抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：
1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺
9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。
操作要点
第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。
溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。
标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。
试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。
一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。
试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。
加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。
在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃。
放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。
抗生素原料药：不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或μg/mg）表示。检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定。
粉针剂：指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或μg/mg）或整瓶效价。
取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。
水针剂（注射液）：即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。
效价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。
素片、薄膜衣片：称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。再量取适量稀释至规定浓度。
注意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加
以注意。为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。
糖衣片、肠溶片：取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。
胶囊剂：取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。
颗粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。量取适量稀释制成供试品溶液。测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平均每袋（包）的效价，根据标示量即可算出含量。
软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗，带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，依法操作，计算效价。
实验要点
磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇
主要问题：抑菌圈偏小
解决：
1. pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）
2. 滴加药液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。
3. 培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量。
啤酒酵母菌的培养
主要问题：生长不良
CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面
解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时
沙氏培养基
蛋白胨10g 葡萄糖40g
琼脂13g 水1000ml
调节灭菌后pH5.4～5.8
YPD培养基
蛋白胨10g 葡萄糖40g
酵母粉5g 琼脂13g
水1000ml
管碟法特点：
优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。
缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。
管碟法抗生素效价测量
管碟法抗生素效价测量 - 简介
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
管碟法抗生素效价测量 - 原理
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于 MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。北京潮声公司具有同行业的领先水平。
在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下：
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法【1】，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响
结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
管碟法抗生素效价测量 - 实验
1. 实验器材的准备
1.1 实验器材的选择
试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗
抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160℃干热灭菌2h 后备用。
