鼠源抗体的人源化设计
前言 (1)
方法 (2)
结果与讨论 (3)
鼠源抗体筛选人源框架 (3)
人源化抗体CDR的改造 (4)
结论 (6)
附录 (6)
参考文献 (7)
前言
第一个人用抗体药物来自鼠源抗体，直到现在鼠源抗体仍然是抗体药物的一大来源[Pogson et al.,2016]。由于鼠源抗体的免疫原性，一般会对其作人源化处理。目前最通用的方法是将鼠抗的CDR序列移植到人源框架上[Hwang et al., 2005]。通常CDR移植后的人源化抗体与抗原的亲和力会减弱，如何保持人源化抗体的亲和力是目前最大的技术瓶颈。通过高通量的筛选方法可以得到适合CDR
移植的人源框架，但是这种实验方法周期长，价格昂贵[Townsend et al.,2015]。为了快速筛选出适合的人源框架，研究者利用序列比对和结构模拟的方法筛选出适合的人源框架，然后通过实验验证抗体与抗原的亲和力，减少了实验工作量，节约了成本和时间，未来会成为具有潜力的抗体人源化设计方法[Kurella et al., 2014;Choi et al.,2015;Choi et al.,2016]。本文采用自主开发的抗体人源化设计程序，对已知的鼠源抗体进行人源化设计，结果表明计算的方法可以筛选出序列同源性靠后但是亲和力更高的人源化框架。
方法
抗体阻断蛋白-蛋白相互作用的受体和配体结构已知（图1）。配体与抗体结合的区域重叠在受体和配体结合的区域（图2），所以鼠源的抗体可以有效阻断受体和配体的相互作用[Apgar et al.,2016]。通过鼠源抗体的人源化设计可以最大限度减少抗体的免疫原性。首先使用鼠源抗体（PDBID为5F3B）的序列在人源框架库中搜索排名靠前的序列作为候选序列，然后将人源序列同源建模到鼠源抗体的骨架上，保留鼠源CDR的序列，然后计算同源模型的能量，判断人源化抗体的稳定性。人源化CDR突变体采用相同的策略，不同之处在于替换鼠源CDR 序列为突变体序列，并且保留抗原的结构。
图1蛋白受体和配体复合体结构
图1中，黄色为配体结构，紫色为受体结构片段（PDBID：1NYU）
图2受体和配体以及抗体的复合体结构
图2中，黄色为配体结构，紫色为受体结构片段，绿色和青色为鼠源抗体重链和轻链。鼠源抗体的PDBID为5F3B。
结果与讨论
鼠源抗体筛选人源框架
使用鼠源抗体的序列在人的抗体框架库中筛选序列相似性靠前的框架，如图3所示，鼠的H链（5F3BH）可以找到相似性靠前的HM855688和AM940223两个框架，其中AM940223与实验使用的人源H链（5F3HH）完全一样。鼠的L链（5F3BL）可以找到相似性靠前的5个框架，没有出现与实验完全一样的人源L链（5F3HL）。实验并没有选择序列相似性排第一的人源框架（HM855688_X59318），而是排名靠后的人源框架（如图3所示，5F3HH_5F3HL与AM940223_X59318的相似性很高）。以上结果表明，鼠源序列相似性最高的人源框架并不一定是最合理的。由此可见，
利用序列相似性筛选人源框架并不能保证成功。合理的筛选标准应该能够表示抗体的稳定性，成药性等。其中抗体的稳定性可以用能量来表示，能量越低越稳定。如图3所示，AM940223_X59318的能量最低（能量取反），该人源框架最稳定（见附表1）。所以，通过能量筛选出的人源框架与实验最接近。
图3人源化框架的序列相似性和能量
图3中，横坐标表示与鼠抗H链序列相似性排前两位的人源框架，以及与鼠抗L链序列相似性排前5位的人源框架。纵坐标表示序列相似性以及链内能量（能量取反，见附表1）。其中5F3HH_5F3HL是实验使用的人源化框架，AM940223_X59318是计算筛选出的最稳定的人源化框架。
人源化抗体CDR的改造
为了减小人源化抗体中CDR的免疫原性，研究者通过突变CDR来获得与人源CDR相似的序列。这种突变虽然减少了鼠源CDR的免疫原性，但是同时也减小了抗体的与抗原的亲和力。实验的方法可以实现高通量筛选亲和力强的人源化CDR 突变体，但是工作量大，成本高，时间长。计算的方法已经被用于类似的研究，可以加速筛选到高亲和力并且低免疫原性的人源化抗体。我们使用CDR构象模拟的方法，计算了不同CDR突变体的亲和力，结果表明计算得到的结合能与抗体抗原亲和力高度相关（如图4，5所示，数据见附表2）。
图4不同人CDR突变体的亲和力与计算的结合能相关性图4中，横坐标表示用Biacore方法测得不同CDR突变体与靶蛋白的亲和力，纵坐标表示以鼠源抗体（5F3B）为模板，计算得到的不同CDR突变体与靶蛋白的
结合能。
图5不同人CDR突变体的亲和力与计算的结合能相关性图5中，横坐标表示用ELISA方法测得不同CDR突变体与靶蛋白的亲和力，纵坐标表示以鼠源抗体（5F3B）为模板，计算得到的不同CDR突变体与靶蛋白的
结合能。
结论
综上所述，我们提供了一种基于同源建模能量的抗体稳定性指标用于筛选鼠源抗体的人源化框架，以及基于抗体抗原结合能的亲和力判定方法。计算的结果与实验高度相关。
附录
附表1人源化框架与鼠抗的序列相似性以及计算的能量
HM855688_V01576188.522181.494-1335.87-1170.72
HM855688_Y14865188.522181.4436-1333.14-1162.41
bHM855688_X63398188.522180.9864-1335.87-1156.87
