酶分子定向进化的研究进展及应用
郭黄英
材料与化工学院生物工程
摘要：酶分子定向进化史模拟自然进化过程，具有适应面广、目的性强、效果显著等特点，可以在较短的时间内获得具有新的催化特性的酶突变体。定向进化可以显著提高酶活力，增强酶的稳定性，改变酶的底物专一性等，已经成为一种快速有效的改进酶的催化特性的手段。本文详细综述了酶分子定向进化的概念、过程、基本策略和核心技术，并列举了该技术在现实中的应用实例。
关键词：酶，定向进化，生物催化，应用
酶分子定向进化（enzyme molecular directed evolution）简称为酶定向进化，是模拟自然进化过程（随即突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。
酶定向进化的基本过程包括随机突变、构建突变基因文库、定向选择等步骤
酶的定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业、食品业、环境保护和药物开发等领域逐渐显示其生命力。
1.酶分子定向进化的研究背景
酶作为催化剂，已在生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等方面得到广泛应用。但随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低等缺陷使得酶催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。因此对天然酶分子的改造显得十分重要。
1993年，美国科学家Arnold F H L3首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造和构建新的非天然酶。酶分子定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，在过去几十年，定向进化已经成为作为生物催化剂的天然酶克服限制的重要工具，其对潜在的经济、环境、社会和医疗的影响是不可预计的，并且酶产品未来发展前景是无限的。
2. 酶分子定向进化的主要方法
2.1 易错PCR技术
易错PCR(error—prone PCR)技术是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链式反应（PCR），是扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。在进行PCR扩增目的基因时，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致目的基因发生随机突变。通过构建突变库，筛选出所需的突变体；经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR，即将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机突变，使每一次获得的小突变累积进而产生重要
的有益突变。
在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化，但使用该方法易出现同型碱基转换。易错PCR使原始蛋白质中仅有较小的序列空间发生突变，当片段超过800bp 时，其突变率会下降。
2.2 DNA重排技术
DNA重排技术(DNA shufling)，又称DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
DNA重排技术是由Stemmer等于1994年创建的。他们通过该技术对β-内酰胺酶进行了定向化研究，是该酶的催化效率提高了32000倍。
该技术将存在于两种或多种不同的基因中的正突变结合在一起，通过DNA碱基序列的重新排布，形成新的突变基因，属于有性生殖。
2.3 交错延伸PCR技术
交错延伸PCR(staggered extension process，SEP)技术：即在同一反应体系中以两个或多个相关的DNA片段为模板进行PCR反应，把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并且大大缩短了反应时间（55℃,5s）。在反应过程中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进行多次变性和短时的退火——延伸反应循环，在每个循环中，不同长度的延伸片段在变形时与原先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进行延伸。通过在不同的模板上交替延伸，所合成的DNA片段中包含有不同模板上的信息，直到获得全长的突变基因为止。
采用交错延伸PCR技术进行酶的有性进化，可以省去DNA重拍技术中DNase Ⅰ切割这一步骤，具有简便、快速的特点
2.4 随机引物体外重组技术
随机引物体外重组技术(random-priming in vitro recombination，RPR)是采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补的短DNA片段，然后除去模板，这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。
RPR具有以下特点：①可用单链DNA或mRNA为模板。对模板量要求少，减少了亲本组分的干扰；②克服了DNA shuffling中DNaseⅠ所具有的序列偏爱性，保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性；③片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，无需中间的纯化步骤。
2.5 过渡模板随机嵌合生长技术
过渡模板随机嵌合生长技术(random chimeragenesis on transient templates，RACHITT)是基于DNA同源重组原理而实现的随机突变技术，是将随机切割的基因片段杂交到另一个相同家族的DNA临时模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接，消化掉DNA临时模板，复制出新生的DNA链分子，从而建立高度重组的突变体文库的过程。
2.6 随机插入／删除链的交换突变技术
Murakami等创建了随机插入／删除链的交换突变技术(random insertion／deletion strand exchange mutagenesis，RAISE)。其主要步骤是：①用DNaseⅠ切割目的基因并回收100—300 bp小片段；②用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)在小片段的3端随机添加／删除几个核苷酸；③自引物PCR重组小片段直至扩增出全长基因。特点是简便并且可以通过控制插入或删除的核苷酸长度来调整突变程度。利用此法对一内酰胺酶进行进化，显著提高了对头孢他啶(cefiazidime)的降解能力，其最小抑制浓度提高了5 000倍。
2.7 易错滚环扩增法技术
