分散的效果。分裂相过多或过少，染色体过于分散都会影响到染色效果和观察。
4.2.8 在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则将会丢失许多细胞。
4.2.9 机械打散细胞团时，用力要适度，若用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。
4.2.10 制片过程中,如发现细胞膨胀得不大,细胞膜没有破裂,染色体聚集一团伸展不开,可将固定时间延长数小时或过夜.
4.2.11 配药品时需要注意分析天平是否水平。
5内容改进
5.1 抗菌素的配制
以青霉素为例：青霉素，每瓶80万单位，可用1.6mL生理盐水稀释，则每毫升含50万单位。取0.01mL加入5mL培养基中，则最终浓度为1000单位/毫升。这样，相对1.3.6中的液体取用量减少很多，相对的节约了药品。
5.2 离心机的使用
由于所使用的离心机在离心前，需要一定的时间加速到所需转数，因而设置时间时要
比预定时间久一点。据观察，该仪器加速时间为20s，所以在该实验中应将设定时间为5min20s。
参考文献：
[1]刘祖洞，江绍慧主编.遗传学实验.高等教育出版社.北京
[2]李亚轩，赵昕主编.遗传学综合实验.科学出版社.北京
[3]吴鹤龄，林锦湖主编.遗传学实验方法和技术.高等教育出版社.北京
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析 一、实验背景 1、Carnoy固定液： 固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。 2、低渗液（hypotonic solution） 低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。 2、肝素 N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。 2、PHA 植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。 3、青霉素和链霉素 青霉素：青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。 链霉素对许多革兰阴性杆菌有抗菌作用。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。链霉素的作用在PH值为7.8时最强，PH值降至6或6以下时则大大减弱。四环素作用机制为药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。 4、秋水仙素 秋水仙能素破坏纺锤体,阻断细胞有丝分裂,使分裂的细胞全部阻止在中期。实验中要严格控制培养物中秋水仙素的浓度,不仅保证有效的终止细胞第一次分裂,而且使秋水仙素的细胞毒
急性淋巴细胞白血病 关键词：急性淋巴细胞白血病癌症ALL 症状预后生存率年龄 急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种血液癌症，是成年人中比较常见的白血病类型之一。 1发病机制： 急性淋巴细胞白血病为骨髓正常造血衰竭和白血病细胞髓外浸润所引起。起病有急有缓，主要取决于白血病细胞的体内增殖速率和蓄积程度。急骤者表现突发高热、严重出血倾向、骨关节疼痛或全身衰竭等；缓慢者仅有渐进性苍白、疲乏、低热或轻微出血症状。淋巴细胞有三种表象：一为原始和幼稚淋巴细胞明显增生，比例增高，以小淋巴细胞为主；核圆形，偶有凹陷与折叠，染色质较粗，结构较一致核仁少，不清楚；胞浆少，轻或中度嗜碱。二为原始和幼稚淋巴细胞明显增生，比例增高，淋巴细胞大小不一，以大细胞为主；核形不规则，凹陷与折叠易见，染色质较疏松，结构不一致，核仁较清楚，一个或多个；胞浆量较多，轻或中度嗜碱。三为原始和幼稚淋巴细胞明显增生，比例增高，但细胞大小较一致，以大细胞为主；核形较规则，染色质呈均匀细点状，核仁一个或多个，较明显，呈小泡状；胞浆量多，深蓝色，空泡常明显，呈蜂窝状。 2影响急性淋巴细胞白血病病程和治疗结果的决定因素 急性淋巴细胞白血病侵入血液，可在体内扩散至其他器官，如肝，脾和淋巴结肿大，但它通常不会象肿瘤一样分化成多种癌症，急性淋巴细胞白血病是发展很快急性癌症，如果不及时治疗，患者会在几个月内死亡。 影响病程和治疗结果的主要因素：1年龄，年轻的患者往往会有一个更好的治疗前景。2实验室诊断，当诊断有一个较低的白细胞计数，治疗效果会更好。3根据法，美，英等国的分類，即用於所有的急性白血病（包括急性髓細胞性白血病，白血病）①全母語：小細胞均勻②全二級：大变异細胞③全三級：大不同的細胞空泡（泡沫狀功能）各种亞型分类，然后再通过测定表面标志物的异常淋巴細胞，依据2個主要的免疫類型：前B細胞和前T細胞。成熟的B細胞ALL （三級）現在列為伯基特淋巴瘤/白血病，根据分型来确定最合适的治疗方式。④如果发现费城染色体即异常染色体，将会有个较差的治疗结果。{患者的染色体发生移位表现为9号染色体长臂移至22号染色体短臂上，其基因型为bcr/abl融合，在大部分CML,部分ALL，及少数急性髓细胞白血病可见。