5F3HH_5F3HL185.748185.4072-1339.78-1172.53
AM940223_X59318185.748186.4776-1339.73-1180.94
AM940223_M64855185.748186.4284-1339.78-1173.34
AM940223_V01576185.748181.494-1339.78-1170.72
附表2鼠抗及其人源化版本的亲和力以及计算的结合能
Construct Biacore KD
a)ELISA IC50
a)
BiacoreΔG
b)
ELISAΔG
b)
ΔE
C)
RK351.0/1.4 2.500.61-15.91-12.64-48.4 RK351.0/1.557.00 5.94-14.05-11.28-47.2 RK351.2/1.0N/A N/A-5.00-5.0059.76 RK351.3/1.0N/A N/A-6.00-6.0056.82 RK351.4/1.0284.00 1.71-13.10-12.03-41.2
a)Apgar et al.Beyond CDR-grafting:Structure-guided humanization of framework and CDR regions of an anti-myostatin antibody.MAbs.2016,8(7):1302-1318.:DOI:10.1080/19420862.2016.1215786.
b)ΔG=-RTln(1/KD),ΔG=-RTln(1/IC50)
c)以5F3B为模板计算得到的结合能
参考文献
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MAbs.2016,8(7):1302-1318.DOI:10.1080/19420862.2016.1215786.
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人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。 人源化抗体技术 重构抗体 重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。 表面重塑抗体 表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得
抗HER2人源化单克隆抗体Herceptin的专利剖析供稿人：彭建新供稿时间：2004-12-30 关键字：HER2 单克隆抗体乳腺癌 乳腺癌严重地威胁着人们的健康，几乎所有人群的乳腺癌发病率都在上升，平均每年约升高1%，估计全球每年发病患者超过100万（cancer statistics 2002 cancer J Clin 2002,52(1):23）。 c-erbB2/ HER-2/ neu 编码产物p185erbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生 长因子受体(EGFR) 家族成员。C-erbB2/ HER-2/ neu 基因的扩增和p185erbB2蛋白的过度表 达见于多种恶性肿瘤,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺 癌。 p185erbB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。p185erbB2作为肿瘤 抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。美国食品及药物管理局( FDA) 已于1998 年10 月正式 批准将一株抗p185erbB2人源化抗体Trastuzumab （商品名Herceptin，Genentech/罗氏公 司）用于临床治疗p185erbB2高表达的转移性乳腺癌。 Genentech公司就Herceptin产品相关的专利申请了如下保护： （1）一种可与HER2受体胞外区特异性结合、抑制肿瘤细胞生长的单克隆抗体及该其在在治 疗过量表达HER2受体的癌症病人方面的应用。 （2）一种可与HER2受体胞外区特异性结合、使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性 因子更敏感的单克隆抗体。 （3）治疗过量表达HER2受体的癌症病人的方法，包括给上述患者服用有效量的细胞毒性因 子和能与HER2受体结合、使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性因子更敏感的抗体， 以消除或减小患者的肿瘤。 （4）细胞毒性因子和抗体抗原结合残基在上述权利要求方面的应用。 Genentech公司就与Herceptin产品相关的技术已在美国、日本、加拿大申请了专利保护， 具体的专利为：JP3502885、US5677171、US5720937、US5720954、US5725856、US5770195、 US5772997、JP11255666、JP11335297、JP3040121、CA1341082、US6165464、US6387371、 US6399063、US2002192211。 Genentech公司就抗HER2抗体的最新专利申请为（2004年公开的，以Her2 or c-erbB2 or c-erbB-2 or p185作为主题词）：