Fujii等将DNA滚环扩增的原理应用于易错PCR技术，创建了易错滚环扩增法(error—prone rol1ing circle amplification，EP—RCA)。其主要步骤：①随机引物六聚体(经硫代磷酸化修饰)杂交到环状DNA上，在φ29 DNA聚合酶(并加入Mn2+提高突变)的作用下多位点同时扩增延伸；②利用φ29 DNA聚合酶具有高的链置换活性的特点，以环状DNA为模板不问断扩增释放产生具有多重模板序列的DNA分子；③以线性DNA为模板继续扩增形成长短不一的线性产物，可直接用于转化，利用首尾重复序列在宿主内同源重组重新环化。
该法省去了酶切、连接等步骤，甚至不需要特定引物和PCR仪等设备(常温扩增)。不仅简化了进化过程，也使得随机突变技术的应用变得更为普遍。Fujii等利用EP—RCA法对pUC19质粒上的β-内酰胺酶(头孢氨苄抗性)进行改造，经一轮进化获得7个水解头孢他啶的突变体，改变了β-内酰胺酶的底物选择性，具有较高的突变率与突变谱。
2.8 复合自组装基因组工程
复合自组装基因组工程(multiplex automated genome engineering，MAGE)是以整个染色体DNA为模板，在体外设计并合成一系列的小分子DNA片段，通过转化的方法不断导入细胞内，随着染色体DNA的复制来构建突变库的方法。其主要原理：①在细胞生长对数期诱导细胞体内的β-蛋白表达(防止寡核苷酸降解)，制备细胞悬液；②针对特定代谢途径的相关基因设计一组约90 bp左右的单链小片段DNA；③通过电转化的方法把在体外合成的单链小片段DNA导入细胞中；④单链DNA可作为随机引物渗人染色体复制，造成基因的突变，细胞再生后可进行下一轮循环或筛选。
该方法的优点是效率高，既可以对细胞的整个代谢途径进行突变，也可以通过小片段DNA的设计重点突变基因组中的某些代谢途径。
3．酶分子定向进化的应用
通过定向进化对酶进行改造，在研究酶的构效关系，提高酶热、酶活性、或有机溶剂的稳定性，改变底物特异性等方面得到了广泛应用。
如张建云等利用易错PCR技术对OL淀粉酶基因进行了改造，通过多轮诱变，获得的5株新菌株的酶活分别为出发菌株的5～15倍。
Nakazawa等通过易错PCR和活性筛选的方法得到β-l，4 -葡聚糖酶突变体2R4，其表达量比野生型提高了130倍， (最适条件下1 mol底物1 S内转化的酶量)提高了1.4倍，值提高2倍，并且比野生型具有更大的pH稳定性，在55℃保温30 min可保留全部活性，而野生型活性完全丧失。
Kim等对栖热菌(Thermus sp．)IM6501菌株中具有热稳定性的麦芽糖淀粉酶进行了DNA 改组，经过4轮改组和筛选，得到了具有高耐热性的麦芽糖淀粉酶。Ness等针对同源性在56％～99％之间的26个枯草芽孢杆菌蛋白酶基因进行了改组，获得了热稳定性提高3～15倍的克隆子。
Morawski等通过DNA改组获得1株辣根过氧化物酶突变体，该突变体能耐受较高浓度的双氧水、CTAB和其他盐类。但一般情况下通过单个定向进化技术构建的突变体库中包含的有益突变的比例较小，不利于后续的筛选和鉴定，目前已很少单独使用单一方法进行定向进化。一般的方法是将多种技术结合起来，从而得到更好的效果。
Miyazaki等利用随机突变、饱和突变和DNA shuffling相结合的方法对Bacillus subtilis 家族的木聚糖酶进行改造，改造后的木聚糖酶半衰期失活温度及最适反应温度比野生型提高了10℃，60保温2h仍保留全部活性，而野生型在6O℃保温5min就完全失活。Shi等通过易错PCR和DNA shuffling的结合创建突变体库，筛选到一琼脂糖酶突变体s2，s2的值提高了4.6倍，在40℃时的半衰期为350min，比野生型提高了18.4倍。
Song等利用随机突变和重组的方法筛选得到的3株磷脂酶A1突变体，其稳定性和活性都得到了较大的提高。此外，作为定向进化的延伸，基因组改组也已成为了菌种选育的有力
工具。
4．酶分子定向进化的展望
酶的定向进化已经成为改进酶工程的重要方法。它从多个角度改进酶，比如酶的稳定性、特应性、反应活性、溶解性和异源表达等，使酶的应用更加广泛。
而随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，酶的定向进化的方法也在不断完善。酶的突变、重组、建立突变库到筛选每个过程都得以改进,更多多功能的酶被创造出来。但不可否认的是，目前定向进化技术的应用仍具有很大局限性，很多交叉学科依旧等待着我们去探索、创新。因此，在未来的几十年内，巨大的开发潜力将从酶行业中释放出来,可以对工业、农业、食品业、环境保护、药物开发等方面产生重要的影响。
参考文献：
[1]罗巅辉，方柏山．酶定向进化的研究进展[J]．生物技工过程，2006，（01）：9-14
[2]曾家豫，杨国兵，廖世奇．生物酶的定向进化及其应用[J]．卫生职业教育2007，25，155-159
[3]鲁静，高仁钧，张焱茹．酶的定向进化方法和应用[J]．内蒙古农业科技，2007，（01）：79-82
[4]程峰，董俐住，柳志强，郑裕国．改进酶稳定性的定向进化技术[J]．生物技术通报，2010，（12）：
93-99
[5]苏龙，庄宇，何冰芳．酶的定向进化研究及其在工业生物催化中的应用[J]．生物加工过程，2011，
（04）：69-75
[6]汤晓玲，于洪巍．通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究[J]．高校化学工程学报，2011，（02）：
283-288
[7]Machius M，Declerck N，Huber R，et al．Kinetic stabilization of Bacillus licheniformis α—amylase through
introduction of hydrophobic residues at the surface[J]．Journal of Biological Chemistry，2003．278(13)：11546-11553．
[8]Li Q S，Schwaneberg U，Fischer P，et a1．Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into
an indole—hydroxylating catalyst[J]．Chemistry：A European Journal，2000，6(9)：l531—1536．
[9]Stephens D E，Rumbold K，Permaul K，et a1．Directed evolution 0f the thermostable xylanase from
Thermomyces lanuginosus[J]．Journal of Biotechnology，2007，127(3)：348-354．
[10]Reetz M T .Directed evolution of enantioselective enzymes：an unconventional approach to asymmetric
catalysis in organic chemistry [J]．J Org Chem，2009，74(16)：5767-5778．
[11] D Lipovsck,A Pluckthum，In-vitro Protein Evolution by Riposome Display and mRNA Display[J]．Immunol
