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土壤纤维素酶测定方法

土壤纤维素酶测定方法
土壤纤维素酶测定方法

纤维素酶活性测定

一、试剂:

1)醋酸缓冲液(pH 5.5):164.08 g无水醋酸钠(C2H3O2Na)溶于700 ml去离子水,用醋酸(C2H4O2)调节pH至5.5,用去离子水稀释至1 L。

2)CMC溶液(0.7%,w:v):7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液,45℃下搅拌2 h,此溶液在4℃下可存放7天。

3)还原糖试剂:

试剂A:16 g无水碳酸钠(Na2CO3)和0.9 g氰化钾(KCN)溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B:0.5 g六氰铁钾(K4Fe(CN)6)溶于去离子水并稀释至1 L,贮于棕色瓶中。

试剂C:1.5 g 硫酸铁铵(NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O)、1 g十二烷基硫酸钠(C12H25O4SNa)和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水,冷却后稀释至1 L。

4)水合葡萄糖溶液:28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中,并定容至1 L。

二、仪器设备

恒温培养箱,水浴锅,分光光度计,搅拌器,三角瓶

三、操作步骤

取10.00 g(耕地)或5.00 g(林地)新鲜土壤(<2 mm)于100 ml三角瓶中,加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液,盖上塞子,于50℃下培养24 h,过滤。同时做空白对照,但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液,并迅速过滤。

取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中,并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中,加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B,盖紧混匀,在100℃水浴中加热15 min 后,立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C,混匀,20℃下静置显色60 min,于690 nm波长处比色测定(要求在30 min内完成)。

标准曲线:吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 ml水合葡萄糖溶液,用去离子水稀释至2 ml,同上加入还原糖试剂A、B、C后,比色测定还原糖含量。c) 空白:

无土空白:不加土样,其余操作与样品试验相同,整个试验设置一个,重复一次。

无基质空白:以等体积水代替基质,每个土样设置一个。

四、结果计算

土壤纤维素酶活性(μg·g-1·(24 h)-1)=(C*V*f)/ dwt

式中C为样品的葡萄糖含量(μg·ml-1);V为土壤溶液体积(30 ml);f为稀释倍数(25);dwt为烘干土壤质量(g)

五、注意事项

(1)此方法较适用于林地土壤,耕地土壤的测定结果一般较低。

(2)氰化钾为剧毒试剂,接触皮肤的伤口或吸入微量粉末即可中毒死亡。与酸接触分解能放出剧毒的氰化氢气体,与氯酸盐或亚硝酸钠混合能发生爆炸。

(3)盐分、铵离子、银、草酸锰、氧化物以及氟等含量较高时,会干扰葡萄糖的测定。因此,建议稀释滤液。

(4)培养时加甲苯与不加甲苯的测定结果一般没有显著性差异。

(5)测定还原糖时需严格控制体系的pH值,加入还原糖试剂A和还原糖试剂B 后,pH 值应该高于10.5,加入还原糖试剂C之后,pH值则应低于2。

(6)含氰化物的溶液可以在碱性条件下用H2O2氧化处理,或者加入强碱性次氯酸盐,反应24小时后,再用大量水冲入废水系统。

土壤微生物测定方法

土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态,可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标: 1、土壤微生物量(MierobialBiomass,MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量,一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前,熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎,它是将待测土壤经药剂熏蒸后,土壤中微生物被杀死,被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2,根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外,还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大,不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等,均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤: (1)土壤前处理和熏蒸 (2)提取 -1K2SO 4(图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中,加入100mL0.5mol·L 水比为1:4;w:v),振荡30min(300rev·min -1),用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时,另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中,直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取;另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 (3)测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管(24mmх295mm)中,准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液,加入2~3玻璃珠或瓷片,混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min(放入消化管前,磷酸浴温度应调至179℃,放入后温度恰好为175℃)。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中,用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL, 加入一滴邻菲罗啉指示剂,用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定,溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色,再变为红棕色,即为滴定终点。 (4)结果计算

