日立F-4600荧光分光光度计操作使用规程
荧光分光光度计操作使用规程如下：
开机顺序
（1）开启计算机。
（2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色。
打开运行软件
（1）双击桌面图标（FL Solution for F-4600）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。
（2）初始化结束后，须预热15-20分钟，按界面提示选择操作方式。
关机顺序（逆开机顺序实施操作）
（1）关闭运行软件FL Solution for F-4600。
（2）关闭仪器主机电源。
（3）关闭计算机。
注意事项
（1）为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高压、狭缝的设置一般不宜选在高档。
（2）关机后必须半小时（等氙灯温度降下）方可重新开机。
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 ２００３ 年４月
一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图
微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程 1. 概述 分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。 2. 标本类型 痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。 3. 鉴定 3.1 形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.2~0.5um） ×（1~5um）。革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。 3.2 培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固 体培养基上需要培养2~6星期方可见到菌落。菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉
于管底。 3.3 生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均 阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。 3.4鉴别要点： 3.4.1 本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄 色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。 3.4.2 与牛分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。 3.5 操作步骤 3.5.1 中性培养基 3.5.1.1 标本的处理 痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰 半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.
荧光分光光度计 荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。 基本结构与原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 基本结构和原理如图所示，光源与检测器成直角方式安排。 荧光分光光度计的工作原理： 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光 的形式放出，从而产生荧光． 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 荧光分光光度计基本结构和原理图 1. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 2．激发单色器： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
Nikon 80i荧光显微镜使用说明 △荧光显微镜属贵重仪器，未经保管人员同意请勿擅自使用。 △严格按照操作步骤进行，在使用过程中如发现问题应及时向保管人员反映。 △因违反操作规程，而导致仪器损坏，根据本中心《损坏仪器赔偿制度》进行赔偿。 △使用者在使用完毕后应进行登记. 维护和保养 本仪器应定期进行维护和保养。 ●防止镜头霉变，定期除湿。 ●为防止损坏荧光灯泡，荧光光源关闭后，15分钟内不得再重新开启。 ●荧光灯泡的最佳使用期限是200小时，如发现荧光强度明显降低应更换荧光灯泡。 荧光显微镜操作步骤 △显微镜系精密仪器，务请不要碰击，要仔细耐心使用。 △荧光光源关闭后，15分钟内不得再开启。 △荧光灯泡的最佳使用期限是200小时，因此每次使用时请尽量缩短时间。 1.插上电源插座，打开主机电源开关。 2. 将待检标本置于载物台上。 3. 用10×物镜对焦点，根据使用者的眼间距调节双目镜筒的间距。 4. 调节光圈及灯光强度至合适位置。 5. 调节粗调和微调使标本至最清晰。 6. 拔出活动杆，使光路通过CCD至显示器。 7.保存图象至电脑中。 8. 使用完毕后关掉电源，如镜头上有指纹或污迹用擦镜纸将其擦除。 ●荧光光源操作 1.插上荧光光源电源插座，打开荧光光源电源开关。 2. 打开光栅。 3. 根据使用荧光素的不同选择不同的荧光滤光片。 4. 将待检标本置于载物台上。 5. 用10×物镜对焦点，根据使用者的眼间距调节双目镜筒的间距。 6. 调节粗调和微调使标本至最清晰。 7. 拔出活动杆，使光路通过CCD至显示器。 8. 保存图象至电脑中。 9. 使用完毕后关掉电源，如镜头上有指纹或污迹用擦镜纸将其擦除。 10. 登记使用情况。 Nikon 80i主要技术参数：放大倍数40-1000，CFI60无限远光学系统，内置滤色镜，数字成像头。明场、暗场、简单偏光、荧光/明场、荧光/暗场。波长：330-380，450-490，510-560。主电压90~250V。频率：50~60HZ。功率消耗：最大160W。周围环境温度：10~36℃。相对湿度：0~80%。污染级别：2。 应用范围：正置明场、相差及荧光，主要用于细胞及细菌等的观察及荧光摄影。