Methods，2004，290：51-67．
湖南农业大学课程论文 学院：食品科技学院班级：XXXX级食科3班姓名： X X X 学号：XXXXXXXXXXXX 课程论文题目：淀粉酶在食品行业的用途 课程名称：食品酶工程 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
淀粉酶在食品行业的应用 学生：X X X (食品科技学院XXXX级食科3班，学号XXXXXXXXXXXXX) 摘要：酶工程是现代生物工程的一个分支，是当今最具有发展前景的学科之一。酶工程工业在我国起步虽晚，但发展很快，从六十年代中期起步，至今短短的三十多年，已初步建成了完整的酶工业，产品已被广泛用于味精、淀粉糖、酿造、啤酒、食品、纺织、洗涤剂、有机酸以及医药等行业。酶制剂的应用，促进了这些行业的发展，反过来人们也逐步认识了酶制剂，促进了酶工业自身的发展。 淀粉酶为重要的酶制剂，是酶制剂中用途最广、用量最大的一种。在食品加工工业中，它用于面包生产中的面团改良；啤酒生产中供糖化及分解未分解的淀粉；婴幼儿食品中用于谷类原料的预处理；酒精生产中用于糖化和分解淀粉；果汁加工中用于淀粉的分解和提高过滤速度。还广泛用于糖浆制造、饴糖生产、蔬菜加工、粉状糊精生产、葡萄糖制造业中。在医药工业可用作辅助消化药。另外，还可用于纺织印染工业。 关键词：淀粉酶食品应用 一、淀粉酶在焙烤食品中的应用 随着人民生活水平的日益提高和食品工业的不断发展，人们对面粉的品种和品质提出了愈来愈高的要求。面粉生产企业为适应市场新的需求，近年来陆续开发生产了各类专用面粉，在生产面包、馒头等制作发酵食品的专用面粉时，除面粉的面筋、灰分、粗细度、粉质曲线稳定时间等常规质量指标外，面粉工作者越来越关注面粉的α—淀粉酶活性。理论与实践表明：面粉的α—淀粉酶活性，直接影响到面粉的发酵力和发酵食品的质量，特别是低糖主食面包。一般情况下，正常季节收获的小麦加工的面粉中α—淀粉酶的含量普遍不足，国外面粉生产企业通常的做法是在生产这类面粉时，添加麦芽粉或真菌α—淀粉酶，用来提高面粉中α—淀粉酶的活性，以改善和提高发酵食品的质量。 麦芽粉是在适当的温度和水分下使大麦或小麦发芽、干燥后加工成粉。其酶活性较低，添加量为面粉的0.2～0.4％，因粘性较大，在实际应用中混合均匀较为困难。而真菌α—淀粉酶是一种高浓度、高活性、易流动的粉末，其酶活性为
湖北大学 酶工程实验 （0818800193）实验教学大纲 （第2版） 生命科学学院 生化教研室 2014年7月
前言 课程名称：酶工程实验实验学时：16学时 适用专业：生物工程课程性质：必修 一、实验课程简介 酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。 二、课程目的 本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。 三、考核方式及成绩评定标准 考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。 四、实验指导书及主要参考书 1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。 2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月 五、实验项目
酶工程实验(2010)
实验一植物体内过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。 二、原理 在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制： 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。 四、实验步骤 1. 酶液提取 称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定 吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。 五、酶活性计算 按下式计算酶的相对活性 △A470 ×酶提取液总量（ml）
酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ------------------- 样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml） 实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对 淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉 溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活 力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使 用前稀释10倍)
酶工程技术论文酶工程技术 发达国家所掌握的酶工程技术比较熟练，近些年来人们加快了对新酶源的开发，使功能性食品添加剂得到了迅速的发展。下面小编给大家分享一些酶工程技术论文，大家快来跟小编一起欣赏吧。酶工程技术论文篇一 酶工程技术在食品添加剂生产中的应用 摘要：近些年来，由于固定化细胞技术、固定化酶反应器的推广与使用，使得食品新产品得到了开发，食品的品种数量与质量都得到了明显的提高，这为食品工业带来了巨大的经济效益。本文就酶工程技术在食品添加剂中的应用情况作进一步的说明。 关键词：酶工程食品添加剂 引言 利用酶和细胞或者是细胞器所具有的催化功能为人类提供服务，生产所需产品的技术统称为酶工程技术。作为生物工程的一个重要组成部分，酶工程技术被广泛地应用在食品添加剂的生产中。 一、开发新的酶源 发达国家所掌握的酶工程技术比较熟练，近些年来人们加快了对新酶源的开发，使功能性食品添加剂得到了迅速的发展。我国对于这方面的研究起步比较晚，但是随着近几年的探究与摸索也取得了明显的进步。比如说，华南理工大学利用微生物发酵的技术可以产生一种特定的酶，这种酶具有很强的催化的作用，它可以进行两步酶法催化分子果糖转移反应而产生低聚果糖，这是一项巨大的突破;其次比较有名的就是江苏化工学院自制出了选择性优良以及非常廉价的糖化酶和胰淀粉酶，它们经过一系列的催化作用可以生产出低糖度、低热量、高粘度且不会被微生物发酵的麦芽糖醇。 脂肪酶是大家比较熟悉的一种水解酶，它是一种只能在异相系统或者不溶性系统的油-水界面上来进行水解的酶。但是由于脂肪酶的不稳定性、酶的来源较少、提纯比较困难的种种原因使得它长期以来得不到充足的发展。但是近年来随着细胞工程、固定化技术以及基因工程的兴起，人们逐渐解开了脂肪酶的神秘面纱，对于脂肪酶的研究也取得了飞跃式的发展，其中甘油胆汁及其衍生物在食品行业中是应用最广泛的，它改善了食品工业中面包的质量与口感，它可以诱导或快速形成巧克力面包的香味，为国内外食品的发展奠定了良好的基础。 二、固定化酶技术与细胞技术的发展 通常所谓的固定化技术就是通过一系列的物理或者化学的方法将酶或者是细胞固定在水溶性或者是非水溶性的膜状、颗粒状、管状的载体上，在这样的情况下能明显的提高酶对热度以及对酸碱度的稳定性;而且利用固定化技术在连续反应的过程中不会造成流失的现象，利用非常简单的方法就可以进行回收再生，为生产的可持续化、节约能耗、降低生产成本提供了技术上的支持。