ph染色体（费城1号染色体）：nowell及hungerford于1960年发现慢性粒细胞性白血病（cml）血中有一个小于g组的染色体，由于首先在美国费城（philadelphia）发现，故命名为ph染色体。最初认为是22号染色体的长臂缺失所致，后经显带证明是9号和22号染色体长臂易位的结果。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因abl和22号染色体(22q11)上的bcr(break point cluster region)基因重新组合成融合基因。后者具有增高了的酪氨酸激酶活性，这是慢性粒细胞性白血病的发病原因。ph的重要临床意义在于：大约95％的慢性粒细胞性白血病病例都是ph阳性，因此它可以作为诊断的依据...}⑤及时化疗。治疗前景更好，在证明为急性淋巴细胞白血病的4，5周开始化疗，会有非常好的治疗前景。 3导致急性淋巴细胞白血病的危险因素 对于大多数人来说，急性淋巴细胞白血病致病原因不明。由于这个原因，有没有已知的方法来阻止它。然而，有一些已知的危险因素，这些因素可能会增加获得急性淋巴细胞白血病的机会。但目前还不知道是否这些危险因素是白血病的实际致病原因： Ⅰ暴露于高剂量辐射区或治疗其他类型的癌症引起本病。 Ⅱ暴露于如苯或某些化学品—用于石油精炼厂和其他行业和香烟的烟雾，某些清洁产品，清洁剂如溶剂、脱漆剂等 Ⅲ与人类T细胞淋巴瘤感染/白血病病毒1型或美国以外的EB病毒（EBV）的区域，相关的白血病更普遍出现在非洲的罕见情况下（白血病病毒- 1）。 Ⅳ有一种遗传性遗传综合征如唐氏综合症 Ⅴ白人男性 4急性淋巴细胞白血病的症状
https://www.doczj.com/doc/5e13409960.html,/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞 分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。 我的经验 1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！） 3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 4. 离心 .转速：1500/分 温度20c －28c 时间：20分钟 no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) 5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞 6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！ 7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。 8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！) 时间：10分钟 温度：4c 9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你） 10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？ 11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形. a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数） b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞 c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形 d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度 e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？） 12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱. 看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！ 1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是 2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的 3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团 建议; 不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