高等仪器分析实验(荧光分光光度计的使用) 实验目的 1． 2．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步荧光光谱 3． 4．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方
F-2700荧光分光光度计操作规程 1、开机： （1）开启计算机 （2）开启仪器主机电源按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色为正常。 （3）双击桌面图标（FL Solutions 4.1 for F-7000），主机自行初始化，扫描界面自动进入 （4）初始化结束后，须预热15-20分钟，出现操作主界面（界面右下角出现Ready） 2、点击扫描界面右侧“Method” 在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（发射光谱/激发光谱） 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence (荧光测量) 设定波长扫描范围 扫描荧光激发光谱(Excitation)：需设定激发光的起始/终止波长（EX Start/End WL）和荧光发射波长（EM WL） 扫描荧光发射光谱(Emission)：需设定发射光的起始/终止波长（EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL） 其他选项可选择默认值（也可根据具体实验要求自行设定） 参数设置好后，点击“确定” 3、设置文件存储路径（此步也可不进行参数设置，可以在按5中方法进行保存） （1）点击扫描界面右侧“Sample” （2）样品名可自行命名 （3）选中“Auto File”，可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据（4）参数设置好后，点击“OK” 4、扫描测试 （1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子（请勿用力） （2）点击扫描界面右侧“Measure”，窗口在线出现扫描谱图 5、数据处理与保存 （1）选中自动弹出的数据窗口 （2）右键--“Trace”，进行读数并寻峰等操作 （3）“File”--“Save as”对数据进行保存 6、关机顺序： （1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000 （2）选中“Close the lamp，then close the monitor windows？”点击“Yes”窗口自动关闭同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色 （4）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热） （5）从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用 （6）关闭计算机
倒置荧光显微镜 操作规程 Olympus IX5 厦门大学医学院中心实验室 黄静茹 2017年3月
说明： ①透射光主开关；②汞灯高压电源开关；③透射光光强控制钮；④滤色片架； ⑤光路选择杆；⑥X轴和Y轴调节钮；⑦物镜转盘；⑧粗/微调焦旋钮； ⑨双目观察筒；⑩屈光度调节环；?聚光镜高度调节钮；?聚光镜对中旋钮；?视场光阑调节杆；?孔径光阑调节杆；?聚光镜转盘；?荧光光闸（SHUTTER）；?荧光激发块转盘；?荧光减光阀
正式操作仪器之前请注意如下事项： 首先要在仪器预约保护时间内及时使用本人注册的校园卡刷卡开始实验。 1.查看仪器使用记录本，如之前使用者有记录仪器异常情况，请不要开机使用。 2.查看仪器整体有无异常，周围环境是否正常，需要时要开启室内空调，检查 并清空除湿机水箱。 3.查看仪器使用记录本及刷卡机“日历”，如之前使用者刚刚关机，请等候30 分钟以上再开机使用。 一、开机 1、打开透射光源（白光）主开关①； 2、打开荧光光源（汞灯高压电源）②； 3、打开电脑，进入cellSens Standard工作站； 备注：标本为HE染色、免疫组化时，不需要打开荧光光源；标本为荧光染料染色时，一般也不需要打开白光光源。 二、明场观察（Bright Field BF） 1、正确放置标本，BF主要用于HE染色、免疫组化标本； 2、转动荧光激发块转盘?到“6”的位置； 3、转动聚光镜转盘?到“BF”位置，直到听到咔嗒声； 4、将光路选择杆⑤推进去（选择目镜观察光路）； 5、转动物镜转盘⑦，选用合适的物镜，调节白光光强控制钮③至合适的强度，调节粗/细调焦旋钮⑧聚焦观察,根据需要调节瞳间距⑨和屈光度⑩； 三、相衬观察（Phase contrast PH) 1、正确放置标本，PH主要用于没有任何染色的、较透明的标本； 2、转动荧光激发块转盘?到“6”的位置； 3、转动物镜转盘⑦，选用合适的物镜； 4、转动聚光镜转盘?，使相衬光学元件与所用物镜相匹配（见表1）； 5、将光路选择杆⑤推进去（选择目镜观察光路）； 6、调节光强控制钮③直至合适的强度，调节粗/细调焦旋钮⑧进行聚焦观察,根
分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能