早在70年代，中国科学院生物研究所就对固定化酶或者固定化细胞技术开始了长时间的研究，现在许多的科研单位、高等学校和大型企业已经掌握了固定化酶技术，并取得了明显的效果，现在固定化酶和细胞技术已经广泛地应用于食品添加剂中。 固定化酶技术在甜味剂的生产中采用固定化葡萄糖异构酶在生物反应器中的连续生产，可以制造出葡萄糖浆，这项技术在整个的酶工程工业生产中是最成功的，同时也是应用范围最广的;利用酶技术方法可以将便宜的无水马来酸制作成酒石酸，现在的市场上几乎都是运用这种方法来生产酒石酸，因为它具有操作过程简单、酒石酸纯度高、经济效益高的特点。利用固定化酶和细胞技术还可以生产营养强化剂，营养强化剂主要包括氨基酸、维生素和一些微量的元素，L-天门冬安是最早应用固定化细胞在工业上大规模生产的氨基酸，这项技术随着时间的推移以及科学界的研究已经使它得到了充足的发展，它可以连续数周进行生产，这种方法转化效率极高，对生成的产物易分离，同时产物的纯度也很高。
1、酶的固定化方法：吸附法、包埋法、共价结合法、热处理法 2、提取酶的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、异丙醇、 3、酶生产的主要方式：固体发酵、液体深层通气发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵 4、酶的抽提剂有：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂等 5、测定酶蛋白含量的方法： 凯氏定氮法、双缩尿法、Folin 酚法、紫外法、色素结合法、BCA法、胶体金测定法 6、影响酶活力的主要因素：温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂 7、包埋固定化酶的凝胶有：聚丙烯酰胺、聚丙烯醇、光敏树脂、琼脂、明胶、海藻酸钙 8、酶的回收率：是指直接测定的固定化酶的活力占固定化之前的活力的百分比。 9、纯化倍数：就是经过纯化后得到的比活力与纯化前比活力之间的比值。 10、盐析的原理：蛋白质溶液在一定浓度范围内，加入无机盐，随着盐浓度增大，蛋白质的溶解度增大，但当盐浓度增到一定限度后，蛋白质将从溶液中析出。 11、在酶的反应过程中如何确保酶的最适反应温度和最适pH值。 保证最适温度的方法：通过发酵罐的热交换设施，控制冷源或热源流量；通过曲室的通风和加热设备控制。保证最适pH的方法：加酸或加碱，加碳源或氮源物质。 12、在发酵产酶过程中的准备工作： 收集筛选菌种，菌种保藏，细胞活化，扩大培养，培养基的配置，对发酵条件的控制。 13、为什么在测酶活实验中要连续不断的测酶活和酶蛋白含量 因为酶的活性会受温度和PH值的影响 14、终止酶反应的方法： 1、迅速升高温度； 2、加入强酸、强碱、尿素、乙醇等变性剂； 3、加入酶抑制剂； 4、调节反应液pH值。 15、固定化的优点： 1、可反复使用，稳定性高； 2、易与底物和产物分开，便于分离纯化； 3、可实现连续生产，提高效率。 16、培养基的成分：碳源、氮源、无机盐、生长因素、水。 17、菌种保藏方法： 1、斜面低温保藏法 2、液体石蜡油保藏法 3、砂土管保藏法 4、真空冷冻干燥法 5、液氮超低温保藏法。 18、发酵产酶的操作过程：配置培养基、分装、灭菌（112℃—115℃，20min）、孢子悬液（将无菌水加入斜面培养基）、接种、培养（32℃，180r/min，培养72h） 19、测定酶活的方法： 1、在一定时间内，让适量的底物与酶在最适合条件下； 2、加入酶抑制剂或升高温度等方法快速终止酶反应； 3、加一定量的显色剂与底物反应，测定液体的吸光度； 4、根据吸光度值计算出酶活 20、壳聚糖酶如何筛选：采用透明圈法，透明圈法直观、方便、根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈，从而可筛选出产生壳聚糖酶的菌株21、产壳聚糖酶初筛平板有什么现象，为什么 会出现透明圈，其原因是根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈 22、酶反应器： 分批式搅拌罐反应器、连续流搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、模型反应器、鼓泡塔反应器 23、对产酶的菌种的要求是： 1、产酶量高；2、繁殖快，发酵周期短；3、产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；4、能够利用廉价的原料，容易培养和管理；5、安全可靠，非致病菌。 24、在使用离心机时应注意事项 25、尿酶提取过程中为什么要在冰浴中进行 在冰浴中进行可以使尿酶处于低温条件下，低温能降低酶的活性，但不破坏酶的活性，在适合的温度下可恢复酶的活力 26、填充床的制备及应用的要点 装柱——平衡——应用——检测 装柱：均匀、无裂缝、无气泡、平整；平衡：1—2倍柱床体积缓冲液；应用：3%尿素溶液； 检测：定性：纳氏试剂（黄色或棕红色沉淀）——定量：取20ml流出液，用0.05mol/L标准HCL滴定（加2—3滴混合指示剂）
酶的应用与发展论文集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
摘要：生物工程是现代科技的一项高新技术,是当今最有发展前景的学科之一。而酶工程是生物工程的重要组成部分,酶作为生物催化剂,它广泛应用于食品、酿造、淀粉糖、制革、纺织、印刷、医药、石油化工等20多个领域。它可提高产品品质、改进产品工艺、降低劳动强度、节约原料和能源、保护环境,并产生巨大的经济效益和社会效益。关键字：酶工程酶的固定化酶的应用前景 从世界范围而言,酶制剂总量的55%是水解酶,主要用于焙烤食品、酿酒、淀粉加工、酒精和纺织等工业;35%是蛋白酶,主要用于洗涤剂、制革和乳品工业;其余是药用酶制剂、试剂级酶制剂和工具酶。 1酶工程 酶工程技术是利用酶和细胞或细胞器所具有的催化功能来生产人类所需产品的技术，包括酶的研制与生产，酶和细胞或细胞器的固定化技术，酶分子的修饰改造，以及生物传感器。 酶的生产 酶的生产是各种生物技术优化与组合的过程，分为生物提取法、生物合成法和化学合成法三种,其中生物提取法是最早采用而沿用至今的方法,它是指采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来；生物合成法是20世纪60年代以来酶生产的主要方法,是指利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程；而化学合成法因其成本高,且只能合成那些已经弄清楚化学结构的酶,所以难以进行工业化生产，至今仍处在实验室研究的阶段。
