病毒感染细胞实验整体流程及原理
目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒
1.1慢病毒
1.1.1原理
慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点
1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：
1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒
1.2.1原理
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点
1）几乎可以感染所有类型的细胞
2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒
3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.
5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
1.2.3腺病毒包装简要流程
1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体
2）采用PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
2、构建目的基因到载体
2.1构建手段
一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定
2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定
2.2质粒载体
2.2.1概念
能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子
2.2.2特征
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化
连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备
1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h
3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min
4）4℃离心10min（4000r/min）
5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
7）4℃离心10min（4000r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
9）分装细胞，200ul一份，4℃保存
3.2质粒DNA的转化
1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
2）离心管放到42℃保温90s
3）冰浴2min
4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）
5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min
6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落
3.3质粒提取步骤
1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清
2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。
3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
5）12000室温离心10min，收集上清。
6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
7）12000转离心1min，弃滤液。
8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。
10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min。
12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。
质粒提取步骤：吸取液体培养基于1.5ml离心管中12000转离心1min，弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充分的上下翻转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min——取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液——加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液——加
500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍——将制备管置回2ml离心管12000转
离心1min——将制备管移入新的1.5ml离心管中，加60~80ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min——移去制备管，将有质粒的离心管于4℃或是-20℃保存
4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）
4.1名词解释
4.1.1293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
4.1.2脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
4.2共转染的操作步骤
第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：
1. 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD
2.G
2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体2000
3. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min
4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
5. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。
第三天：
1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