2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基
2.1 样品与标准品溶液的配制
标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供试品应放于干燥器内至少30min 方可称取。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。
2.2 培养基与缓冲液的配制
配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。因为在
pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是
可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响【2】。培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定，可比性较强。116℃湿热灭菌20min后备用。
3. 加注培养基
3.1 加注底层培养基
无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。
试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注60～80℃的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。
3.2 加注培养基菌层
制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50℃水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养
基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温。试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带
菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。
4. 放置小钢管
放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。小钢
管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5. 滴加抗生素溶液
滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL （三剂量法）的顺序滴加【3】。滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗 3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。
6. 双碟中菌株的培养
滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在37℃下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。
7. 抑菌圈测量
7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm 的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈
变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。
管碟法测定抗生素效价
双击自动滚屏发布者：admin 发布时间：2008-4-3 阅读：
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一、目的和要求
1、了解管碟法的原理。
2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。
二、原理
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
三、实验材料
1、四环素类抗生素的标准品和样品。
2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。
3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。
4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。
5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。
四、实验实施
1、配制标准品溶液
2、配制样品溶液
3、制备菌悬液。
4、制备平板：
（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。
（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。
5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。
6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。
7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。
8、用游标卡尺测量抑菌圈直径
5. 多粘菌素E 效价测定
本实验用不同浓度的多粘菌素E 溶液作标准曲线，以抑菌圈直径的平方值为横坐标，多粘菌素E标准品效价的对数值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。具体作法如下：(1) 大肠杆菌菌悬液制备取活化的大肠杆菌A1.543 菌种接种于大肠杆菌活化培养基斜面，37℃培养24 h，然后每支斜面加无菌生理盐水10 mL，刮下菌苔，搓匀。
(2) 倒底层平板将灭菌的2%琼脂水底层培养基加热融化后，冷凉至45~50℃左右，倾倒入培养皿制成底层平板，每人2～3 个，凝固后于皿底贴上标签。
(3) 制备混菌上层平板将检测用上层培养基加热融化后，冷凉至50℃左右，50 mL 上层培养基加入大肠杆菌菌悬液0.5mL，轻轻摇匀。在每一培养皿底层平板上加入10 mL 混菌上层培养基(动作迅速，以免培养甚中琼脂凝固；倾倒上层培养基时不要有气泡。若有气泡应赶到平板边缘)，凝固后成上层平板即为双碟备用。制备双碟时必须在水平的桌面上，并选择平底的培养皿。贴好标签的培养皿，放于白瓷盘上。