《检验仪器学》作业 第二章 显微镜技术和显微镜 （1）简述光学显微镜的一般操作规程。 （2）荧光显微镜使用过程中的注意事项。 第四章 光谱分析技术机相关仪器 （1）试计算说明单色性不纯对分光光度法准确性的影响？ （2）某溶液用2cm 吸收池测量时，透射率为60%，其他条件不变，若改用0.5cm 和3.5cm 吸收池对此溶液进行测量，透射率和吸光度值分别为多少？（88%，0.055；40.8%，0.389） （3）在光度分析中，某溶液浓度为C 0，以1cm 吸收池测得透光度为T 0，若溶液浓度增加1倍，则透光度是多少？（T 02 ） （4）某溶液测得其吸光度为A 0，稀释后测得其吸光度为A 1，已知A 0－A 1＝0.477，稀释后的透射比T 1应为多少？（T 1=3T 0） （5）浓度为0.51mg/ml 的Cu 2+溶液，用环己酮草酰二腙显色后，于波长600nm 处用2cm 吸收池测量，测得透射率为50.5%，求摩尔吸光系数ε和比吸收系数a 。 （a=0.29L/(g*cm)；ε=18.64L/(mol*cm)） （6）将蛋白质溶液配制成下列标准浓度的溶液，加碱性硫酸铜显色后，在540nm 波长处测得透射率如下： 根据以上数据绘制标准曲线并使用最小二乘法给出标准曲线的表达式。另取未知蛋白质溶液，经同样操作测得吸光度值为0.306，求该蛋白质溶液的浓度。 21()010210102 [10] lg bc k k I I A k bc I I --+=++
（0.49g/L） （7）某种酶和一磷酸腺苷的混合物样品，在吸收峰处两组分相互干扰。如在波长280nm处测定时，总吸光度为0.460；在260nm处测定时，总吸光度为0.580。试计算各成分的浓度。吸收池厚度为1cm，摩尔吸光系数为： 酶：ε280=2.96ⅹ104/L mol cm 、ε260=1.52ⅹ104/L mol cm ，一磷酸腺苷：ε280=2.40ⅹ103/L mol cm 。 、ε260=1.50ⅹ104/L mol cm （酶：1.35*10-5mol/L；一磷酸腺苷：2.52*10-5mol/L） （8）下图为a、b两种物质的吸收光谱，如要使用等吸收双波长法分别测定两物质的含量，试作图选择测定波长和参比波长，并给出相应说明。 （9）用普通光度法测定铜，在相同条件下测得1.00×10-2 mol·L-1标准铜溶液和含铜试液的吸光度分别为0.699和1.00，如光度计透光度读数的相对误差为0.5％。测试液浓度测定的相对误差为多少？（-0.217%）
病毒的分离培养标准操作规程 1．目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。 2．术语：EID50/0.1ml，ELD50/0.1ml，TCID50/0.1ml，CPE 3．操作程序与方法： 3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、鼻腔、生殖道、肛门等）的分泌液。采集样品如不能立即处理，应冻存与-20℃备用。长 途运输应用冰盒或4℃低温保存。 3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UI/ml青、 链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4℃，长期保存用液氮。 3.3接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是 否产生特异性CPE，并计算及TCID50/0.1ml。禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。 3.4 病毒纯化：采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化； 3.5 动物回归实验：分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。 3.6分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段 进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。 3.7血清学鉴定：用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞 或鸡胚验证病毒特异性。或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。 4.注意事项 4.1采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离。 4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。 4.3 纯化好毒种应及时做好扩毒并建立毒种库。 1
荧光显微镜使用方法和荧光显微镜操作规程 荧光显微镜是中的一种。 关键字： 荧光显微镜使用方法 荧光显微镜操作规程 荧光显微镜使用 使用方法和荧光显微镜操作规程 1. 用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的灯光，除去显微镜的防尘罩，确保显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。 2. 将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。 3. 打开电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的±5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多揿动几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到最大发光效率，即可开始工作。 4. 灯泡的调中： （1）任选一块标本放在载物台上. （2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光（Ｖ）或蓝光（Ｂ）或绿光（Ｇ）激发滤色片组转入光路，并将10×荧光物镜转入光路。