第四天：
1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。
2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。
3.12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
4.3病毒包装的原理
质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。
在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
5、慢病毒感染细胞
5.1流程图
5.2感染步骤
1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜
2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
5.3荧光显微镜的操作流程
打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica）5.4注意事项内容
1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。
2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。
3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。
4.在加病毒后一般24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。
6、感染后的细胞检测方法
6.1荧光初步检测
若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。
6.2RNA的提取及RT-PCR检测
6.2.1原理
因为真核细胞DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA，，是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条途径来测定
6.2.2RNA提取步骤
加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml无菌的离心管中；加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀，12000转15min，可看到明显分层；取上层透明液体至新的1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇，混匀静置10min，12000转离心10min，弃上清，加1ml70%乙醇，12000转，离心10min，弃上清，风干剩余液体，最后加DEPC-水溶解RNA，电泳，粗步判定RNA纯度。
6.2.3RT-PCR步骤：
RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR 仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA。
PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA。（具体步骤省略）
6.3蛋白提取及Western检测
western-Bloting：蛋白免疫印迹（Western blotting 或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
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Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
福建农林大学计算机与信息学院信息工程类实验报告系：计算机科学与技术专业：计算机科学与技术年级： 09级 姓名：张文绮学号： 091150022 实验课程：计算机组成原理 实验室号：___田405 实验设备号： 43 实验时间：2010.12.19 指导教师签字：成绩： 实验一算术逻辑运算实验 1．实验目的和要求 1. 熟悉简单运算器的数据传送通路； 2. 验证4位运算功能发生器功能(74LS181)的组合功能。 2．实验原理 实验中所用到的运算器数据通路如图1-1所示。其中运算器由两片74181
以并/串形式构成8位字长的ALU。运算器的输出经过一个三态门(74245)和数据总线相连，运算器的两个数据输入端分别由两个锁存器(74373)锁存，锁存器的输入连接至数据总线，数据开关INPUT DEVICE用来给出参与运算的数据，并经过一个三态门(74245)和数据总线相连，数据显示灯“BUS UNIT”已和数据总线相连，用来显示数据总线内容。 图1-2中已将用户需要连接的控制信号用圆圈标明(其他实验相同，不再说明)，其中除T4为脉冲信号，其它均为电平信号。由于实验电路中的时序信号均已连至W/R UNIT的相应时序信号引出端，因此，在进行实验时，只需将W/R UNIT 的T4接至STATE UNIT的微动开关KK2的输出端，按动微动开关，即可获得实验所需的单脉冲，而S3，S2，S1，S0，Cn，LDDR1，LDDR2，ALU-B，SW-B各电平控制信号用SWITCH UNIT中的二进制数据开关来模拟，其中Cn，ALU-B，SW-B为低电平控制有效，LDDR1，LDDR2为高电平有效。 3．主要仪器设备（实验用的软硬件环境） ZYE1603B计算机组成原理教学实验系统一台，排线若干。 4．操作方法与实验步骤
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重庆理工大学 《计算机组成原理》 实验报告 学号 __11503080109____ 姓名 __张致远_________ 专业 __软件工程_______ 学院 _计算机科学与工程 二0一六年四月二十三实验一基本运算器实验报告