土壤纤维素酶测定方法

纤维素酶 一、试剂: 1)醋酸缓冲液(pH 5.5):164.08 g无水醋酸钠(C2H3O2Na)溶于700 ml去离子水,用醋酸(C2H4O2)调节pH至5.5,用去离子水稀释至1 L。 2)CMC溶液(0.7%,w:v):7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液,45℃下搅拌2 h,此溶液在4℃下可存放7天。 3)还原糖试剂: 试剂A:16 g无水碳酸钠(Na2CO3)和0.9 g氰化钾(KCN)溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B:0.5 g六氰铁钾(K4Fe(CN)6)溶于去离子水并稀释至1 L,贮于棕色瓶中。 试剂C:1.5 g 硫酸铁铵(NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O)、1 g十二烷基硫酸钠(C12H25O4SNa)和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水,冷却后稀释至1 L。 4)水合葡萄糖溶液:28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中,并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱,水浴锅,分光光度计,搅拌器,三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g(耕地)或5.00 g(林地)新鲜土壤(<2 mm)于100 ml三角瓶中,加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液,盖上塞子,于50℃下培养24 h,过滤。同时做空白对照,但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液,并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中,并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中,加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B,盖紧混匀,在100℃水浴中加热15 min 后,立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C,混匀,20℃下静置显色60 min,于690 nm波长处比色测定(要求在30 min内完成)。 标准曲线:吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 ml水合葡萄糖溶液,用去离子水稀释至2 ml,同上加入还原糖试剂A、B、C后,比色测定还原糖含量。c) 空白: 无土空白:不加土样,其余操作与样品试验相同,整个试验设置一个,重复一次。 无基质空白:以等体积水代替基质,每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性(μg·g-1·(24 h)-1)=(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量(μg·ml-1);V为土壤溶液体积(30 ml);f为稀释倍数(25);

测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法,诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件,提高测定结果的准确性,可根据有关资料中采用的测定条件,以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法: 1、葡萄糖标准曲线制作: 530nm比色。 2、酶活测定方法:

考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响,所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法,后面保持实验条件一致,显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算:T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n :稀释倍数; K :曲线斜率; T :反应时间,min ; 1000:mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果: 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果

测定结果 实验结论:从以上几种对酶液的处理方法来看,183的酶活要比R2高,两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献,所得测量结果与前面三种方法均不符,这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》(夏服宝等,《饲料工业》2005年第26卷第16期)和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》(刘妙莲等,中国食品发酵工业研究所)这两篇文献,实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索,进而优化实验方法。 刚果红染色法:常用的刚果红染色法有两种, 一种是先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应,另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上,覆盖质量浓度为1 mg /mI。的CR溶液,10~15 min后,倒去CR溶液,加入物质的量浓度为l mol/I。的NaCI溶液,15 min后倒掉NaCl溶液,此时,产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg/mI。的CR溶液,灭菌后,按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液,混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后,产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史,课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法,缺点是操作繁琐,加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂;其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便,不存在菌落混杂问题,缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质,可以使能够产生淀粉酶的微生物出

土壤微生物生物量的测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法(熏蒸提取----仪器分析法) 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后(24h),土壤微生物死亡细胞发生裂解,释放出微生 物生物量碳,用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤,借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数(K EC),从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳(TOC)分析仪(Shimadzu Model TOC—500,JANPAN)、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1)无乙醇氯仿(CHCL 3 ); 2)L硫酸钾溶液:称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3)工作曲线的配制:用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。(其实一般情况下, 仪器会自带的标曲,一般不用自己做的) 操作步骤 土壤的前处理(过筛和水分调节略) 熏蒸 称取新鲜(相当于干土,这个可以根据自己土样的情况而定)3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中,并放置盛有无乙醇氯仿(约2/3)的15ml烧杯2或3只,烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠,同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯,以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ,干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子,用真空泵抽真空,使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门,于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后,打开真空干燥器阀门(应听到空气进入的声音,否则熏蒸不完