（3）调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。 （4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至最大。 （5）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。 （6）调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。 （7）调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。 （8）转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。 5. 荧光观察： （1）将荧光染色标本放到载物台上。 （2）将10×平场物镜或40×荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。 （3）转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。 滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长＜双色束分离器的透射波长＜阻断滤光片的透射波长。 由于激发滤光片、双色束分离器和阻断滤光片，出厂时已按其用途和本身的光学特性进行了严格的组合匹配，在观察和摄影时，只需选择滤光片组即可。 （4）调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。 （5）当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。
高等仪器分析实验（荧光分光光度计的使用） 实验目的 1．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步 荧光光谱 2．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的 测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。 荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很 强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导 数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧 光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位
置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方 法：?laman=1/（1/? ex-?H2O /10 7）,其中波长单位为nm，?H2O 为溶剂的红外吸收波长，单位为波数，溶剂为水时，主要的红外吸收是O-H 伸缩振动，波长在3300波数。 狭缝的选择：激发和发射狭缝通常并不要求严格一致，为获得较好的灵敏度和准确反 应谱峰形状，测定激发光谱时，选用较大的发射狭缝和较小的激发狭缝是比较好的。而测 定发射光谱时则恰好相反。 灵敏度档的选择：灵敏度档与仪器中光电倍增管的放大倍数有关，对荧光比较弱的样 品，应选择灵敏度较高的档位，反之亦反。但注意不同档位之间的荧光强度值没有确定的 换算关系，不能相互比较。进行定量分析时，所有样品必须在同样的狭缝和灵敏度档位测 量。 仪器及试剂 970MC荧光分光光度计 缓冲溶液：10-2mol/L Na 2HPO4-NaOH 缓冲溶液，pH=11-12
荧光共定位的标准操作规程（编号：058） 1、目的及适用范围 该SOP用来规范荧光共定位操作。 2、主要仪器 摇床、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜 3、试剂及配制方法 DMEM （配方参考培养基）过滤灭菌、PBS pH7.2、PBST （PBS中加入0.5%TritonX100）、4%BSA （PBST配置）、一抗和相应的二抗、DAPI（1：5000 PBS配置）、4%多聚甲醛（PBS配置）、封片液（50%甘油，PBS配制） 4、操作步骤 4.1将灭菌后的盖玻片放入24孔板，每孔放一片，每孔加入0.5mL培养于含10%FCS的DMEM培养液中的293T细胞，37℃5%CO2孵箱孵育，待细胞长至合适密度，进行相关的实验。 4.2在相应的实验进行后，取出37℃5%CO2孵箱中培养的24孔板，吸去24孔板中的培养液，用PBS 洗一次。 4.3用含4%多聚甲醛的PBS室温固定细胞30min以上（可4℃固定过夜）。 4.4弃去多聚甲醛固定液，用PBST洗3次。时间保持在15min以上。 4.5用PBST配4%BSA 4℃封闭过夜或37℃1h，500μL/孔。 4.6取出4℃封闭过夜的24孔板，加入一定浓度用BSA稀释的一抗。37℃1h。 4.7 PBST洗5次，500μL /孔，10min/次，慢摇。 4.8选用相应的二抗荧光抗体，室温或37℃孵育1h，500μL/孔。 4.9 PBST洗5次，500μL /孔，10min/次，慢摇。 4.10 加入DAPI室温染色2~5min。PBST洗3次。 4.11 在盖片上滴一滴封片液，将盖片扣在载片上，以指甲油封闭四周。在避光4℃环境中可保存一周左右。激光共聚焦荧光显微镜观察。 5、注意事项 5.1本实验的最终细胞密度不能超过80%，在固定细胞时，尽量使细胞密度处于合适的状态，这样荧光照片的效果才比较好。 118