酶的纯化 酶的纯化属于一种后处理工艺，包括粗制工艺与精制工艺，对超酶液进行浓缩精制是生产高质量酶制剂的重要环节。其提纯手段一般是依据酶的分析大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立。要得到纯酶,一般需要将各种方法联合使用。最常用的纯化方法有根据溶解度特性的沉淀法;根据电荷极性的离子交换层析、等电点聚焦电泳等;根据大小或重量的离心分离、透析、超滤等;根据亲和部位的亲和层析、共价层析等。 酶的固定化技术 酶的固定化技术是把从生物体内提取出来的酶,用人工方法固定在载体上，这是是酶工程的核心,它使酶工程提高到一个新水平。自从1969年世界上第一次使用固相酶技术以来，至今已有40多年的历史。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制了,能将其从反应介质中回收,所以原则上能在批量操作或连续操作中重复使用酶。 固定化酶具有如下性质:酶的稳定性提高;最适pH值改变;酶的活性和催化底物有所变化;最适温度有所提高，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低;反应完成后可通过简单的方法回收,且酶活力降低不多,这样可使酶重复使用[3]。同时由于酶没有游离到产品中,便于产品的分离和纯化;实现批量或连续操作模型的可能,可进行于产业化、连续化、自动化生产。 2酶的应用现状 在食品业的应用
酶工程论文 酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。其主要任务是通过预先设计,经人工操作而获得大量所需的酶,并利用各种方法使酶发挥其最大的催化功能。本文意在阐述近年来酶工程在分子水平的研究进展,展示酶工程在医药、农业、食品、环境保护等领域的应用进展,并对其未来前景进行了展望。 一、酶工程技术在医药工业中的应用 现代酶工程具有技术先进、投资小、工艺简单、能耗粮耗低、产品收率高、效率高、效益大和污染小等优点,成为化学、医药工业应用方面的主力军。以往采用化学合成、微生物发酵及生物材料提取等传统技术生产的药品,皆可通过现代酶工程生产,甚至可获得传统技术不可能得到的昂贵药品,如人胰岛素、McAb、IFN、6一APA、7一ACA及7一ADCA等固定化基因工程菌、工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙结合,将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革 1、应用酶工程生产抗生素 应用酶工程可以制备青霉素酞化酶、头抱菌素酞化酶、头抱菌素、头抱菌素酞化酶、青 2014下半年教师资格证统考大备战中学教师资格考试小学教师资格考试幼儿教师资格考试教师资格证面试霉素酞化酶、脱乙酸头抱菌素、头抱菌素乙酸醋酶,
近年来还进行固定化产黄青霉青霉素合成酶系细胞生产青霉素的研究,合成青霉索和头抱菌素前体物的最新工艺也采用酶工程的方法。 2、应用酶工程生产维生素 制造2一酮基一L—古龙糖酸【山梨糖脱氢酶及L一山梨糖醛氧化酶】、肌醇【肌醇合成酶】、L—肉毒碱【胆碱脂酶】、CoA 【CoA合成酶系】等。由山梨醇和葡萄糖生产维生素及丙烯酸胺的生产也采用酶工程的方法四。 二、酶工程技术在农业中的应用 由于酶制剂主要作为催化剂与添加剂使用，从而带动了许多产业的发展。应用酶工程对农产品进行深加工，是人们努力的一个方向。乳制品加工则需要用凝乳酶和乳糖酶。此外，酶工程在饲料加工领域也有重大应用。 1、酶工程应用于农产品的深加工 利用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶的催化功能，以玉米淀粉等为原料生产高果糖浆等。乳制品加工则需要用凝乳酶和乳糖酶。农副产品的加工和综合利用需要用纤维素酶、果胶酶和木质素酶。此外，从木瓜中提取的木瓜蛋白酶，提高活性和固定化以后，可以被用来酿制啤酒和制造果汁。
酶工程的知识点总结 课题3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果 一、实验原理 1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。b5E2RGbCAP 2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽， 使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。p1EanqFDPw 3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉 对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。DXDiTa9E3d 二、实验步骤 1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果RTCrpUDGiT 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件 ①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果5PCzVD7HxA 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉 油渍 汗渍 血渍 观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。三、注意事项 1．变量的分析和控制 影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大 小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来 确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取 5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。jLBHrnAILg 2．洗涤方式和材料的选择。 在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控 制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜 色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血 渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告 摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。 关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度 1 前言 碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。 1.1实验目的 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。 1.2 实验试剂与仪器 1.2.1 实验仪器 电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机 1.2.2实验试剂及配制 95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠 （1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。 （2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶
酶分子定向进化的研究进展及应用 郭黄英 材料与化工学院生物工程 摘要：酶分子定向进化史模拟自然进化过程，具有适应面广、目的性强、效果显著等特点，可以在较短的时间内获得具有新的催化特性的酶突变体。定向进化可以显著提高酶活力，增强酶的稳定性，改变酶的底物专一性等，已经成为一种快速有效的改进酶的催化特性的手段。本文详细综述了酶分子定向进化的概念、过程、基本策略和核心技术，并列举了该技术在现实中的应用实例。 关键词：酶，定向进化，生物催化，应用 酶分子定向进化（enzyme molecular directed evolution）简称为酶定向进化，是模拟自然进化过程（随即突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。 酶定向进化的基本过程包括随机突变、构建突变基因文库、定向选择等步骤 酶的定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业、食品业、环境保护和药物开发等领域逐渐显示其生命力。 1.酶分子定向进化的研究背景 酶作为催化剂，已在生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等方面得到广泛应用。但随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低等缺陷使得酶催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。因此对天然酶分子的改造显得十分重要。 1993年，美国科学家Arnold F H L3首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造和构建新的非天然酶。酶分子定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，在过去几十年，定向进化已经成为作为生物催化剂的天然酶克服限制的重要工具，其对潜在的经济、环境、社会和医疗的影响是不可预计的，并且酶产品未来发展前景是无限的。 2. 酶分子定向进化的主要方法 2.1 易错PCR技术 易错PCR(error—prone PCR)技术是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链式反应（PCR），是扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。在进行PCR扩增目的基因时，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致目的基因发生随机突变。通过构建突变库，筛选出所需的突变体；经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR，即将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机突变，使每一次获得的小突变累积进而产生重要
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定 一、目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 二、实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性 环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km 三、实验器材 1.锥形瓶100～150ml（×6）。 2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。 3.温度计（0～100℃）。 4.微量滴定管5ml（×1）。 5.容量瓶1000ml（×1）。 四、实验试剂 1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。 2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。 3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min， 2d后过滤，棕色瓶保存。 4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml 浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加 热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确 浓度稀释成0.004mol/L即可。 5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻
度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释 成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。 6、25% H2SO4 五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂： 表一过氧化氢酶米氏常数的测定 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加 2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用 0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、计算 分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。 [S]=c1V1/10 式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2体积（ml）； 10：反应的总体积（ml）； υ：反应速度（m mol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4体积（ml）； 以1/υ对1/[S]作图求出Km。