全,重做),取出盛有氯仿(可重复利用)和稀NaOH溶液的小烧杯,清洁干燥器,反复抽真空(5或6次,每次3min,每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子),直到土壤无氯仿味道为止。同时,另称等量的3份土壤,置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。(注意:熏蒸后不可久放,应该快速浸提)※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样,将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中,加入40ml L硫酸钾溶液(土水比为1:4,考虑到土样的原因,此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g,即,4g土:16ml的硫酸钾溶液,当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定)300r/min振荡30min,用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析,或—20℃冷冻保存(但使用前需解冻摇匀)(注意这部分很重要,有研究结果表明:提取液如果不立即分析,请保存在—20℃,否则将影响浸提液的效果,其次,过滤时不要用普通的定性或定量滤纸,以免长久杂质会堵塞仪器的管路,建议使用那种一次性塑料注射器,配一个的滤头,一个才1元)。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul(这个要根据仪器自己的性能决定,但是一般情况下,在测定土壤滤液时候,要对其进行稀释,如果不稀释,一方面超过原来仪器的标曲,另一方面可能堵塞仪器。)注入自动总有机碳(TOC)分析仪上,测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多,不同的型号则操作程序存在较大差异,这里以本实验室使用的有机碳分析仪(Shimadzu Model TOC---500,JAPAN)为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮(茚三酮比色法) 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%,是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节,关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种,一是全氮测定法,另一个是茚三酮比色法,如下 基本原理(茚三酮比色法)

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳(Soil microbial biomass)不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用,同时是一个重要活性养分库,直接调控着土壤养分(如氮、磷和硫等)的保持和释放及其植物有效性。近40年来,土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的,因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法(Fumigation-incubation, FI)和熏蒸提取法(Fumigation-extraction, FE)。 熏蒸提取法(FE法) 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取 液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤 微生物碳的基本方法:该方法用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取剂(水土比1:4)直接提取熏蒸和不熏 蒸土壤,提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定;以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增 加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。 Wu等(1990)通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究,建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等(1999)对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进,以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值,有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有:直接法(加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物)和间接法(与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较)。提取液中有机碳的 测定方法不同(如氧化法和仪器法),那么转换系数K EC 取值也不同,如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为0.38(Vance等,1987)和0.45(Wu等,1990)。不同类型土壤(表层)的K EC 值有较大不同,其值变化为0.20-0.50(Sparling等,1988,1990;Bremer等,1990)。Dictor 等(1998)研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异,从表层 0-20cm土壤的K EC 为0.41,逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为0.31。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是:氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死,微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分(Joergensen,1996)。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量,以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 (1)硫酸钾提取剂(0.5mol·L-1):取871.25g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中,定溶至10L。 由于硫酸钾较难溶解,配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上(60-100rev·min-1)12小时即可完全溶解。 (2) 0.2 mol·L-1(1/6K 2Cr 2 O 7 )标准溶液:称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 (分析纯)9.806g 于1L大烧杯中,加去离子水使其溶解,定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解,可加热加快其溶 解。 (3) 0.1000 mol·L-1(1/6K 2Cr 2 O 7 )标准溶液:取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g, 用蒸馏水溶解并定溶至1L。

羧甲基纤维素酶测定原理

纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力的原理和方法,了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶,包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素,CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖,β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原,生成棕红色的氨基化合物,在540nm 波长处有最大光吸收,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料 (1)纤维素酶制剂 500mg (2)新华定量滤纸 50mg / 份× 4 (3)脱脂棉花 50mg / 份× 4 (4)羧甲基纤维素钠(CMC) 510mg (5)水杨酸苷 500mg 2.主要仪器 (1)722 型或其他型号的可见分光光度计 (2)恒温水浴2 台 (3)沸水浴锅 (4)电炉子 (5)剪刀 (6)万分之一分析天平 (7)恒温干燥箱 (8)冰箱 (9)试管架 (10)胶头滴管 (11)具塞刻度试管20mL×24 (12)移液管或加液器0.5 mL×3;2mL×7 (13)容量瓶100 mL×6;1000 mL×3 (14)量筒50 mL×2;100 mL×1;500 mL×1 (15)烧杯100 mL×6;500mL×3;1 000 mL×1 3.试剂(均为分析纯)

(1)浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重,准确称取100mg 于100mL 小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL,充分混匀。4℃冰箱中保存(可用12~15 天)。(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液 准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,加入2mol/L NaOH 溶液262mL,再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠(C4H4O6KNa · 4H2O,MW=282.22)的热水溶液中,再加5g结晶酚(C6H5OH,MW=94.11)和5g无水亚硫酸钠(Na2SO3,MW=126.04),搅拌溶解,冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL,充分混匀。贮于棕色瓶中,室温放置一周后使用。 (3)0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液(0.1 mol/L 柠檬酸溶液):准确称取C6H8O7 · H2O (MW=210.14)21.014g 于500mL大烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)