(4) 滴加多粘菌素E 标准品和样品先将10 000 u／mL 的标准多粘菌素E，用1/15mol ／L pH 6.0磷酸缓冲液稀释成800、1000、1200 u／mL。根据酸化后滤液颜色粗略估计发酵样品效价，用1/15 mol/LpH 6.0 的磷酸缓冲液稀释至1000 u／mL。每人取制备好的2～3 个双碟，打开皿盖，用无菌镊子夹取已灭菌的钢管(牛津杯)，每个双碟中放置钢管6 个(如图5－1～2 所示)。其中相间隔的3 个钢管滴加多粘菌素E 标准液。另外3 个钢管滴加发酵液样品。A 管中用无菌滴管滴加多粘菌素E 800 u／mL 的标准液，B 管滴加多粘菌素E 1000 u/mL的标准液，C 管滴加多粘菌素E 1200 u／mL 的标准液，D 管滴加发酵样品稀释液。滴加时必须仔细小心，勿在小钢管中形成气泡，勿使溶液流出管外，加的量各管要一致，恰好滴满。滴加完毕后，加上灭菌陶瓷盖。将放双碟的白瓷盘小心平端于37℃恒温箱内，培养6～8 h 后取出。
(5) 抑菌圈直径的测量及校正将双碟中的钢管倒入白瓷缸中，加洗涤灵和水，然后煮沸0.5 h，清水冲洗晾干。用玻璃皿盖换下白陶瓷盖，然后用卡尺测量双碟中每管抑菌圈的直径。
一、目的： 二、范围： 本标准适用于样品羟值的测定。 三、职责： 1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录； 2、化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。 四、内容： 1、定义：羟值系指供试品1g中含有的羟基，经用以下方法酰化后，所需氢氧化钾的重量(mg)。 1.1仪器： 电子天平（万分之一）、具塞锥形瓶（250ml）、胖肚移液管（5ml,A级）、量筒（20ml）、恒温水浴锅、碱式滴定管（50ml,A级）、滴管。 1.2试剂： 1.2.1吡啶AR 1.2.2氢氧化钠滴定液（1mol/L）：见EK/SOP-QC8005氢氧化钠滴定液（1、0.5、0.1mol/L）配制与标定操作规程 1.2.3甲酚红-麝香草酚蓝混合指示液：见EK/SOP-QC8003指示剂与指示液配制操作规程1.2.4吡啶-水（3：5）：取吡啶30ml和水50ml混合均匀，即得。 1.2.5酰化剂：取对甲苯磺酸14.4g，置500ml碘瓶中，加乙酸乙酯360ml，振摇溶解后，缓缓加入醋酐120ml，摇匀，放置3日后备用。 1.3测定方法： 除另有规定外，按表中规定的重量，精密称取供试品，置250ml的干燥碘瓶中，精密加入酰化剂5ml，用吡啶少许湿润瓶塞，稍拧紧，轻轻摇动使完全溶解，置50℃±1℃水浴中25分钟（每10分钟轻轻摇动）后，放冷，加吡啶-水（3：5）20ml，5分钟后加甲酚红-麝香草酚蓝混合指示液8～10滴，用氢氧化钾（或氢氧化钠）滴定液（1mol/L）滴定至溶液显灰蓝色或蓝色；同时做空白试验。 1.4计算结果： D W F 1. 56 A - B + ? ? = ） （ 供试品的羟值 式中： B为空白试验消耗氢氧化钠滴定液（1mol/L）的体积（ml）； A为供试品消耗氢氧化钠滴定液（1mol/L）的体积（ml）； 羟值检验操作规程 编写/修订人/日期年月日部门/姓名 审核人/日期年月日部门/姓名 批准人/日期年月日部门/姓名 执行日期2020年11月01日颁发部门品质部 分发部门品质部
2005年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指含量小于0.015EU/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0—8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M 式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg2h)表示，注射剂K=5E U/(kg2h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg2h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg2h)；
发布日 20070423 期 栏目 化药药物评价>>化药质量控制 标题 抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析 作者 审评三部 部门 正文容 审评三部审评五室英 摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液 浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。 关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性； ②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组 成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。 一、方法的建立 1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方
法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。 2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择 可参照中国药典建立，在此不再赘述。 3、检定方法的确定 可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。 4、抗生素溶液的稳定性 选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条 件。 二、方法的验证 验证的目的是证明采用的方法适合于检测的要求。 验证容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、专属性、适用性和线性。 在申报资料中常见的错误有：线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理；精密度的测定方法不正确；无专属性试验。下面就方法验证的容与常见的错误加以简述。 1、专属性考察杂质、辅料等对测定结果准确性的影响，可通过以下试验验证： (1) 用辅料等替代抗生素进行试验，应不产生抑菌作用。 (2) 采用回收率试验进行验证，至少有9对以上数据，并进行显著性检验。