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人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混 匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟） 6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上 体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个 大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ──────────×10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。
人外周血淋巴细胞微核测定 一、实验原理: 人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的G0期，在含有PHA的培养基中进行体外培养后，原来处于G0期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物，检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。 二、验用品 （1）器材：离心管、注射器、培养瓶（10ml）、吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水浴箱。 （2）试剂：Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、RPMI1640培养液、PHA溶液、0.075mol／L KCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液 （3）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。 三、实验步骤 1、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分别加入受试物（CP终浓度100ug/ml）培养72小时，收获前不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。 2、低渗：加入0.075mol／L KCl溶液4m1。混匀后放入37℃恒温水浴箱中低渗处理10分钟。低渗时间可根据预实验中细胞完整程度进行调整。 3、预固定：低渗结束后加入甲醇·冰乙酸（3:1）固定液lml，混匀后离心（1000rpm）5分钟。 4、固定：弃上清液，加入5ml固定液，混匀后离心（1000rpm）5分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再固定一次。 5、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。 6、染色：用Giemsa染液染色 10分钟。自来水细水冲洗后，晾干。 7、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。转化淋巴细胞与未转化淋巴细胞比较，前者细胞较大，胞核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核仁多，胞浆丰富，常见空泡
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
慢性淋巴细胞白血病诊疗规范 一、定义 慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/LL)是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征。CLL与SLL本质上是同一种疾病因主要累及部位不同而造成的不同表现形式。 所谓的T-CLL现归为T幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL)。 二、诊断、分期及预后、鉴别诊断 1．诊断：达到以下标准可以诊断：①外周血B淋巴细胞计数≥5×109/L，且≥3个月。B淋巴细胞<5×109/L，存在CLL细胞骨髓浸润所致血细胞减少，也可诊断CLL。②血涂片中的自血病细胞特征性表现为小的、成熟淋巴细胞，细胞质少，核致密，核仁不明显，染色质部分聚集。外周血淋巴细胞中幼稚淋巴细胞<55％。③典型的免疫表型：CD5(+)、CD10(-)、CDl9(+)、FMC7(-)、CD23(+)、CD43(+/-)、CCNDI(-)。表面免疫球蛋白(sIg)、CD20、CD22及CD79b弱表达(dim)。白血病细胞限制性表达K或入轻链。 SLL：淋巴组织具有CLL的组织形态与免疫表型特征。 诊断标准：①淋巴结和(或)脾、肝肿大；②无骨髓浸润所致的血细胞减少；③外周血B淋巴细胞<5×109/L。 单克隆B淋巴细胞增多症(MBL)：MBL是指健康个体外周血存在低水平的单克隆B淋巴细胞。诊断标准：①B淋巴细胞克隆性异常(K：入>3：1或<0.3：1)；②B淋巴细胞<5×109/L；③无肝、脾、淋巴结肿大(所有淋巴结<1.5 cm)；④无贫血及血小板减少；⑤无淋巴组织增殖性疾病(LPD)的其他l临床症状。根据免疫表型分为CD5+MBL(CLL样表型)和CD5-MBL(非CLL样)。 2．分期及预后：CLL患者的中位生存期7-10年，但不同患者的预后呈高度异质性。临床上估计预后最早、最广泛使用Binet分期系统(表1)。 表1 慢性淋巴细胞细胞白血病的Binet临床分期系统 注：5个淋巴组织区域包括头颈部、腋下、腹股沟(单侧或双侧均计为1个区域)、肝和