酶工程 第一章：绪论 1、基因工程（genetic engineering ） 以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 2、细胞工程(Cell engineering) 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 3、发酵工程(Fermentation Engineering) 指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。 4、酶工程（Enzyme Engineering） 将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。 5、基因工程：DNA 细胞工程：细胞水平酶工程：蛋白质 发酵工程：微生物工业 6、1777年，意大利物理学家斯巴兰沙尼（Spallanzani）的山鹰实验。 1822年，美国外科医生博蒙特（Beaumont）研究食物在胃里的消化。 19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。 1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者”Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。 1890年，Fisher——锁钥学说。 1902年，Henri——中间产物学说。 1913年，Michaelis 和Menten——米氏学说。 1958年，Koshland——诱导契合学说。 1960年，Jacob 和Monod——操纵子学说。 1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶—Ribozyme。 1983年，Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。而RNase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。 1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。 1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。 1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。 1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。 1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。 1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。 Buchner兄弟的试验：用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。证明：发酵与细胞的存活无关，但是活细胞产生的。 1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来; 7、酶（enzyme）：活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。 8、单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成。 寡聚酶：由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。
实验目的：①、了解掌握双酶法制备淀粉糖。 ②、掌握用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量的方法。 目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。 1．仪器：恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。 2．试剂：生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。1mol/L HCI、无水CaCl2、。碘液、活性炭。1．液化： 取12g生粉，加150mL水配制成淀粉浆，加入0.1gCaCl2，2gα-淀粉酶，在75℃温度下保温45min，使淀粉液化成糊精。液化中可每隔3分钟搅拌一下, 每隔15分钟用碘反应检测，观察颜色变为褐色或棕色的情况，记录观察结果。45min后升温至100℃并保温10min。 2．糖化： 将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.5g糖化酶，将水浴槽温度升至60℃，保温糖化过夜，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。 3．脱色： 淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌15min后，抽滤，得浅黄色透明糖液。 4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。取1 m1滤液，加水稀释到10ml，用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量。
a=(0.406-0.0648)/0.5341=0.64 b=(0.395-0.0648)/0.5341=0.62 实验现象观察 1 6 7 思考题： 1液化时加入0.1gCaCl2的目的是什么？ 答：钙离子有提高热稳定性的作用。 2液化后冷却和调pH的目的是什么? 答：盐酸容易挥发，所以要冷却。 调ph是为了提供酶催化的环境。
固定化酶技术及其进展 姓名：蒋恋班级：08生物工程二班学号：20080804205 摘要：固定化酶便于运输和贮存，有利于自动化生产，是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术)及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题，展望了固定化酶技术在皮革行业中的研究与应用前景。 关键词：酶；固定化；技术；吸附 Immobilized enzyme technology and its progress Abstract：Immobilized enzyme is easy to transport, store and automatize production. It is a new application technique of enzyme in recent years. Immobilized enzymes have attractive application prospect in industrial production, chemical analysis, medicine and other aspects. The technology of immobilized enzyme was introduced in the paper. The concept, the traditional preparation methods and its modified methods, modern preparation methods of immobilized enzyme were presented. Key words：enzyme; immobilization; Technique; Absorption 酶的固定化( Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内, 仍能进行其特有的催化反应,并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时, 又克服了游离酶的不足,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。