《中国药典》2005年版一部值得商榷问题探讨 黄勤挽1，陈文文1，郝柳妮2 1 成都中医药大学（611731） 2四川维奥制药有限公司（611130） E-mail ：hqwan2163@https://www.doczj.com/doc/6212073223.html, 摘 要：本文对《中国药典》2005年版一部某些值得商榷的问题进行探讨，结合自身学习心得并参考网络论坛中某些观点和勘误表，认为槐花性状、对照品称量等问题需要完善或修订。通过探讨，可为2006年版《中国药典》（2005年版修订本）进言。 关键词：《中国药典》2005年版，槐花性状，对照品称量，问题探讨 1．引言 《中国药典》2005年版已于2005年7月1日正式使用，部分值得商榷的问题已见报道[1]。国家药典委员会于2005年9月2日在网上颁布了一、二、三部勘误表，修订了部分出错问题。笔者发现一部仍存在部分未勘误的问题，对其进行归纳探讨。 2．值得商榷的问题 2.1 性状方面 药典收载的有不同入药部位的品种其性状多为分别描述，而蒲黄项下却未对草蒲黄（带有雄花的花粉）规格的性状进行描述。槐花项下性状为“雄蕊10，其中9个基部连合，花丝细长”。而《中国中药材真伪鉴别图典》槐花性状为“雄蕊10枚，基部稍联合，花丝细长”，伪品刺槐花性状为“雄蕊10枚，两体，分别为9个联合成鞘状，另一个上部离生或部分离生”；《中华本草》中槐花性状为“雄蕊10，分离，不等长”。故疑药典中槐花的性状有误。 [2][3][4]2.2 制法方面 刺五加浸膏为制备刺五加片的原料，来源为“刺五加加工制成的浸膏。用水提者为水浸膏，用醇提者为醇浸膏”。其制法为“取刺五加药材1000g ，粉碎成粗粉，用水煎煮两次，每次3小时，……；或加75％乙醇，回流提取12小时，……”。笔者提出三个疑问：药材粗粉水煎，大生产滤过有无困难？刺五加水浸膏和醇浸膏的物质基础及药效是否等同？企业从生产成本考虑是否会采取成本较高的醇提？刺五加浸膏始见于77版药典，直到2000版药典其制法均只有醇提。05版药典网上征求意见稿中新增的“刺五加提取物”，实为水浸膏工艺。在药典定稿后将两者合二为一，可能会给刺五加浸膏及刺五加片的生产、检验带来波动。 [5]2.3 含量测定方面 2.3.1 对照品称量 药典凡例规定“精密称定是指称取重量应准确至所称取重量的千分之一”。目前制药企业、药检所、科研院校大多仅有十万分之一的电子天平，少有百万分之一的电子天平，按精密称定要求，需称取10mg 以上方能称准。但马钱子、半枝莲、血竭、蒲公英、蓼大青叶、七厘散、午时茶颗粒等项下对照品的称量在10mg 以下。 [6]2.3.2 供试品制备粉末等级
《中国药典》2005年版附录总结 《中国药典》2005年版附录 一、《中国药典》增加了第三部《中国生物制品规程》，内容逐步与ICH协调一致，剂型种类增加，有些检验项目（如口服制剂的“微生物限度检查”）不作为必检项目，只做一般性要求，但抽检还是要检的。并与国际其它药典（如USP，BP，EP，日本药方局等）接轨，如无菌项目检查周期为14天。 二、《中国药典》二部增修订情况 2.1片剂: 1)删除“速释片”，增加“可溶片”，增加缓释片，控释片定义。 2)结肠定位肠溶片改为在pH7.5(原为7.8)－８.0的磷酸盐缓冲液释放。 3）片剂脆碎度不作为必检项目，只做一般性要求。 4）微生物限度（除口腔贴片等）不作为必检项目，只做一般性要求。 2.2 注射剂： 1）重新分类并定义：注射液，静脉输液，注射用无菌粉末。（原为静脉滴注用注射液，注射用混悬液，注射用无菌粉末） 2）增：除另有规定外，一次注射量超过15ml的注射液，不得加抑菌剂。 3）增：容器的密封性，需用适宜的方法确证。 4）增：“可见异物”检查（原为：澄明度） 5）增：注射用无菌粉末增加“不溶性微粒”检查。 2.3 栓剂: 1)分类详细:直肠栓,阴道栓,尿道栓,中空栓,缓释栓. 2)增:缓释栓进行释放度检查(但现无方法) 3)增:微生物限度检查. 2.4 胶囊剂: 1)分类更加清楚. 2)肠溶胶囊增加:也可用经肠溶材料包衣的颗粒或小丸 填充胶囊. 3)硬胶囊内容物增加:小片,肠溶小丸.肠溶胶囊不作为 分类,而用肠溶小丸装胶囊。溶液、混悬液、乳液也可用特制灌装机填充于空心胶囊中。 4）储存条件增：湿度应适宜。 5）原则性要求：硬胶囊应进行水分检查。 2.5软膏剂、乳膏剂、糊剂： 1）增：乳膏剂，糊剂 2.6 眼用制剂; 1)分类详细:液体、半固体、固体制剂（原为滴眼剂） 2)增：滴眼剂、眼内注射溶液“可见异物”检查。
凡例(2005年版一部) 凡例 《中华人民共和国药典》简称《中国药典》是国家监督管理药品质量的法 定技术标准。《中国药典》一经国务院药品监督管理部门颁布实施，同品种 的上版标准或其原国家标准即同时停止使用。除特别注明版次外，《中国药 典》均指现行版《中华人民共和国药典》 "凡例"是解释和使用《中国药典》正确进行质量检定的基本指导原则， 并把与正文、附录及质量检定有关的共性问题加以规定，避免在全书中重 复说明。"凡例"中的有关规定具有法定的约束力。 凡例和附录中采用"除另有规定外"这一修饰语，表示存在与凡例或附录 有关规定未能概括的情况时，在正文各论中另作规定，并按此规定执行。 药典中引用的药品系指本版药典收载的并符合规定的品种。 附录中收载的指导原则，是为执行药典、考察药品质量、起草与复核药 品标准所制定的指导性规定。 名称及编排 一、本部正文分三部分排列：药材及饮片；植物油脂和提取物；成方制剂 和单味制剂。 二、正文品种中文名称按笔画数顺序排列，同笔画数的字按起笔笔形─ 丨ノ丶フ顺序排列；单列的饮片排在相应药材的后面，制剂中同一品种凡因规 格不同而臻主标准内容不可须单列者，在其名称后加括号注明规格；附录包括 制剂通则、通用检测方法和指导原则，按分类编码；索引分别按中文索引、汉 语拼音索引、拉丁名索引和拉丁学名索引顺序排列。 三、每一品种项下根据品种和剂型不同，按顺序可分别列有： ⑴中文名称（必要时用括号加注副名），汉语拼音名与拉丁名；⑵来源； ⑶处方；⑷制法；⑸性状；⑹鉴别；⑺检查；⑻浸出物；⑼含量测定；⑽性 味与归经；⑾功能与主治；⑿用法与用量；⒀注意；⒁规格；⒂贮藏；⒃制 剂等。 项目与要求 四、药材的质量标准，一般按干品规定，特殊需用鲜品者，同时规定鲜 品的标准，并规定鲜品用法与用量。 五、药材原植（动）物的科名、植（动）物名、学名、药用部位（矿物 药注明类、族、矿石名或岩石名、主要成分）及采收季节和产地加工等，均 属各该药材的来源范畴。 药用部位一般系指已除去非药用部分的商品药材。采收（采挖等）和产 地加工即对药用部位而言。 六、药材产地加工及炮制规定的干燥方法如下：(1) 烘干、晒干、阴干均