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead 等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。 笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。 M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。参考文献 [1] 丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9. (收稿日期:2010-12-16) v 通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin https://www.doczj.com/doc/5e13409960.html, 。 #经验交流# 外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会 马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元 v (川北医学院附属医院检验科,四川南充637000) 摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。 关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。1 淋巴细胞培养 1.1 外周血采集 一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。 1.2 接种 培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。 1.3 细胞培养 细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。1.3.1 培养时间 经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于 分析。 1.3.2 培养温度与气体 淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。2 细胞收获 2.1 秋水仙素与作用时间 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。 2.2 离心力 将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。整个过程中,离心力的大小很关键。离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。这一步本室选择1900r /min 离心10min 。而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。 2.3 低渗 低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。低渗液渗透压过
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
微核细胞率micronucleus frequency，在CB法微核试验中指1000个双核细胞中含有微核的细胞数。 外周血淋巴细胞微核率测定 外周血淋巴细胞微核率测定作为对职业性放射性工作者所受辐射损伤的评价是一项非常有意义的指标，亦列为我国慢性放射病诊断的重要检测指标之一。健康成人外周血淋巴细胞微核细胞率正常值范围为0-6‰,均值为1.2‰, 微核 微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。而植物系统则更直接、更简便。如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。微核是细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞浆中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核，位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核1/3，主要由外界损害因素(生物、物理、化学)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。
万方数据