土壤纤维素酶活性测定(3,5-二硝基水杨酸比色法) 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下,它的最初水解产物是纤维二糖,在纤二糖酶作用下,纤维二糖分解成葡萄糖。所以,纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1)甲苯 2)1%羧甲基纤维素溶液:1g羧甲基纤维素钠,用50%的乙醇溶至100ml。 3)pH5.5醋酸盐缓冲液: 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L; 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L; 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4)3,5-二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸,溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中,再加75g酒石酸钾钠,用水稀释至250ml(保存期不过7天)。 5)葡萄糖标准液(1mg/mL) 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线:分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中,再补加蒸馏水至1mL,加DNS溶液3ml混匀,于沸腾水浴中加热5min,

土壤性质的测定.

含水量的测定 1、测定原理 土壤样品在105±2℃烘至恒重时的失重,即为土壤样品所含水分的质量。 2、仪器、设备 土钻、土壤筛(孔径1mm;)、铝盒:小型的直径约40mm,高约20mm;大型的直径约55mm,高约28mm;分析天平:感量为0.001g和0.01g;小型电热恒温烘箱;干燥器:内盛变色硅胶或无水氯化钙。 3、试样的选取和制备 3.1 风干土样:选取有代表性的风干土壤样品,压碎,通过1mm筛,混合均匀后备用。 3.2新鲜土样:在田间用土钻取有代表性的新鲜土样,刮去土钻中的上部浮土,将土钻中部所需深度处的土壤约20g,捏碎后迅速装入已知准确质量的大型铝盒内,盖紧,装入木箱或其他容器,带回室内,将铝盒外表擦拭干净,立即称重,尽早测定水分。 4测定步骤 4.1 风干土样水分的测定:取小型铝盒在105℃恒温箱中烘烤约2h,移入干燥器内冷却至室温,称重,准确至0.001g。用角勺将风干土样拌匀,舀取约5g,均匀地平铺在铝盒中,盖好,称重,准确至0.001g。将铝盒盖揭开,放在盒底下,置于已预热至105±2℃的烘箱中烘烤6h。取出,盖好,移入干燥器内冷却至室温(约需20min),立即称重。风干土样水分的测定应做两份平行测定。 4.2 新鲜土样水分的测定:将盛有新鲜土样的大型铝盒在分析天平上称重,准确至0.01g。揭开盒盖,放在盒底下,置于已预热至105±2℃的烘烤箱中烘烤12h。取出,盖好,在干燥器中冷却至室温(约需30min),立即称重。新鲜土样水分的测定应做三份平行测定。 注:烘烤规定时间后一次称重,即达“恒重”。 5计算公式 水分(分析基),%=〔(m1-m2)/(m1-m0)〕×100 (1) 水分(干基),%=〔(m1-m2)/(m2-m0)〕×100 (2) 式中:m0── 烘干空铝盒质量,g;m1── 烘干前铝盒及土样质量,g;m2── 烘干后铝盒及土样质量,g。平行测定的结果用算术平均值表示,保留小数后一位。平行测定结果的相差,水分小于5%的风干土样不得超过0.2%,水分为5~25%的潮湿土样不得超过0.3%,水分大于15%的大粒(粒径约10mm)粘重潮湿土样不得超过0.7%(相当于相对相差不大于5%)。

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板

本科开放项目 题目:产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名: 指导教师: 学院: 专业班级: 2016年3月

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物,是高等植物细胞壁的主要成分,是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计,纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右,仅农业生产中形成的农作物残渣(如稻草、玉米秸、麦秸等),每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点,对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用,大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃,不仅造成资源浪费,而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高,能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重,寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词:纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株

目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)

纤维素酶活力测定

山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶,包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素,CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖,β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原,生成棕红色的氨基化合物,在550nm波长处有最大光吸收,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力(enzyme activity)也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义:1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 (1)722型分光光度计(2)恒温水浴 (3)沸水浴锅 (4)电炉子 (5)剪刀 (6)分析天平(7)试管架 (8)胶头滴管 (9)具塞比色管(25mL×10)(10)移液管(2mL;5mL)(11)烧杯(500mL×3)(12)洗耳球 四、实验材料 (1)纤维素酶:0.05g酶溶解定容至50ml,取1ml再定容至100ml待测(用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制); (2)3、5—二硝基水杨酸显色液; (3)0.5%羧甲基纤维素钠水溶液(CMC):用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置;(4)标准葡萄糖溶液(1mg/mL); (5)蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定:

凯氏定氮法:土壤微生物量氮测定

土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制: (1)混合催化剂:按照硫酸钾:五水硫酸铜:硒粉=100:10:1,称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠:称400g氢氧化钠于烧杯中,加蒸馏水600ml,搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液:称20g硼酸溶于1000ml水中,再加入20ml混合指示剂。(按体 积比100:2加入混合指示剂) (5)混合指示剂:称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色,此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液:取比重1.19的浓盐酸0.84ml,用蒸馏水稀释至 1000ml,用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液:称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中,搅拌溶解,(可加 热)定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制:在通风柜中,量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中,加入200毫升的蒸馏水,加塞,上下振荡10下,打开塞子放气,而后加塞再振荡10下,反复3次,将分液漏斗置于铁架台上,静止溶液分层,打开分液漏斗下端的阀,将下层溶液(氯仿)放入200毫升的烧杯中,将剩余的溶液倒入水槽,用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中,反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中,加入无水分析纯的CaCl2 10g,置于暗处保存。 2.试验步骤:。 (1)制样:称取新鲜土壤(30.0g)于放置烧杯中,加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯,置于真空干燥器中,同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯,密封真空干燥器,密封好的真空干燥器连到真空泵上,抽真空至氯仿沸腾5分钟,静置5分钟,再抽滤5分钟,同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后,抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土:0.5M K2SO4=1:4(烘干土算,一般就是湿土:0.5M K2SO4=1:2),加入0.5M K2SO4溶液(空白直接称取15.0g土,加同样比例0.5M K2SO4溶液)震荡30分钟,过滤。 (2)测定:滤液要是不及时测定,需立即在-15℃以下保存,此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml,采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中,加入2g催化剂,在再加5ml浓硫酸,管口放一弯颈小漏斗,将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化,加热至微沸,关闭高档开关,继续加热。消煮至

土壤各理化指标检测方法

土壤各理化指标检测方法 颗粒分布——比重法 原理: 土样经化学和物理方法处理成悬浮液定容后,根据司笃克斯(Stokes)定律及土壤比重计浮泡在悬浮液中所处的平均有效深度,静置不同时间后,用土壤比重计直接读出每升悬浮液中所含各级颗粒的质量,计算其百分含量,并定出土壤质地名称。并定出土壤质地名称。比重计法操作较简便,但精度较差,可根据需要选择使用。 仪器: 土壤比重计(甲种比重计或鲍式比重计),刻度0-60g/l;量筒,1000ML;锥形瓶500ML;烧杯50ML;洗筛(直径6㎝孔径0.25㎜),土壤筛(孔径2/1/0.5㎜)搅拌棒 试剂: 1、氢氧化钠溶液0.5mol/L(20g氢氧化钠,加水溶解稀释至1000ml) 2、六偏磷酸钠溶液0.5mol/L(51g六偏磷酸钠,加水溶解稀释至1000ml) 3、草酸钠溶液0.5mol/L(33.5g草酸钠,加水溶解稀释至1000ml) 步骤: ①称取通过2mm 筛孔的10g(精确至0.001g)风干土样置于已知质量的50m L 烧杯(精确至0.001g)中,放入烘箱,在105℃烘6h,再在干燥器中冷却后称至恒量(精确至0.001g),计算土壤水分换算系数。 ②称取通过2mm 筛孔的50g(精确至0.01g)风干土样(粘土或壤土50g,砂土100g)置于500m L锥形瓶中。 ③分散土样:根据土壤的p H 值,于锥形瓶中加入50m L 0.5mol/L 氢氧化钠溶液(酸性土壤)、50m L 0.5mol/L 六偏磷酸钠溶液(碱性土壤)或50m L 0.5mol/L 草酸钠溶液(中性土壤),然后加水使悬浮液体积达到250m L 左右,充分摇匀。在锥形瓶上放小漏斗,置于电热板上加热微沸1h,并经常摇动锥形瓶,以防止土粒沉积瓶底成硬块。 ④分离2~0.25mm 粒级与制备悬浮液 大于0.25mm 粒级颗粒用筛分法测定,小于0.25mm 颗粒用比重计法测定。在1000m L 量筒上放一大漏斗,将孔径0.25mm 洗筛放在大漏斗内。待悬浮液冷却后,充分摇动锥形瓶中的悬浮液,通过0.25mm 洗筛,用水洗入量筒中。留在锥形瓶内的土粒,用水全部洗入洗筛内,洗筛内的土粒用橡皮头玻璃棒轻轻地洗擦和用水冲洗,直到滤下的水不再混浊为止。同时应注意勿使量筒内的悬液体积超过1000m L,最后将量筒内的悬浮液用水加至1000m L。 将盛有悬浮液的1000m L 量筒放在温度变化较小的平稳试验台上,避免振动,避免阳光直接照射。 将留在洗筛内的砂粒(2~0.25mm)用水洗入已知质量的50m L 烧杯(精确至0.001g)中,烧杯置于低温电热板上蒸去大部分水分,然后放入烘箱中,于105℃烘6h,再在干燥器中冷却后称至恒量(精确至0.001g)。再将0.25mm 以上的砂粒,通过1.0 及0.5mm 孔径土壤筛筛分,分别称出其烘干质量(精确至0.001g)。 ⑤测定悬浮液温度:取温度计悬挂在盛有1000m L 水的1000m L 量筒中,并将量筒与待测悬浮液量筒放在一起,记录水温(℃),即代表悬浮液的温度。