K E X I N科昕生物 北京科昕生物科技有限公司 重组抗PD-1全人单克隆抗体(细胞培养级别) Recombinant anti-Human PD-1 Functional Monoclonal Antibody （Cell Culture Grade） 产品说明： PD1 全人单抗可以有效地封闭PDL1 和PD1 的结合，并且不会引起 HAMA 反应（人抗鼠抗体反应）。PD1 的抗体已作为广谱性抗肿瘤药物被接受，也可能成为最有效地平衡细胞治疗的工具。PD1 是激活的T细胞、B 细胞以及髓样细胞膜表面重要的免疫调控受体。与配体PDL1和PDL2 结合，抑制T 细胞增殖和细胞因子分泌，影响细胞治疗的效果。近来研究发现，DC 细胞含有PDL1，DC‐CIK 联合治疗时，PDL1 可能是潜在的细胞治疗的负调节因素。PD‐1 主要在活化的T、B 和NK 等细胞上呈诱导性表达,PD‐1 有PD‐L1(B7‐H1,CD274)和PD‐L2(B7‐DC,CD273)两个配体。PD‐L1 广泛组成性表达于多种实质器官组织、免疫细胞以及多种类型的肿瘤细胞上,而PD‐L2 仅表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。PD‐1 随T 细胞活化程度逐步上调表达,与PD‐L 结合后引发抑制信号的产生，致使效应性T 细胞失能并及时进入凋亡。 本产品系由单克隆细胞株表达并高度纯化后的抗体经超滤换液分装制成。 本产品为无菌澄明液体，由含有 10mM PBS pH为 7.2的蛋白溶液经0.2um过滤后分装。 规格参数： 货号：kx10-1 体积：50ul/500ul/1ml 浓度：1mg/ml. 质量控制： 纯度：经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS-PAGE检测，纯度大于98.0%. 内毒素：小于1EU/mg. 使用说明： 建议长期-80℃分装保存，无菌条件下操作，避免污染。 具体用量需通过预实验确定。 1
人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆
#免疫学技术与方法# 人源化S CI D小鼠模型的建立及其鉴定① 席泓周桓朱一蓓戴继鸿於葛华胡玉敏张学光(苏州大学医学生物技术研究所,苏州215007) 中国图书分类号R392111文献标识码A文章编号1000-484X(2006)05-0459-04 [摘要]目的:探讨在SCID小鼠体内移植人免疫细胞,建立人源化SCID小鼠模型及其特性鉴定。方法:SCID小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)抑制骨髓造血,连续4天后,通过腹腔注射移植人外周血单个核细胞(PB M C)。4、8和12周后分别取小鼠外周血、脾脏、肝脏。荧光显微镜下观察SC ID小鼠外周血中人CD3+、CD19+细胞;流式细胞仪测定全血中人CD3+、CD19+细胞百分率;免疫组织化学分析SC I D小鼠肝脏和脾脏中人CD3+、CD19+细胞;EL IS A检测SC I D小鼠血清中人免疫球蛋白含量。结果:(1)SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4、8和12周后在小鼠外周血中通过荧光显微镜下可观察到人CD3+、CD19+细胞,4周后流式细胞仪测得小鼠外周血单个核细胞中人CD19+、CD3+细胞百分率分别为1016%、3117%;(2)免疫组织化学结果显示在小鼠脾脏中存在人CD3+、CD19+细胞;(3)移植人外周血单个核细胞4、8和12周后EL IS A测得小鼠血清中人免疫球蛋白的含量分别为390、1100和1040L g/m l。结论:成功地在SCID小鼠体内建立了人免疫系统。 [关键词]SCID;免疫系统;外周血单个核细胞;淋巴细胞 E stablish m ent and i dentificati on of hu manized S C I D m ouse m odel X I H ong,Z HOUH uan,Z H U Yi-B ei,DAI J i-H ong,YU G e-H ua,H U Yu-M i n,Z HANG X ue-Guang.B iotechnolo gy Institute of Suzhou University,Suzhou215007,China [Abstract]O bjective:T o establi sh and i den tif y hu m an ized-SCID m ouse model(hu-SC I D).M e thods:SCID mouse w as treated by CTX t o i nh i b i t the he m ocytopo iesis.W ith successi ve4-day i n j ection,hu m an periphera l b l ood m ononuc