一、目的： 制订详尽的工作程序，规范检验操作，保证检验数据的准确性。 二、范围： 本标准适用于参考美国药典标准检验品种重金属的测定。 三、职责： 1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录； 2、化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。 四、内容： 1、特殊试剂: 1.1硝酸铅原液:将159.8毫克的硝酸铅溶于100毫升水中，加入1毫升硝酸，然后用水稀释至1000毫升。制备此溶液并将其储存在无可溶性铅盐的玻璃容器中。 1.2标准铅溶液:临用新制，用水稀释10.0毫升硝酸铅原液至100.0毫升。每毫升标准铅溶液含有相当于10微克的铅。以每克被测物质100微升标准铅溶液为基础制备的对比溶液包含相当于每百万份被测物质1部分的铅。 2、方法一: 2.1 pH 3.5乙酸盐缓冲液:溶解25克醋酸铵在25毫升水中，加入6mol/l盐酸38毫升。如果需要调节，可用6mol/l氢氧化铵或6mol/l盐酸调节pH值为3.5，用水稀释至100毫升，并混合。 2.2标准制备:将标准铅溶液（20微克铅）2毫升放入50毫升比色管中，用水稀释至25毫升。使用pH计或短程pH指示纸作为外部指示剂，用1mol/l乙酸或6mol/l氢氧化铵调节到 3.0到 4.0之间的pH，用水稀释至40毫升，混匀。 2.3供试品制备:按照各专著的指示，将试验准备的溶液放入50mL比色管中，或使用各专著中指定体积的酸，溶于水中，用水稀释至25mL，单位为按公式计算的待测物质： 2.0/（1000L） 其中L是重金属限度，占百分数。使用pH计或短程pH指示剂纸作为外部指示剂，用1mol/l 乙酸或6 mol/l氢氧化铵调节pH值在3-4之间，用水稀释至40毫升，并混合。 2.4 监测制备:在第三根50mL比色管中，放入按供试品制备指示制备的溶液25mL，并加入2.0mL标准铅溶液。使用pH计或短程pH指示剂纸作为外部指示剂，用1mol/l乙酸或6mol/l氢氧化铵调节pH值在3-4之间，用水稀释至40毫升，并混合。 2.5方法:在含有标准制剂、供试品制剂和监测制剂的三个试管中，加入2毫升pH 3.5的乙酸缓冲液，然后加入1.2毫升硫代乙酰胺-甘油基TS，用水稀释至50毫升，混合，静置2分钟，在白色表面向下观察：来自试验制剂的溶液的颜色不比来自标准制剂的溶液的颜色深，来自监测制剂的溶液的颜色等于或比来自标准制剂的溶液的颜色深。[注--如果监视器制剂的颜色比标准制剂的颜色浅，则对被测试物质使用方法II而不是方法I]。 3、方法二： 3.1注：此方法不回收汞。
化药药物评价>>化药质量控制 从中国药典2005年版的变更谈化学药品注册标准的规范书写-20070717 郑国钢 审评四部郑国钢 药品质量标准是否科学、合理、可行，直接关系到药品质量的可控性、安全性和有效性。规范地书写质量标准对保障药品安全有效，提高技术审评的质量和效率更有非常现实的意义。下面谈谈中国药典2005年版与旧版药典比较某些名词和检验过程描述的变更，希望引起注册申请人的注意。 1、附录更名：①制剂通则中IF软膏剂、IS洗剂、IT搽剂更名为IF软膏剂/乳膏剂/糊剂、IS 洗剂/冲洗剂/灌肠剂、IT搽剂/涂剂/涂膜剂，据此部分制剂需按新制剂通则命名，如丁酸氢化可的松软膏需更名为丁酸氢化可的松乳膏。②IXC 注射液中不溶性微粒检查法更名为IXC 不溶性微粒检查法，其中微粒检查用净化水改为微粒检查用水；③IXE 粒度测定法更名为IXE 粒度和粒度分布测定法；④VH 多糖的分子量与分子量分布测定法更名为VH 分子排阻色谱法；⑤IVA 紫外分光光度法更名为IVA 紫外-可见分光光度法，并将比色法并入，将测定结果“吸收度”规范为“吸光度”。 2、性状：①着色片不再描述具体颜色, 薄膜衣片删去颜色的描述。如复方甲苯咪唑片现描述为着色片（原为粉红色片），但对某些不同着色可能干扰含量测定（如影响滴定中指示剂颜色变色观察）的片剂，则必须明确颜色；②过度色包含在颜色的描述中，避免用“或”引起过渡颜色缺失而导致结果误判。如硫酸锌颗粒现规范为白色、类白色至略带微黄色的颗粒（原为白色、类白色或略带微黄色的颗粒）；③胶囊剂性状统一仅描述内容物，如盐酸乙胺丁醇胶囊性状原为“胶囊剂，内容物为…”，现描述为“内容物为…”。软胶囊不再称为胶丸，如2005年版新增软胶囊（十一酸睾酮软胶囊、辅酶Q10软胶囊）均不再称为胶丸；④栓剂不描述形状；⑤颗粒剂在性状中增加可溶与混悬型等描述, 以此判断是否需进行溶化性检查。头孢拉定颗粒原为“加矫味剂的颗粒；气芳香，味甜”，现描述为“混悬颗粒；气芳香，味甜”。⑥起草注册标准时，原料药性状中注意区分“结晶性粉末”和“粉末”之间的区别；胶囊中内容描述注意区分“颗粒或粉末”
抗生素微生物测定法操作规程 1．目的：建立抗生素微生物测定操作规程，便于操作者正确进行抗生素效价测定。2．适用范围：适用于抗生素的效价测定。 3．责任人：QC质量检验员 4．正文： 4.1 仪器设备与试液： 4.1.1 仪器设备 4.1.1.1 操作室：应在抗生素检定室中进行。 4.1.1.2 超净工作台：（用于菌种的接种或传代） 4.1.1.3 恒温培养箱：隔板上可备有带孔的玻璃板并垫平。 4.1.1.4 电热鼓风干燥箱 4.1.1.5 电热压力蒸汽灭菌器 4.1.1.6 电热恒温水浴锅 4.1.1.7 天平：分析天平，感量0.1mg 4.1.1.8 游标卡尺：精度0.05mm，长度125mm。 4.1.1.9 双碟：为硬质玻璃培养平皿，内径90mm，高16～17mm，碟底厚薄均匀水平，无气泡。 4.1.1.10 陶瓦盖：内径约130mm，外径108mm，平坦，吸水性强。 4.1.1.11 钢管：内径（6.0±0.1）mm 或（7.8±0.1），高（10.0±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦，管壁厚薄一致。 4.1.1.12 钢管放置器：置于半无菌操作间内，应保持清洁，防止抗生素污染。可定期按钢管放置器操作规程进行消毒。 4.1.1.13 毛细滴管：用玻璃管拉制，管口光滑。 4.1.1.14 称量瓶：25ml、50ml、100ml、200ml、250ml 4.1.1.15 刻度吸管：1ml、2ml、5ml、10ml、20ml 4.1.1.16 移液管2ml、5ml、10ml、20ml 4.1.1.17 其他玻璃仪器 4.1.2 试液： 41.2.1 缓冲液、磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.8） 4.1.2.2 生理盐水 4.1.2.3 0.1%新洁尔灭 4.1.2.4 5%石炭酸 4.1.2.5 75%乙醇溶液（配制酒精棉球用） 4.1.2.6 3%煤酚皂溶液