纤维素酶的检测方法

纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶(EC3.2.1.4)水解羧基纤维素分子中β-1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5-二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6.0试剂的准备 6.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(PH=4.8) 溶液A:量取冰醋酸6ml,定容至1000ml,制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B:称取8.2g醋酸钠,溶解后容至1000ml,制成0.1M醋酸钠溶液。 以A:B=4:6的比例混合,低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g,溶于2500ml热水中,再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合,定容至5000ml,贮存于棕色瓶中,暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液:用羧甲基纤维素钠(CMC)以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7.0标准曲线制作: 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中,加10mg叠氮化钠防腐,4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作

土壤PH的测定

土壤酸碱度的测定 一、土壤pH的测定 pH的化学定义是溶液中H+离子活度的负对数。土壤pH是土壤酸碱度的强度指标,是土壤的基本性质和肥力的重要影响因素之—。它直接影响土壤养分的存在状态、转化和有效性,从而影响植物的生长发育。土壤pH易于测定,常用作土壤分类、利用、管理和改良的重要参考。同时在土壤理化分析中,土壤pH与很多项目的分析方法和分析结果有密切关系,因而是审查其他项目结果的一个依据。 土壤pH分水浸pH和盐浸pH,前者是用蒸馏水浸提土壤测定的pH,代表土壤的活性酸度(碱度),后者是用某种盐溶液浸提测定的pH,大体上反映土壤的潜在酸。盐浸提液常用 溶液,在浸提土壤时,其中的K+或Ca2+即与胶体表面1molL-1 KCl溶液或用0.5 molL-1 CaCl 2 吸附的Al3+和H+发生交换,使其相当部分被交换进入溶液,故盐浸pH较水浸pH低。 土壤pH的测定方法包括比色法和电位法。电位法的精确度较高。pH误差约为0.02单位,现已成为室内测定的常规方法。野外速测常用混合指示剂比色法,其精确度较差,pH 误差在0.5左右。 (一)混合指示剂比色法 1、方法原理:指示剂在不同pH的溶液中显示不同的颜色,故根据其颜色变化即可确定溶液的pH。混合指示剂是几种指示剂的混合液,能在—个较广的pH范围内,显示出与一系列不同pH相对应的颜色,据此测定该范围内的各种土壤pH。 2、操作步骤:在比色瓷盘孔内(室内要保持清洁干燥,野外可用待测土壤擦拭),滴入混合指示剂8滴,放入黄豆大小的待测土壤,轻轻摇动使土粒与指示剂充分接触,约1分钟后将比色盘稍加倾斜用盘孔边缘显示的颜色与pH比色卡比较,以估读土壤的pH。 3、混合指示剂的配制:取麝草兰(T.B)0.025克,千里香兰(B.T.B)0.4克,甲基红(M.R)0.066克,酚酞0.25克,溶于500ml 95%的酒精中,加同体积蒸馏水,再以0.1molL-1 Na0H调至草绿色即可。pH比色卡用此混合指示剂制作。 (二)电位测定法 1、方法原理:以电位法测定土壤悬液pH,通用pH玻璃电极为指示电极,甘汞电极为参比电极。此二电极插入待测液时构成一电池反应,其间产生一电位差,因参比电极的电位是固定的,故此电位差之大小取决于待测液的H+离子活度或其负对数pH。因此可用电位计测定电动势。再换算成pH,一般用酸度计可直接测读pH。 2、操作步骤:称取通过1mm筛孔的风干土10克两份,各放在50ml的烧杯中,一份加 蒸馏水,另一份加1molL-1 KCl溶液各25ml(此时土水比为1:2.5,含有机质的土壤改无C0 2 为1:5),间歇搅拌或摇动30分钟,放置30分钟后用酸度计测定。 附:PHS-3C型酸度计使用说明 (一)准备工作 把仪器电源线插入220V交流电源,玻璃电极和甘汞电极安装在电极架上的电极夹中,将甘汞电极的引线连接在后面的参比接线柱上。安装电极时玻璃电极球泡必须比甘汞电极陶瓷芯端稍高一些,以防止球泡碰坏。甘汞电极在使用时应把上部的小橡皮塞及下端橡皮套除下,在不用时仍用橡皮套将下端套住。 在玻璃电极插头没有插入仪器的状态下,接通仪器后面的电源开关,让仪器通电预热30分钟。将仪器面板上的按键开关置于mv位置,调节后面板的“零点”电位器使读数为±0之间。