一、实验名称 基本运算器实验 二、完成学生：张致远班级115030801 学号11503080109 三、实验目的 1．了解运算器的组成结构。 2．掌握运算器的工作原理。 四、实验原理： 两片74LS181 芯片以并/串形式构成的8位字长的运算器。右方为低4位运算芯片，左方为高4位运算芯片。低位芯片的进位输出端Cn+4与高位芯片的进位输入端Cn相连，使低4位运算产生的进位送进高4位。低位芯片的进位输入端Cn可与外来进位相连，高位芯片的进位输出到外部。 两个芯片的控制端S0～S3 和M 各自相连，其控制电平按表2.6-1。为进行双操作数运算，运算器的两个数据输入端分别由两个数据暂存器DR1、DR2（用锁存器74LS273 实现）来锁存数据。要将内总线上的数据锁存到DR1 或DR2 中，则锁存器74LS273 的控制端LDDR1 或LDDR2 须为高电平。当T4 脉冲来到的时候，总线上的数据就被锁存进DR1 或DR2 中了。 为控制运算器向内总线上输出运算结果，在其输出端连接了一个三态门（用74LS245 实现）。若要将运算结果输出到总线上，则要将三态门74LS245 的控制端ALU-B 置低电平。否则输出高阻态。数据输入单元(实验板上印有INPUT DEVICE)用以给出参与运算的数据。其中，输入开关经过一个三态门（74LS245）和内总线相连，该三态门的控制信号为SW-B，取低电平时，开关上的数据则通过三态门而送入内总线中。 总线数据显示灯（在BUS UNIT 单元中）已与内总线相连，用来显示内总线上的数据。控制信号中除T4 为脉冲信号，其它均为电平信号。 由于实验电路中的时序信号均已连至“W/R UNIT”单元中的相应时序信号引出端，因此，需要将“W/R UNIT”单元中的T4 接至“STATE UNIT”单元中的微动开关KK2 的输出端。在进行实验时，按动微动开关，即可获得实验所需的单脉冲。 S3、S2、 S1、S0 、Cn、M、LDDR1、LDDR2、ALU-B、SW-B 各电平控制信号则使用“SWITCHUNIT”单元中的二进制数据开关来模拟，其中Cn、ALU-B、SW-B 为低电平有效，LDDR1、LDDR2 为高电平有效。 对于单总线数据通路，作实验时就要分时控制总线，即当向DR1、DR2 工作暂存器打入数据时，数据开关三态门打开，这时应保证运算器输出三态门关闭；同样，当运算器输出结果至总线时也应保证数据输入三态门是在关闭状态。 运算结果表
计 算 机 组 成 原 理 讲 义 计算机科学技术系王玉芬 2012年11月3日
基础实验部分 该篇章共有五个基础实验组成，分别是：实验一运算器实验实验二存储器实验实验三数据通路组成与故障分析实验实验四微程序控制器实验实验五模型机CPI组成与指令周期实验
实验一运算器实验 运算器又称作算术逻辑运算单元（ALU ,是计算机的五大基本组成部件之一, 主要用来完成算术运算和逻辑运算。 运算器的核心部件是加法器, 加减乘除运算等都是通过加法器进行的, 因此, 加快运算器的速度实质上是要加快加法器的速度。机器字长n 位,意味着能完成两个n位数的各种运算。就应该由n个全加器构成n位并行加法器来实现。通过本实验可以让学生对运算器有一个比较深刻的了解。 、实验目的 1．掌握简单运算器的数据传输方式。 2．掌握算术逻辑运算部件的工作原理。 3. 熟悉简单运算器的数据传送通路。 4. 给定数据,完成各种算术运算和逻辑运算。 二、实验内容： 完成不带进位及带进位的算术运算、逻辑运算实验。 总结出不带进位及带进位运算的特点。 三、实验原理： 1. 实验电路图
DHP1 ICC 图4-1运算器实验电路图 UiT ■-? M 74LS2J5 b t h y \ g tj'gr 2 e 曲 s詔凶口占a 出乜 VTXX tLb 匕'7^7^ elr 3泊 为 ■乱::f l 4 3 S |ilm gi ￡ Ctdf BsuB&-Kritin Xd 74IK131 亠 -fl " a r? ￡严 ■_> \ )00' S o o o o rsp "PFP iH 3I I DJ n l/l /B \\W th V4 74HC1S1 八z、 —
病毒感染的实验诊断 病毒感染的实验诊断（一） ●考点 病毒的生物学性状 病毒的实验室检查方法 常见病毒的感染 [讲义编号NODE70103300270100000101：针对本讲义提问] 【内容讲解】 第一节概述 一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。 仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。 病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。 在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。 [讲义编号NODE70103300270100000102：针对本讲义提问] 一、病毒的基本性状 （一）形态结构 1.大小和形状： 大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。 形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。 [讲义编号NODE70103300270100000103：针对本讲义提问] 2.结构 [讲义编号NODE70103300270100000104：针对本讲义提问] （二）病毒的增殖 病毒必须依赖宿主细胞，
以特殊的自我复制方式进行增殖。 病毒的复制周期： 吸附、穿入、脱壳、生物合成、 组装与成熟、释放6个阶段。 [讲义编号NODE70103300270100000105：针对本讲义提问] 异常增殖： 顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。 缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。 干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种 [讲义编号NODE70103300270100000106：针对本讲义提问] （三）噬菌体 以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。 噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。 噬菌体感染细菌后产生两种后果： 溶菌周期和溶源性周期。
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较 慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus）腺病毒表达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制 是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时 间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬 时表达外源基因 感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转 染的原代细胞（如神经细胞）及体内 实验 感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
计算机组成原理实验报告 一、实验1 Quartus Ⅱ的使用 一．实验目的 掌握Quartus Ⅱ的基本使用方法。 了解74138（3：8）译码器、74244、74273的功能。 利用Quartus Ⅱ验证74138（3：8）译码器、74244、74273的功能。 二．实验任务 熟悉Quartus Ⅱ中的管理项目、输入原理图以及仿真的设计方法与流程。 新建项目，利用原理编辑方式输入74138、74244、74273的功能特性，依照其功能表分别进行仿真，验证这三种期间的功能。 三．74138、74244、74273的原理图与仿真图 1.74138的原理图与仿真图 74244的原理图与仿真图