l ea r ce lls(PB M C)w ere en-g ra fted i n t o SC I D mouse t hrough i ntraper itonea l i n jecti on.A fter4,8and12w eeks of eng ra ft m ent,per i pheral blood,spleen and liver ti ssues of eng rafted SC I D m ouse w ere harvested.H u m an CD3+,CD19+ce lls i n periphera l blood w ere ana l y zed by i n florescence m-i croscopy and FC M,hu m an CD3+,CD19+cells i n sp l een and li ver tiss ues w ere observed by i m m une hist o che m i stry,and human Ig G level i n SCID m ouse serum w as m easured by EL ISA.Resu lts:A fter eng raft m ent of4,8and12w eeks,hu m an CD3+,CD19+ce lls in SC I D pe ri phe ra l b l ood w ere i den tified by i nflorescence m icroscopy and the percents w ere31%and10%respecti ve l y by FC M analysis. A nd t hese ce lls cou l d be ev i denced a fter12w eeks l a ter.T hrough i m m une h istochem istry hu m an CD3+、CD19+ce lls w ere detected in m ouse spleen but not i n li ver tissue.F urt her m ore the ti te r of hu m an IgG i n mouse se ru m w as390,1100and1040L g/m l a t each ti m e po i nt respecti ve l y.Con clusion:O ur exper i m enta l res u lts de m onstrated that a bona fide hu m anized SC I D m ode lw as establi shed. [K ey words]SC I D;I mm une syste m;PB M C;l ymphocyte SC I D小鼠即重症联合免疫缺陷综合症(Severe co m b i n ed i m m une defic ient d isease)小鼠,1983年由美国学者Bos m a首先发现于C.B-17近交系的小鼠,是由于位于16染色体的单个隐性突变基因所致[1]。纯合SC I D基因突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ编码顺序的重组酶活性异常,造成T、B淋巴细胞不能分化成功能性淋巴细胞。SC I D小鼠的所有T和B淋巴细胞功能测试均为阴性,对外源性抗原无细胞免疫及体液免疫应答,体内缺乏携带前 ①本课题为国家自然基金重点项目(30330540)和江苏省临床免疫 学重点实验室基金资助项目 作者简介:席泓(1973年-),女,博士; 指导教师及通讯作者:张学光(1951年-),男,教授,博士生导师,主 要从事肿瘤免疫研究,E-m ai:l s mbxu egz@pub- li c1.s https://www.doczj.com/doc/6c5162493.html,。B细胞、B细胞和T细胞表面标志的细胞。但是,其非淋巴性造血细胞分化不受突变基因的影响,巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞和红细胞等在数量和功能上均呈正常状态。鉴此SC I D小鼠缺乏免疫系统从而为免疫学研究提供了一个独特的动物模型,在移植免疫、自身免疫、感染性疾病、肿瘤免疫、肿瘤治疗的研究以及人源化单克隆抗体的研制中得到广泛应用[2-9]。本实验旨在SC I D体内建立人的免疫系统即人源化SC I D(hu m anized SC I D,hu-SI CD)小鼠模型,并对其免疫生物学特性进行初步的探讨。 1材料与方法 111动物SC I D小鼠,雌性,6~8周龄,购自中科院上海实验动物中心。于苏州大学生命科学院动物中心SPF实验室独立送风柜中(C I V-Ⅱ,苏州市冯氏实验动物设备有限公司)无菌饲养。对小鼠的实