实验3 土壤理化性质测定与分析

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 实验3 土壤理化性质测定与分析 实验 3 土壤理化性质测定与分析1 土壤样品的采集和制备土壤样品的采集是否具有代表性,是决定分析结果能否正确反映土壤特性的关键。 因此,采集的土壤样品必须具有代表性,以确保土壤质量分析结果的正确性。 从田间采集来的土壤样品不可直接进行化学分析,需经过筛或风干过筛等处理后方可进行分析。 因此,在风干过筛处理中保持最小的误差是同样的重要。 本实验的目的在于通过土壤样品采集的实践,使学生更好地掌握采集具有代表性土壤样品的技能和合理处理样品的技能。 1.1 土壤样品的采集 1.1.1 耕层混合土壤样品的采集(1)确定采样单元根据有关资料和现场勘查后,将采样区划分为数个采样单元,每个采样单元的图类型,肥力状况和地形等因素要尽可能均匀一致。 (2)确定采样点数及采样点位置采样点数的确定,取决于采样区域的大小、地块的复杂程度和所要求的精密度等因素,一般以 5-20 个为宜。 采样点位置的确定要遵循随机布点的原则,常采用“S”型布点方式,该方式能较好地克服耕作、施肥等农业措施造成的误差。 但在采样单元面积较小,地形变化较小,地力较均匀的情况下 1/ 14

也可采用对角线(或梅花)形布点方式。 为从总体上控制采样点的代表性,避免在堆过肥的地方和田埂,沟边以及特殊地形部位采样。 (3)各采样点土样的采集遵循采样“等量”的原则,即每点所采土样的土体的宽度、厚度及深度均相同。 使用采样器采样时应垂直于地面向下至规定的深度。 用取土铲取样应先铲出一个耕层断面,再平行于断面下取土。 (4)混合土样的制备将个点采集的土样集中在一起,尽可能捏碎,混均;如果采集的样品数量过多,可用四分法将多余的土样弃去,以取 1kg 为宜。 其方法是将混均的土样平铺成四方形,划对角线将土样分成四份,将其中一对角线的两份弃去,如所剩样品仍很多,可重复上诉方法处理,知道所需数目为止。 采集含水较多的土样时(如水稻土),四分法很难使用,可将各样点采集的烂泥状样品搅拌均匀后,再取出所需数量。 将采好的土样装袋,土袋最好采用布制的,以保持通气。 (5)制作采样标签及采样记录选用耐浸润的纸签(牛皮纸或硫酸纸),用铅笔在标签上注明采样地点,日期,采样深度,土壤名称,编号及采样人等,一式两份,土袋内外各放一份。 同时做好采样记录。 1.1.2 土壤剖面样品的采集即按土壤发生层次的采样。 首先在能代表研究对象的采样点挖掘1× 1.5m 左右的长方形土

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖  H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490~580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490~500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

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