目前,寻找适用的固定化方法,设计合成性能优异且可控的载体,应用工艺的优化研究等仍是研究热点。改进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋势, 进一步提高转化率和生产能力,是未来研究的重点。 1 固定化酶的传统制备技术 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法、结晶法、分散法、离子结合法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应 ,整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是 ,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来 ,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。传统的酶固定化方法大致可分为4 类:吸附法、包埋法、交联法、共价结合法。 1.1 吸附法 用于固定酶的最早又最简单的方法是吸附法,即将酶的缓冲水溶液同表面活性物质接触一段时间,一些酶分子将被吸附，洗掉未吸附的游离酶，即得到吸附固定化酶。根据非水溶性载体表面的特性，酶与载体间的吸附作用可能是：
酶与酶工程 课程综述 题目：大蒜超氧化物歧化酶的提取及分离纯化方法研究姓名:保勇 学院：农学院 班级: 生物技术102班 学号: 103135202
大蒜超氧化物歧化酶的提取及分离纯化方法研究综述 作者：保勇指导老师：苏豫梅 摘要：本文归纳了大蒜超氧化物歧化酶的提取及分离纯化的多种方法，并对这些分离纯化的方法进行简要概述，概括了几种方法的优缺点，总结最适合用于提取大蒜超氧化物歧化酶的方法。阐述了大蒜SOD的理化性质及其种类和分布，对各种方法进行对比分析。并对其以后的发展前景作了简要的概述和分析。 关键词：超氧化物歧化酶；大蒜；分离纯化；方法 Research Progress on Isolation and Purification of Superoxide Dismutase(SOD) from Garlic Abstract: This article summarizes a variety of methods Garlic superoxide dismutase extraction and separation and purification, and separation and purification methods brief overview summarizes the advantages and disadvantages of several methods, sum up the most suitable for the extraction of garlic superoxide dismutasethe enzyme method. The Garlic SOD physical and chemical properties, their types and distribution, comparative analysis of the various methods. And gave a brief overview and analysis of its future development prospects. K ey words: Superoxide dismutase; Garlic; Isolation and purification; Method 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1）简称SOD，是一种广泛存在于动物、植物和好氧微生物细胞中的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基O 2 -发生歧化反应，平衡机体代谢过程中产生的过多自由基，减轻或消除自由基对机体的危害，具有抗衰老、免疫调节、抑制肿瘤、调节血脂、抗辐射、消炎和美容等功效。SOD 是当前生物学、医学以及化学研究领域中世界级的课题之一，且在我国已有专著问世［1］。大蒜是百合科（Liliaceae）葱属植物生蒜（Allium sativum L.）的鳞茎，大蒜中SOD的含量比其它植物相对较高［2］。从大蒜中提取SOD，成本低廉，因此研究大蒜SOD的分离纯化方法，对SOD生产工艺优化及应用具有重要意义。 1 SOD与氧自由基 自由基是指带有未成对电子的分子、原子或离子。因为未成对电子具有成双的趋向，因此常易发生失去或得到电子的反应而显示出较活泼的化学性质。在生物体 内，氧分子可以通过单电子接受反应，依次转变为O 2ˉ、H 2 2 与·OH等中间产物。 由于这些物质都是直接或间接地由分子氧转化而来，而且具有比分子氧更活泼的化学反应性，遂统称为活性氧，其中O 2 ˉ为主要的氧自由基[3]。 1.1.1氧自由基的产生与危害 自由基的产生，从物理化学的角度，通常有下列几种方式： （1）共价键的热分解。原则上只要有足够的温度，任何共价键都可以裂解而产生自由基。 （2）辐射分解。电离辐射可使许多物质发生分解而产生自由基，紫外线对人体的损伤亦然。 （3）单电子氧化还原反应。体内许多酶的反应是进行单电子转移，此过程可产
乙酸乙酯和苯甲醛的气相色谱图 # Time Area Height Width Area% Symmetry 1 2.748 5.3 2.5 0.0286 0.000 2.626 2 2.78 12.2 12.4 0.0154 0.000 0.95 3 2.827 4048.6 4776. 4 0.0139 0.074 0.844 4 2.859 5468212. 5 435181.4 0.2094 99.722 4.14E-2 5 3.673 332.1 96.2 0.0553 0.00 6 0.776 6 3.751 1864.5 282.5 0.099 0.034 0.339 7 4.295 195.5 26.4 0.1032 0.004 0.716 8 8.949 8753.3 1661.1 0.0715 0.160 0.193 9 13.198 23.7 81.1 0.0124 0.000 1.885
1 2.75 3.5 1.7 0.028 0.000 3.109 2 2.782 9.4 10.6 0.0144 0.000 1 3 2.831 3927.9 4558.8 0.0131 0.072 0.835 4 2.866 5380649 428421.7 0.2093 98.701 4.37E-2 5 3.675 314. 6 91. 7 0.052 0.006 0.781 6 3.752 1847.5 271.8 0.0993 0.034 0.333 7 4.298 178.7 22.3 0.1055 0.003 0.73 8 6.39 371.6 31.1 0.1585 0.007 0.386 9 11.325 460.8 31.7 0.1805 0.008 2.274 10 11.764 63716.1 10800.7 0.0798 1.169 0.248