—、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。 二、 引用标准：《中国药典》( 通则1105-1106) 三、 目录1.微生物限度标准 2.设备.仪器及用具 3?消毒液、稀释剂.试液及培养基 4. 检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查：微生 物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法) 5. 微生物计数法检查 6. 控制菌检查法 7. 实验技术 &附件 1. 微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准 *未做统一规定。 L1成品微生物限度标准
(1).” 一”为不得检出。 (2).目测霉变者以不合格论。 (3).”无”为标准依据或无相应规定。 1.2工艺用水微生物限度标准 1.3内包装材料微生物限度标准 说明：1?”一”为每100 cm2中不得检出。2.目测霉变者以不合格论。3.”无”为标准依据或无相应规定。 2.设施、仪器及用具
2.1、设施： 2丄1?微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台直及环境应定期进行监测。 2.12其它设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30?35?）;霉菌培养箱（25-280 ；电炉（或其它适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300匕）；电冰箱。生化试剂储存箱。 2.2仪器及器mi 2.2.1.菌落计数器；显微镜（1500X）;电子天平或药物天平（感量O.lg）; pH系列比色计。 222?玻璃器皿：锥形瓶（250?300ml,内装玻璃珠若干）.研钵（玻璃或陶瓷制,f 10?12cm）、培养皿（f 9cm）.量筒（100ml）.试管（18x 180mm）及塞、吸管（lml分度0.01, 10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%?2%盐酸（工业用）液中约2?6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重洛酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2?3次，晾干备用。 2.3用过的玻璃器皿： 231未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外， 可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备 用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗 2~3 次。
QCA/QC-SOP-006 1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2010年版二部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生 素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或 用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时 备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
2005年版《中国药典》（二部）试药（一） 本试药系指在2005年版《中国药典》（二部）中供各项试验用的试剂，不包括各种色谱用的吸附剂、载体与填充剂。除生化试剂与指示剂外，一般常用化学试剂分为基准试剂、优级纯、分析纯与化学纯4个等级，选用时可参考下列原则： (1) 标定滴定液用基准试剂； (2) 制备滴定液可采用分析纯或化学纯试剂，但不经标定直接按称重计算浓度者，则应采用基准试剂； (3) 制备杂质限度检查用的标准溶液，采用优级纯或分析纯试剂； (4) 制备试液与缓冲液等可采用分析纯或化学纯试剂。 一水合碳酸钠 Sodium Carbonate Monohydrate [Na2CO3·H2O＝124.00] 本品为白色斜方晶体；有引湿性，加热至100℃失水。在水中易溶,在乙醇中不溶。 一氧化铅 Lead Monoxide [PbO＝223.20] 本品为黄色至橙黄色粉末或结晶；加热至300～500℃时变为四氧化三铅，温度再升高时又变为一氧化铅。在热的氢氧化钠溶液、醋酸或稀硝酸中溶解。 一氯化碘 Iodine Monochloride [ICl＝162.36] 本品为棕红色油状液体或暗红色结晶；具强烈刺激性，有氯和碘的臭气；有腐蚀性和氧化性。 乙二胺四醋酸二钠 Disodium Edetate [C10H14N2Na2O8·2H2O＝372.24] 本品为白色结晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中极微溶解。 乙氧基黄叱精 Ethoxychrysoidine Hydrochloride [C14H16N4O·HCl＝292.77] 本品为深红棕色或黑褐色粉末。在水或乙醇中溶解。 乙腈 Acetonitrile [CH3CN＝41.05] 本品为无色透明液体；微有醚样臭气；易燃。与水或乙醇能任意混合。