1. 4.74273的原理图与仿真图、
实验2 运算器组成实验 一、实验目的 1.掌握算术逻辑运算单元（ALU）的工作原理。 2.熟悉简单运算器的数据传送通路。 3.验证4位运算器（74181）的组合功能。 4.按给定数据，完成几种指定的算术和逻辑运算。 二、实验电路 附录中的图示出了本实验所用的运算器数据通路图。8位字长的ALU由2片74181构成。2片74273构成两个操作数寄存器DR1和DR2，用来保存参与运算的数据。DR1接ALU的A数据输入端口，DR2接ALU的B数据输入端口，ALU的数据输出通过三态门74244发送到数据总线BUS7-BUS0上。参与运算的数据可通过一个三态门74244输入到数据总线上，并可送到DR1或DR2暂存。 图中尾巴上带粗短线标记的信号都是控制信号。除了T4是脉冲信号外，其他均为电位信号。nC0，nALU-BUS，nSW-BUS均为低电平有效。 三、实验任务 按所示实验电路，输入原理图，建立.bdf文件。 四.实验原理图及仿真图 给DR1存入01010101，给DR2存入10101010，然后利用ALU的直通功能，检查DR1、
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
计算机组成原理实验报告 ——微程序控制器实验 一.实验目的: 1.能瞧懂教学计算机(TH-union)已经设计好并正常运行的数条基本指令的功能、格式及执 行流程。并可以自己设计几条指令,并理解其功能,格式及执行流程,在教学计算机上实现。 2.深入理解计算机微程序控制器的功能与组成原理 3.深入学习计算机各类典型指令的执行流程 4.对指令格式、寻址方式、指令系统、指令分类等建立具体的总体概念 5.学习微程序控制器的设计过程与相关技术 二.实验原理: 微程序控制器主要由控制存储器、微指令寄存器与地址转移逻辑三大部分组成。 其工作原理分为: 1、将程序与数据通过输入设备送入存储器; 2、启动运行后从存储器中取出程序指令送到控制器去识别,分析该指令要求什么事; 3、控制器根据指令的含义发出相应的命令(如加法、减法),将存储单元中存放的操作数据取出送往运算器进行运算,再把运算结果送回存储器指定的单元中; 4、运算任务完成后,就可以根据指令将结果通过输出设备输出 三.微指令格式: 其中高八位为下地址字段、其余各位为控制字段、 1)微地址形成逻辑 TH—UNION 教学机利用器件形成下一条微指令在控制器存储器的地址、 下地址的形成由下地址字段及控制字段中的CI3—SCC控制、当为顺序执行时,下地址字段不起作用、下地址为当前微指令地址加1;当为转移指令(CI3—0=0011)时,由控制信号SCC 提供转移条件,由下地址字段提供转移地址、 2)控制字段 控制字段用以向各部件发送控制信号,使各部件能协调工作。 控制字段中各控制信号有如下几类: ①对运算器部件为了完成数据运算与传送功能,微指令向其提供了24位的控制信号,包括:4位的A、B口地址,用于选择读写的通用积存器３组３位的控制码I８－I６、 I５－I３、I２－I６,用于选择结果处置方案、运算功能、数据来源。 ３组共７位控制信号控制配合的两片GAL20V8 3位SST,用于控制记忆的状态标志位 2位SCI,用于控制产生运算器低位的进位输入信号 2位SSH,用于控制产生运算器最高,最地位(与积存器)移位输入信号 ②对内存储器I/O与接口部件,控制器主要向它们提供读写操作用到的全部控制信号,共3位,即MRW
实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤 和元生物|2016-03-1513:51 慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 以24孔为例： 第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。通常，24孔板内以 5-8*10^4cells/孔的密度铺板。 第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量 选择合适MOI值，进行病毒感染。 加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。 2弃去部分培养基 将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。 3加入慢病毒加药量计算方法
（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。 4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/ml Polybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。 5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。 如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。5%CO2培养箱培养。 第五天：观察荧光表达情况病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估计慢病毒感染目的细胞的效率。若荧光弱，可到96h后观察。如果96h仍无荧光，即感染实验失败。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。
实验一监控程序与汇编实验 实验时间：第周星期年月日节实验室：实验台： （以上部分由学生填写，如有遗漏，后果由学生本人自负） 1、实验目的 1）了解教学计算机的指令格式、指令编码、选择的寻址方式和具体功能。 2）了解汇编语言的语句与机器语言的指令之间的对应关系，学习用汇编语言设计程序的过程和方法。 3）学习教学机监控程序的功能、监控命令的使用方法，体会软件系统在计算机组成中的地位和作用。 2、实验平台 硬件平台：清华大学TEC-XP实验箱的MACH部分 软件平台：监控程序、PC端指令集仿真软件 3、实验要求 1）学习联机使用TEC-XP 教学实验系统和仿真终端软件； 2）使用监控程序的R 命令显示/修改寄存器内容、D 命令显示存储器内容、E 命令修改存储器内容； 3）使用A 命令写一小段汇编程序，使用U命令观察汇编码与机器码之间的关系，用G 命令连续运行该程序，用T命令单步运行并观察程序单步执行情况。 **代码不得写到0000——1FFF的地址单元中，如有违反将被取消当堂成绩 4、操作步骤及实验内容 1）实验箱功能开关设置及联机操作： 1. 将实验箱COM1口与PC机相连； 2. 设置功能状态开关为00110； 3. 于PC端运行； 4. 按RESET，START键，若PC端出现如下输出（如图所示），则操作成功； 图 2）仿真软件相关操作： 1. 在项目文件夹找到并启动； 图