人源化小鼠模型在感染性疾病方面的研究及应用摘要：研究人类疾病的发病机制需要理想的动物模型来进行大量的体内试验，但是动物种属差异使得某些病原微生物仅仅对人类具有特异的易感性及致病性，限制了人们对疾病发病机理的理解及预防治疗。因此，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化动物模型尤为重要。本文对人源化小鼠模型的研究概况及其在感染性疾病中的应用进行综述。 关键词：人源化小鼠；动物模型；感染性疾病 人源化小鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型通常被用于人类疾病体内研究的活体替代模型[1]。由于种属差异，利用普通动物模型得到的实验结果有时在人体上不能适用。所以，利用转基因或同源重组的方法，将人类基因“放置”在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型，大大提高了其作为模拟某些人类疾病的有效性。当前，基因被修饰的人源化小鼠模型已经在癌症、传染病、人类退化性疾病、血液病等许多不同的研究领域有广泛的应用，成为有价值的科研工具。近几年，带有人类基因的人源化小鼠模型已经被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景[2]。 1人源化小鼠模型的发展 人源化小鼠模型研究的第一次突破性进展是1983年Bosma等成功培养出的T/B淋巴细胞缺陷的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。Bosma等于近交系C.B-17小鼠中发现位于第16号染色体的单个基因隐性突变可导致小鼠出现T/B淋巴细胞缺陷的重症联合免疫缺陷综合征（SCID），称为SCID小鼠。SCID小鼠表现为缺乏成熟的功能性T、B淋巴细胞及低免疫球蛋白血症。造成SCID小鼠出现严重免疫缺陷的最主要原因是纯合SCID基因突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ编码顺序的重组酶活性异常，故不能有效地合成免疫球蛋白与T细胞受体。但是由于这种小鼠存在正常的自然杀伤(NK)细胞以及单核/巨噬细胞系统，应用这种小鼠产生的人源化小鼠模型效率不高[3]。NOD/SCID小鼠的发现和使用成为人源化小鼠模型发展过程中的又一里程碑式事件。为提高人类异种细胞移植的成功率，1995年Shultz等将SCID 突变基因导入到NOD小鼠身上获得非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)/SCID小鼠模型[4]。较C.B-17 SCID小鼠而言，NOD/SCID小鼠的NK细胞功能更弱，因而人类的细胞和组织的移植成功率也大大增加，但由于NOD/SCID小鼠生命周期短，并且仍具有部分自然杀伤细胞活性，导致其作为人源化动物模型应用受限。IL-2Rγ缺陷小鼠的出现及运用，使得免疫系统人源化小鼠得到实质性的改良。2004年Traggiai等通过将脐带血来源的人造血干细胞注射到经过亚致死剂量照射的新生BALB/c-Rag2-/-IL2rg-/-小鼠的肝脏，成功的在小鼠
人源化抗体 中文名称：人源化抗体 英文名称：humanized antibody 其他名称：互补决定区移植抗体 定义：将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。此抗体可明显降低由鼠源单克隆抗体所致的人抗鼠抗体反应。 概述 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。 人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。 嵌合抗体 嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 改型抗体 改型抗体也称CDR植入抗体(CDRgraftingantibody)，抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。然而，抗原虽然主要和抗体的CDR接触，但FR区也常参作用，影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后，这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区，可能改变了单抗原有的CDR构型，结合抗原的能力会下降甚至明显下降。虽然目前已能对抗体进行分子设计，在人源FR区引入鼠源FR区的某些关键残基，如配置得当，其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当，但人化抗体常达不到原有鼠源单抗的亲和力。 表面重塑抗体 表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。 全人源化抗体 全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一