一、湿热灭菌法 本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微 生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法灭菌能力强， 为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌 衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭 菌。流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭 菌手段。 湿热灭菌条件通常采用121℃*15min、121℃*30min、或116℃*40min的程序，也可采用其他温度和时间参数，但必须保证物品灭菌后的SAL《10-6。对热稳定的物 品，可采用过度杀灭法，其SAL应《10-12。热稳定性较差产品的标准灭菌时间 F0［指灭菌温度为121℃，生物指示菌的耐热参数D值为1分，灭菌温度系数Z值 为10.0℃时的标准灭菌时间（121℃下计算的微生物等效灭活率）］一般不低于 8min。如产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F0低于8，此情况下，应在 生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施降低微生物 污染水平，确保被灭菌产品达到无菌保证要求。 采用湿热灭菌时，被灭菌物品有适当的装载方式，不能排列过密，以保证灭 菌的有效性和均一性。 湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂进 一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。本法生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆 菌孢子（spores of Bacillus stearothermophilus）。 二、干热灭菌法 本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气 达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法 灭菌的物品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状 石蜡等均可采用本法灭菌。 干热灭菌条件一般为160~170℃*120min以上、170~180℃*60min以上或250℃*45min 以上，也可采用其他温度和时间参数。应保证物品灭菌后的SAL《10-6。干热 过度杀灭后物品的SAL应《10-12，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生物的 测定。250℃*45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具 中的热原物质。 采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证 灭菌的有效性和均一性。 干热灭菌法应确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准及确定最冷点位置等。 常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus subtilis ）。细菌内毒素 灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将小于1000单位的细菌内 毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数 单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素(Escherichia coli endoxin )。 三、辐射灭菌法 本法系指灭菌物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生 的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的60Co-γ射线 辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品 等均可用本法灭菌。
微生物检验规程 1.实验注意事项 1.1无菌操作要求 1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 1.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。1.2无菌间使用要求 1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 1.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 1.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 1.3消毒灭菌要求 1.3.1灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。
2005版中国药典收载的氨基酸原料药 L-胱氨酸的生产方法有：提取、发酵、合成；主要用途有：促进毛发生长，防治肝炎，增加巨细胞。 L-谷氨酸的的生产方法有：合成、发酵；主要用途有：改善高血氨症状，治疗肝昏迷。 L-门冬氨酸的生产方法有：酶工程；主要用途有：离子载体、促进尿素生成，降血氨。 L-甘氨酸的生产方法有：合成；主要用途有：治疗肌肉疾病，胃酸过多症，促进脂肪代谢。L-色氨酸的生产方法有：提取合成；主要用途有：改善脑神经功能，促进红细胞再生，乳汁合成。 L-络氨酸的生产方法有：提取、发酵；主要用途有：治疗震颤性麻痹症，改善肌肉运动。 L-苏氨酸的生产方法有:发酵、合成、酶工程；主要用途有：促进生长发育，抗脂肪肝，治疗贫血。 L-亮氨酸的生产方法有：提取、发酵、合成；主要用途有：改善营养状态，维持脂肪正常代谢。 L-异亮氨酸的生产方法有：发酵、酶工程；主要用途有：促进蛋白质、激素合成、促进生长发育。 乙酰半胱氨酸的主要生产方法有：合成；主要用途有：溶解粘液，祛痰。 牛磺酸的生产方法有：合成；主要用途有：抗心肌缺铁损伤，抗癫痫。 L-丙氨酸的生产方法有：提取、酶工程；主要用途有：组成复合氨基酸注射液积口服液等的原料。 L-谷氨酸的生产方法有：发酵；主要用途有：促进氨代谢i，促进红细胞生成，抗癫痫。 甲硫氨酸的生产方法有：合成；主要用途有：参与体内生物合成与代谢，调节中枢神经系统。L-精氨酸的生产方法有：提取；主要用途有：促进尿素循环，治疗按昏迷。 L-门冬酰胺的生产方法有：酶工程；主要用途有：辅助治疗乳腺小叶增生。 L-结氨酸的生产方法有：提取；主要用途有：作为营养补剂，促进蛋白质合成。 L-组氨酸的生产方法有：提取、发酵；主要用途有：镇静副交感神经，治疗消化性溃疡。 L-丝氨酸的生产方法有：提取、合成；主要用途有：作为营养补剂，解除疲劳，恢复体力 L-脯氨酸的生产方法有：发酵、合成；主要用途有：参与能量代谢及解毒作用