2. 点击文件-启动监控程序； 图 4.若PC端出现如下输出（如图所示），则操作成功； 图 3）理解下列监控命令功能： A、U、G、R、E、D、T 1. A命令：完成指令汇编操作，把产生的指令代码放入对应的内存单元中，可连 续输入。不输入指令直接回车，则结束A命令（如图所示）； 图 2. U命令：从相应的地址反汇编15条指令，并将结果显示在终端屏幕上（如图所 示）； 图 注：连续使用不带参数的U命令时，将从上一次反汇编的最后一条语句之后接着继续反汇编。 3. G命令：从指定（或默认）的地址运行一个用户程序（如图所示）； 图 4. R命令：显示、修改寄存器内容，当R命令不带参数时，显示全部寄存器和状 态寄存器的值（如图所示）； 图 5. E命令：从指定（或默认）地址逐字显示每个内存字的内容，并等待用户打入 一个新的数值存回原内存单元（如图所示）； 图 6. D命令：从指定（或默认）地址开始显示内存120个存储字的内容（如图所示）；
计算机组成原理上机实验指导
一、实验准备和实验注意事项 1．本课程实验使用专门的TDN-CM++计算机组成原理教学实验设备，使用前后均应仔细检查主机板，防止导线、元件等物品落入装置导致线路短路、元件损坏。 2．完成本实验的方法是先找到实验板上相应的丝印字及其对应的引出排针，将排针用电缆线连接起来，连接时要注意电缆线的方向，不能反向连接；如果实验装置中引出排针上已表明两针相连，表明两根引出线部已经连接起来，此时可以只使用一根线连接。 3．为了弄清计算机各部件的工作原理，前面几个实验的控制信号由开关单元“SWITCH UNIT”模拟输入；只有在模型机实验中才真正由控制器对指令译码产生控制信号。在每个实验开始时需将所有的开关置为初始状态“1”。 4．本实验装置的发光二极管的指示灯亮时表示信号为“0”，灯灭时表示信号为“1”。 5．实验接线图中带有圆圈的连线为实验中要接的线。 6．电源关闭后，不能立即重新开启，关闭与重启之间至少应有30秒间隔。 7．电源线应放置在机专用线盒中。 8．保证设备的整洁。
二、实验设备的数据通路结构 利用本实验装置构造的模型机的数据通路结构框图如下图。其中各单元部已经连接好，单元之间可能已经连接好，其它一些单元之间的连线需要根据实验目的用排线连接。 图0-2 模型机数据通路结构框图
实验一运算器实验：算术逻辑运算实验 一．实验目的 1．了解运算器的组成结构； 2．掌握运算器的工作原理； 3．掌握简单运算器的数据传送通路。 4．验证运算功能发生器(74LSl81)的组合功能。 二．实验设备 TDN-CM++计算机组成原理教学实验系统一台，排线若干。 三．实验原理 实验中所用的运算器数据通路如图1-l所示。其中两片74LSl81以串行方式构成8位字长的ALU，ALU的输出经过一个三态门(74LS245)和数据总线相连。三态门由ALU-B控制，控制运算器运算的结果能否送往总线，低电平有效。 为实现双操作数的运算，ALU的两个数据输入端分别由二个锁存器DR1、DR2(由74LS273实现)锁存数据。要将数据总线上的数据锁存到DR1、DR2中，锁存器的控制端LDDR1和LDDR2必须为高电平，同时由T4脉冲到来。 数据开关(“INPUT DEVICE”)用来给出参与运算的数据，经过三态门(74LS245)后送入数据总线，三态门由SW-B控制，低电平有效。数据显示灯(“BUS UNIT”)已和数据总线相连，用来显示数据总线上的容。 图中已将用户需要连接的控制信号用圆圈标明(其他实验相同，不再说明)，其中除T4为脉冲信号外，其它均为电平信号。由于实验电路中的时序信号均已连至“W／R UNIT”的相应时序信号引出端，因此，在进行实验时，只需将“W／R UNIT”的T4接至“STATE UNIT”的微动开关KK2的输出端，按动微动开关，即可获得实验所需的单脉冲。 ALU运算所需的电平控制信号S3、S2、S1、S0、Cn、M、LDDR1、LDDR2、ALU-B、SW-B均由“SWITCH UNIT”中的二进制数据开关来模拟，其中Cn、ALU-B、SW-B为低电平有效，LDDRl、LDDR2为高电平有效。 对单总线数据通路，需要分时共享总线，每一时刻只能由一组数据送往总线。
第二章病毒 第五节病毒病的实验室诊断方法 畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。 一、病料的采集、保存和运送 病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。 二、包涵体检查 有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3） 表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒 病毒名称感染范围包涵体类型及部位 痘病毒类 狂犬病病毒 伪狂犬病病毒 副流感病毒III型 马鼻肺炎病毒 鸡新城疫病毒 传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等 狼、马、牛、猪、人、猫、羊、 禽等 犬、猫、猪、牛、羊等 牛、马、人 马属动物 鸡 鸡 嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中 嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节 层的细胞中 嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中 嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡 上皮细胞及肺的间隔细胞中 嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间 隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等 嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中 嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中 三、病毒的分离培养 将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理三种。如用口蹄疫的水疱皮病料进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH7.6磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1000IU，链霉素1000μg，置2～4℃冰箱内4～6h，然后用8000～10000r/min速度离心沉淀30min，