抗体人源化技术进阶之路 在过去的十几年中，FDA已经批准了近100种抗体用于人类的疾病治疗。抗体药物经历了最初的多克隆抗体到单抗，并最终到基因工程的三个阶段。20世纪80年代初，随着鼠单抗在临床的大量应用，人们发现异源的鼠单抗所具有的免疫原性会引起强烈的抗抗体反应（HAMA），从而使患者发生严重的过敏反应和毒副作用，使其药物失去其应有的疗效。这使得之后的研究者致力于进行人源化改造，从而避免其在人体中免疫反应。经过多年的努力，目前人们已经可以使用嵌合抗体技术、人源化抗体技术、全人抗体技术来大大降低抗体药物的HAMA反应，以满足临床的要求（图1）。 虽然嵌合抗体成功地保留了亲本小鼠抗体的特异性，降低了其免疫原性，但是V区的FR区和CDR区仍有可能诱导强烈的HAMA反应。因此V区的人源化甚至全人源势在必行。在过去的几十年中，人源化方法已经多样化，目前人们已经创建了以重构抗体、表面重塑抗体、链替换抗体为代表的多种人源化抗体技术。 图1. 抗体人源化 重构抗体技术是英国剑桥大学Winter研究小组在1986年首先发明的，经过进一步完善，目前成熟的重构抗体技术路线是分析亲本鼠单抗的V区，确定CDR区和FR区，进而通过数据库检索比对和计算机同源建模，寻找出具有最大同源性的人的FR区模板，综合考虑确定FR区需要进行回复突变的关键残基，最终获得高亲和的人源化抗
体（图2）。目前在GeneBank 和IMGT等公用数据库中收录了大量的抗体的可变区基因共寻找最佳匹配的亲本鼠单抗的人FR序列。确定需要保留和改变的关键残基目前仍然是重构抗体人源化抗体最关键也是最困难的一步，它要求我们对于抗体抗原复合物的空间结构要具有足够的知识积累。当然目前人们已经总结出了一些需要保留的重要残基的规律，包括CDR两侧保守序列，有可能直接参与抗原结合位点以及对空间结构有重要影响的残基。目前已被批准的上市的人源抗体中，基本全采用的重构抗体技术。 图2. 重构抗体技术 CDR移植产生的人源化抗体对人类的免疫原性通常比小鼠或嵌合抗体低；但是，由于CDR不是人类的，它们仍然具有免疫原性。为了克服这一问题，一些研究人员提出用特异性决定残基(SDR)移植代替CDR移植来人源化抗体。人们发现在绝大多数抗体中通常只有约30%的CDR残基直接构成抗原抗体的结合位点。与CDR移植相比，仅移植数量更少且更关键的SDR将可能取得更佳的效果，比CDR移植相比具有更低的免疫原性。 CDR移植和SDR移植均是寻找最大同源性人抗体的V区序列作为改造的模板。与此不同，Hwang和他的同事设计了一种基于CDR区域同源性的抗体人源化的新方法。与通常的CDR移植方法不同，该方法不是寻找最大同源的人抗体作为模板，而是寻找与被改造的抗体的CDR结构同源的人胚系V区基因作为模板，然后简单、快速的将鼠单
鼠源抗体的人源化设计 前言 (1) 方法 (2) 结果与讨论 (3) 鼠源抗体筛选人源框架 (3) 人源化抗体CDR的改造 (4) 结论 (6) 附录 (6) 参考文献 (7) 前言 第一个人用抗体药物来自鼠源抗体，直到现在鼠源抗体仍然是抗体药物的一大来源[Pogson et al.,2016]。由于鼠源抗体的免疫原性，一般会对其作人源化处理。目前最通用的方法是将鼠抗的CDR序列移植到人源框架上[Hwang et al., 2005]。通常CDR移植后的人源化抗体与抗原的亲和力会减弱，如何保持人源化抗体的亲和力是目前最大的技术瓶颈。通过高通量的筛选方法可以得到适合CDR
移植的人源框架，但是这种实验方法周期长，价格昂贵[Townsend et al.,2015]。为了快速筛选出适合的人源框架，研究者利用序列比对和结构模拟的方法筛选出适合的人源框架，然后通过实验验证抗体与抗原的亲和力，减少了实验工作量，节约了成本和时间，未来会成为具有潜力的抗体人源化设计方法[Kurella et al., 2014;Choi et al.,2015;Choi et al.,2016]。本文采用自主开发的抗体人源化设计程序，对已知的鼠源抗体进行人源化设计，结果表明计算的方法可以筛选出序列同源性靠后但是亲和力更高的人源化框架。 方法 抗体阻断蛋白-蛋白相互作用的受体和配体结构已知（图1）。配体与抗体结合的区域重叠在受体和配体结合的区域（图2），所以鼠源的抗体可以有效阻断受体和配体的相互作用[Apgar et al.,2016]。通过鼠源抗体的人源化设计可以最大限度减少抗体的免疫原性。首先使用鼠源抗体（PDBID为5F3B）的序列在人源框架库中搜索排名靠前的序列作为候选序列，然后将人源序列同源建模到鼠源抗体的骨架上，保留鼠源CDR的序列，然后计算同源模型的能量，判断人源化抗体的稳定性。人源化CDR突变体采用相同的策略，不同之处在于替换鼠源CDR 序列为突变体序列，并且保留抗原的结构。
人源化抗体研究进展 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植和病毒感染等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。本文综述了人源化抗体的构建及其表达系统，在临床上的应用，存在的问题及展望。 关键词：嵌合抗体，人源化抗体，构建，临床应用 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 1 人源化抗体的构建 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。 1.1 嵌合抗体 抗体分子与大抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆抗体C区用人抗体C区代替而拼接成嵌合抗体(chimeric antibody)，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗
人源化抗体的研究进展 摘要：单克隆抗体的问世使得人们对于一种新的治疗疾病的药物充满期待，然而鼠源性抗体往往会受到人体免疫系统的排斥，因而抗体的人源化已成为治疗性抗体的发展趋势。用人抗体取代鼠抗体，是克服鼠单抗临床应用障碍的关键。随着分子生物学研究的深入和一些技术的突破，抗体人源化技术日益成熟。大量人源化抗体已经被广泛应用于临床试验和应用。本文主要介绍了目前人源化抗体构建的三种方法：嵌合、重构和表面重塑，并对人源化抗体的未来发展趋势进行了展望。 关键字：基因工程抗体人源化 1 基因工程抗体简介 基因工程抗体(genetically engineered antibod2ies ，GEAb)是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，它既保留或增加了天然抗体的特异性和生物学活性，又去除或减少了无关结构，降低或基本消除抗体的免疫原性，使抗体人源化，并改善抗体的药物动力学，具有生产简单，价格低廉，容易获得稀有抗体的优点，具有广阔的临床应用前景。其主要技术原理是：首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达细胞株，再用亲和层折等手段纯化抗体片段[1]。 1984年，Morrison等首次报道人鼠嵌合抗体在骨髓瘤成功表达，标志着基因工程抗体的诞生。1986年，Jones等人源化抗体构建和表达成功。1988年，Skerra 等第一次证明抗体的F ab和F v片段可以在大肠杆菌(E。coli)中正确地装配成保持原抗体特异性的小分子抗体。1989年，Huse等用外分泌型载体构建成功小鼠抗体库，利用抗体库技术获得了全人源化的抗体。1994年，德国基因工程抗体研究小组成功地将基因工程抗体在培养细胞中表达，抗体释放到组织培养液中，获得了较高的抗体产量[2]。 抗体药物的最大特征在于它识别抗原的高度专一性。本文主要介绍人源化抗体的发展历程与研究进展。近几年来随着鼠单抗人源化技术越来越成熟大量的人源性单抗被用于临床治疗肿瘤研究，并取得一定进展，由于其具有高效、低毒、病人不易产生抗药性等优点，同时又克服鼠单抗半衰期短、反复应用会引进病人的等缺点，人源性单抗已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物[3]。 2 人源化抗体的发展 早在一个世纪前，Paul Ehrlich就把抗体形容为“魔弹”，1975年杂交瘤技术建立以后，大量制备含有相同抗原决定簇的单克隆抗体成为可能，从而使“魔弹”进入了临床试验阶段[4]。1982年，当Philip Karr将第一株抗独特型单抗(anti-1d)应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功之后[5]，治疗性抗体的研究很快成为
人源化抗人CD28单克隆抗体说明书 产品名称 通用名称：人源化抗人CD28单克隆抗体 英文名称：Humanized anti-human CD28 monoclonal antibody 适用范围 用于T淋巴细胞激活扩增，适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性 CD28分子存在于大多数T细胞表面，被认为是一种T细胞特有的表面分子。T细胞对抗原的反应性主要 通过CD3/TCR复合物介导，但也有赖于T细胞表面其他分子的协同。T细胞可通过CD3/TCR、CD2和 CD28等多种途径被有效激活。从外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞在CD3、CD28单克隆抗体和 多种细胞因子存在的条件下，经过一定时间培养可以获得具有肿瘤细胞杀伤活性的CIK（Cytokine-induced Killer）细胞。 功能参数 使用说明 可溶法：推荐使用浓度为400ng/ml，在该浓度条件下细胞可获得充分的活化和刺激，细胞扩增倍数和最终的CD3+CD56+双阳率有明显提高。 包被法： 10mL PBS缓冲液（5ug/mL anti-human CD28）铺T75方瓶置于4℃过夜。使用前去除PBS缓冲液，生理盐水洗涤三次。 参考文献 1、Daniel Teschner *, Gregor Wenzel *, Eva Distler *, Elke Schnürer *, Matthias Theobald *, AxlA. Neurauter ?, Karoline Schjetne ? and Wolfgang Herr *. In vitro stimulation and expansion of human tumor- reactive CD8+cytotoxic T-lymphocytes by anti-CD3/CD28/CD137 magnetic beads .Scandinavian Journal of Immunology 2011, 74(2):155–164 2、D Sangiolo?, G Mesiano, F Carnevale-Schianca, W Piacibello, M Aglietta & A Cignetti . Cytokine induced