抗生素微生物检定法 --------2017 1 简述 抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。《中国药典》也采用这两种方法。 抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混匀后，经培养，测量培养基的浊度。此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度(浊度与细菌数量、细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系)之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。 抗生素效价以“单位(u)”或“微克(μg)”表示。 抗生素管碟测定法 2 仪器与用具 2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级~10000级）及空调设备，控制室温在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内抗生素污染。 2.2 双碟内径约90mm , 高16~17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
抗生素微生物检定管碟法 抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。 此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。 原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。 管碟法的操作步骤： 1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。 2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。 3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。 4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。 5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。 6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。 8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺 9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。 操作要点 第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。 溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。 标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。 试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。 一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。 试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。 加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于
1.主题内容和适用范围 本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。 本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准 《中国药典》2015年版四部。 3.术语 抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注 意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液 中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水 洗、PW冲3次
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法 7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊, 产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》四部附录1105: 微生物计数法, 以及1106: 控制菌检查法的规定, 本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。经过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常见辅料成分, 文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性, 对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶, 能够经过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案经过试验菌株的回收率测试, 首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查; 如常规倾注平皿法不适用, 则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件, 按制定的方法进行试验, 根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性, 对其有效性进行评价, 保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊, 进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草, 由质量部审核, 最终由质量负责