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生堡』Ｌ型盘查垫！垒生！旦复丝鲞筮！翅鱼！也』丛！丝！，！！Ｅ！！堡鲢！垫！堡：！！！：！！：塑些！ 表１ＣＣＬＧ—ＡＬＬ２００８方案的构成 ．６４３? 注：ＣＣＬＧ：中国儿童白血病协作组；ＡＬＬ：急性淋巴细胞自血病；ＶＤＬＤ方案：长春新碱一柔红霉素一左旋门冬酰胺酶一地塞米松；ＤＮＲ：柔红霉素；ＣＡＭ：环磷酰胺一阿糖胞苷＿６．巯基嘌呤；ＨＤ．ＭＴＸ：大剂量甲氨蝶呤；ＨＲ一１’，２７，３’：ＢＦＭ协作组高危模块方案ｌ’、２’、３’；ＶＤＬＤ（延迟强化Ｉ）：长春新碱一阿霉素一左旋门冬酰胺酶一地塞米松；６一ＭＰ：６一巯基嘌呤；ＭＴＸ／ＶＤ：甲氨蝶呤和（或）长春新碱一地塞米松；ＭＴＸ／ＣＡ／ＶＤ：甲氨蝶呤和（或）环磷酰胺一阿糖胞苷和（或）长春新碱一地塞米松；一为无方案 表２按年龄鞘注的药物剂量（ｍｇ） 脉滴注，每１２小时１次共５次，ｄ３～５。三联鞘注ｄ５。 ５．延迟强化治疗：ＶＤＬＤ＋ＣＡＭ方案：对于ＬＲ患儿，ＶＣＲ１．５ｍ∥（ｍ２?ｄ），静脉注射，ｄ１、ｄ８、ｄ１５；阿霉素２５ｍｅ，／（ｍ２?ｄ），静脉滴注，ｄ１、ｄ８、ｄ１５；Ｌ．ＡＳＰ１００００Ｕ／（ｍ２?ｄ），肌肉注射或静脉滴注，ｄｌ、ｄ４、ｄ８、ｄ１１；Ｄｅｘ１０ｍｇ／（ｍ２?ｄ），口服，ｄ１～７、ｄ１５—２１，无需减停。ＣＡＭ方案剂量和用法同ＬＲ早期强化治疗。ＩＲ患儿在插入８周维持治疗（６一ＭＰ＋ＭＴＸ）后，再重复１次上述的（ＶＤＬＤ＋ＣＡＭ）。高危延迟强化治疗（ＶＤＬＤ＋ＣＡＭ）：ＶＣＲ１．５ｍｇ／（ｍ２?ｄ），静脉注射，ｄ８、ｄ１５、ｄ２２、ｄ２９；阿霉素２５ｍｓ／（ｍ２?ｄ），静脉滴注，ｄ８、ｄ１５、ｄ２２、ｄ２９；Ｌ—ＡＳＰ１００００Ｕ／（ｍ２?ｄ），肌注或静脉滴注，ｄ８、ｄ１１、ｄ１５、ｄ１８；Ｄｅｘ１０ｍｇ／（ｍ２ｄ），口服，ｄｌ一２ｌ，９ｄ减停。ＣＡＭ方案剂量和用法与ＩＲ．ＡＬＬ相同。 ６．维持治疗：ＬＲ和ＩＲ：６－ＭＰ＋ＭＴＸ／ＶＤ方案选择以下任１种：（１）６－ＭＰ５０ｍｒ，／（ｍ２?ｄ），口服８周；ＭＴＸ２０ｍ∥（ｍ２?ｄ），口服或肌注，每周１次，持续至终止治疗；每４周叠加ＶＤ（ＶＣＲＩ．５ｍ∥ｍ２／ｄ，静脉注射，ｄｌ；Ｄｅｘ６ｍｇ／（ｍ２?ｄ），口服，ｄ１～５）；（２）１周ＶＤ与３周６－ＭＰ＋ＭＴＸ序贯进行，每４周为１个循环。ＨＲ：（６－ＭＰ＋ＭＴＸ／ＣＡ／ＶＤ）：每４周１个循环，持续至终止治疗。第１～２周（６－ＭＰ＋ＭＴＸ），６－ＭＰ５０ｍｓ／（ｍ。?ｄ），口服，ｄ１～１４；ＭＴＸ２０ｍｇ／（ｍ２?ｄ），口服或肌肉注射，ｄ１、ｄ８。第３周（ＣＡ），ＣＴＸ３００ｍｒ，／（ｍ２?ｄ），静脉滴注，ｄ１５；Ａｒａ?Ｃ３００ｍ∥（ｍ２?ｄ），静脉滴注，ｄ１５。从维持治疗的第４９周开始，由６－ＭＰ＋ＭＴＸ代替ＣＡ。第４周（ＶＤ），ＶＣＲ２ｍｓ／（ｍ２－ｄ），静脉注射，ｄ２２；Ｄｅｘ６ｍｓ／（ｍ２?ｄ），Ｅｌ服，ｄ２２～２６。从维持治疗的第８１周开始，由６ＭＰ＋ＭＴＸ代替ＶＤ。庇护所预防：ＬＲ：鞘注ＭＴＸ，ｄｌ，每８周１次共６次；ＩＲ：三联鞘注每８周１次，ｄ１，共４次；Ｔ?ＡＬＬ及ＨＲ：三联鞘注每４周１次，共１０次。总疗程ＬＲ为２年，ＩＲ和ＨＲ：女孩２．０年，男孩２．５年。 ７．ｔ（９；２２）／ＢＣＲ—ＡＢＬｌ阳性患儿的治疗：ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑｌＩ．２）／ＢＣＲ－ＡＢＬｌ阳性的儿童ＡＬＬ应给予高危方案化疗，或进行造血干细胞移植¨…。对有条件的患者儿在化疗的同时可应用酪氨酸激酶抑制剂。１…。 ８，ＣＮＳＬ和ＴＬ的治疗：初诊时合并ＣＮＳＬ的患几在诱导治疗中每周１次三联鞘注治疗，直至脑脊液转阴至少５次。在完成延迟强化治疗后接受颅脑放疗，但＜１岁不放疗；１—２岁剂量为１２Ｇｙ；年龄＞／２岁裁量为１８Ｇｙ。复发的ＣＮＳＬ隔天１次三联鞘注治疗，直至脑脊液转阴，颅脑放疗同上。同时根据复发的阶段，重新调整全身化疗方案。初诊时合并ＴＬ的患儿在巩固治疗结束后进行楔形活检，确定是否睾丸放疗。ＴＬ复发的患儿，一般作双侧睾丸放疗（即使为单侧复发），剂量２０—２６Ｇｙ，对年龄较小的幼儿采用１２～１５Ｇｙ可保护正常的性腺功能¨“。在作ＴＬ治疗的同时根据治疗的阶段，重新调整全身化疗方案。 （四）化疗说明 １．泼尼松试验ｄ１～７，从足量的２５％用起，根据临床反应逐渐加至足量，７ｄ内累积剂量＞２１０ｍｇ／ｍ２，对于肿瘤负荷大的患者可减低起始剂量０．２—０．５ｍｇ／（ｍ２?ｄ），以免发生肿瘤溶解综合征。第８天评估泼尼松反应，如在使用泼尼松过程中自细胞计数升高，表现泼尼松反应不良而被评估为高危患者，应转用ＨＲ－ＡＬＬ方案。 ２，在诱导缓解治疗的ｄ１５、ｄ３３行骨髓形态学检查，ＬＲ患者ｄ１５骨髓原始及幼稚淋巴细胞Ｉ＞２５％应转用ＩＲ．ＡＩ上方案；ＩＲ患者ｄ１５骨髓原始及幼稚淋巴细胞ｔ＞２５％应转用ＨＲ－ＡＬＬ方案；ｄ３３骨髓原始及幼稚淋巴细胞＞５％者应转用ＨＲ—ＡＬＬ方案。 ３．ＭＴＸ鞘注治疗应在泼尼松实验治疗第１天内就进行（ＷＢＣ＞１００×１０９／Ｌ可延迟至第２～３天进行），尽量避免穿刺损伤性出血，第１次腠椎穿刺应由有经验的医师来操作，操作前应注意血小板计数及出血情况。 ４．每个疗程化疗完成后，一旦血象恢复（外周血白细胞计数＞１２．０×１０９／Ｌ，中性粒细胞计数绝对值≥Ｏ．５ｘ１０９儿，血小板Ｉ＞５０×１０９／Ｌ），肝肾功能无异常，须及时作下一阶段 万方数据甲氨蝶呤 见更正：https://www.doczj.com/doc/5e13409960.html,/index/hzx/20141016/1413438939813_1.html