killer cells as adoptive immunotherapy strategy to augment graft versus tumor after hematopoietic cell transplantation. Expert Opin. Biol. Ther. (2009) 9(7):831-840 3、RENATE SIEFKEN, ROLAND KURRLE,* AND REINHARD SCHWINZER.CD28-Mediated Activation of Resting Human T Cells without Costimulation of the CD3/TCR Complex. CELLULAR IMMUNOLOGY 176, 59–65 (1997)
人源化抗体发展及应用概略 【摘要】伴随着一系列重大生物技术（如PCR技术、抗体库技术、转基因动物技术等）的发展，抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。本文介绍了人源化抗体的构建及其表达系统，并对其临床应用进行了展望。 【关键词】嵌合抗体；人源化抗体；噬菌体展示技术；转基因技术 【Abstract】With the development of a series of substantial biotechnologies, such as PCR, phage display and transgenic animal, antibody techniques have developed from chimeric antibody and reshaped antibody to humanized antibody. As therapeutic antibodies, the humanized antibodies have been showed specific advantage and application prospect for cancer therapy,autoimmudisease,transplant rejection.The humanized antibody construction and expressing system, also foresaw tendency of humanized antibodies in clinical application have summarized in this paper. 【key word】chimeric antibodies; humanized antibodies; phage display; trangenic technology 引文： 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody,HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点。 正文： 1.人源化抗体的建构策略 鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA反应。对鼠源抗体进行人源化改造时要遵守两个原则，首先要保持抗体的亲和力和特异性，其次要降低或消除抗体的免疫原性。 1.1 嵌合抗体(Chimeric antibody) 20世纪80年代中期开始研制的第一代人源化抗体，即简单的嵌合抗体，是用人源基因代替鼠源单抗的恒定区。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫原性。美罗华(Rituximab)作为第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体，就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区(V)约占整个抗体的30％，鼠源性抗体V区中的框架区(FR)仍残留一定的免疫原性，可诱发HAMA反应。灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于短尾猿猴抗体的可变区几乎与人可变区无差异，这类嵌合抗体不需要作任何改变，而不致发生抗体反应。 Fab和F(ab’)，嵌合抗体的制备原理是将功能性抗体轻、重链可变区基因分别与人抗体的K链和重链CHl恒定区基因进行重组，克隆到表达载体中，构建成鼠一人嵌合的Fab基因表达载体，再转入宿主细胞表达。天然抗体分子重链CHl和CH2之间的一段铰链区结构，其中的2个Cys残基可以生成二硫键，将2条重链紧密地共价结合在一起。在Fab的C-端额外连接一
生物技术制药之单克隆抗体 【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。 【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用 【前言】 1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。 1、单克隆抗体定义 抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决