HITACHI 7180 (一)开机 1.确认水箱已开启。确认机器后面的电源（冷却用电源）已开启。 2.确认试剂盘2中45号位置无磷洗液充足，样品盘2中W1位置的碱性洗液充足。 3.打开仪器电源（仪器右上角粉色拉杆ON，电脑自动开启）。 (二)项目参数设定 1.项目添加 a)Utility→Application→Add application b)选择空白项目位置，键入项目名称 2.项目编辑 a)Utility→Application→Analyze b)选择需要编辑的项目编号 c)Diluent：0（默认为水）、99（保质期） d)Assay/Time/Point:模式选择、反应时间、试剂加入位置 e)Wave Length：输入副波长与主波长 f)Sample Volume：样品加样量Normal、Decrease、Increase第一列为加样量，如不需稀释其他位置默认 即可 g)Reagent：R1处输入试剂R1的量；R3处输入试剂R2的量 h)Reagent Dummy：选择Dummy 2节省试剂 i)Cell detergent：选择Wash2，选择酸、碱两种洗液清洗 j)设置好项目，点击OK保存 3.项目删除 a)Workplace→Data review→Batch Delete（确保所有数据无用或已拷贝，全部删除） b)Utility→Application→Analyze→Delete删除相应项目 (三)定标设定（Calibration） 1.添加定标项目 a)Calibration→Installation→Edit Calibrator→选择空白Position→设置项目编号（Code）与Position数字一 致→Add 2.设定定标浓度 a)Calibration→Installation →选择定标项目→Edit Concentration b)Test栏选择需要设定的项目名称，右侧按定标液顺序对应的栏位输入相应的定标浓度 c)第一定标液浓度应为0.00(小数点位数表示测定结果显示位数，其他定标液无需特别设置位数) d)Utility→Application→Calibration 选择需要定标的项目Calibration type：(Spline)/Point(6)Span Point：(6) 其他默认 e)Utility→Application→Standard 选择需要定标的项目Calibration code：依次键入（三）-1-a)中设置的定 标项目编号 f)Calibration→Status→Start up calibration选择需要定标的项目→Select→Full g)定标液摆入小样品盘对应设置好的Position h)定标完成后Calibration Information查看定标曲线 (四)试剂设定（Reagent） 1.R1试剂设定：Mannual settings→Disk 1→Position（可选位置）→Test name（项目名称）→Type(R1) →Size(L) 2.R2试剂设定：Mannual settings→Disk 2→Position（与R1相同）→Test name（项目名称）→Type(R3) →Size(L) (五)样品设定（Sample） 1.Data Review 检查空白序列 2.Workplace→Test Selection→Routine 3.Sample Type、Sample Volume、Sample Cup默认 4.Sequence No.（选择空白序列添加）→Disk 0→Position（样品盘中样品位置） 5.选定样品需要测定的项目（选中状态为蓝色高亮）
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 王国强黄建权编译 ２００２年４月
一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ ０ 表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重 态分别用Ｓ １、Ｓ ２ 表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、 二电子的激发三重态分别用Ｔ １和Ｔ ２ 表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图
涂片找抗酸杆菌操作规程 （改良碱性复红法） 1检验目的 检验样本中是否含有抗酸杆菌，为临床提供诊断依据。 2原理 结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色）。 3标本要求 （1）标本类型：病人的痰、穿刺关节液、腹水、胸积液、组织、脑脊液、分泌物、尿液等 （2）标本采集：见标本采集手册（一般须得深咳痰，其它无特殊要求。） （3）标本储存和运输：可室温保存、室温运送。病人标本须密封运送以避免污染环境。 4容器和添加剂类型 痰盒、尿杯、试管等 6试剂 试剂名称：结核菌染色液 （2）试剂生产厂家：广东省结核病研究所统一配制
（3）包装规格：3X500ML （4）试剂盒组成： 试剂1：石碳酸复红液 试剂2：酸性酒精溶液 试剂3：亚甲基蓝溶液 7仪器设备： CHKIKO320奥林巴斯双目显微镜BH-2奥林巴斯落射荧光显微镜8校准程序 送XX市计量质量检测研究所校准 9操作步骤 ⑴涂片经火焰固定，加石碳酸复红液染色5分钟或更久（需加温）。 ⑵水洗（之后尽可能将水沥干）。 ⑶加酸性酒精溶液，脱色1-2分钟。 ⑷水洗（假如标本面还可以看到残存红色时，再加酸性酒精溶液脱掉红色为止）。 ⑸加亚甲基蓝溶液染色30秒，水洗，干燥。 (6)镜检。 质量控制： 参加我科质量管理组的质量控制活动。 干扰和交叉反应 麻风菌可能对检验结果产生影响。 12生物参考区间
涂片未见抗酸杆菌 13患者检验结果的可报告区间 涂片未见抗酸杆菌/涂片见细长、红色抗酸杆菌 14临床意义： 结核分枝杆菌不产生内毒素和外毒素，其毒力主要是在机体中细胞内、外生长与大量繁殖的能力，细菌成分与其代谢产物引起免疫反应（Ⅳ型）导致一系列组织学上的意义。
日本日立F-7000荧光分光光度计基本操作规程 1、开机顺序 （1）开启计算机。（按图中圆圈按钮） （2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。（按下图中圆圈按钮） （3）观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，
都显示黄绿色。Xe LAMP灯先亮，RUN灯后亮。 2、打开运行软件。 （1）双击桌面图标（FL Solution 2.1 for F-7000）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。 （2）初始化结束后，须预热15-20分钟(若要进行定量分析，须预热
30分钟以上，按界面提示选择操作方式。 3.点击右上角Method,进行方法设置。 若要预扫描，可选择3-D scan（如下图）.设置好方法后（见下图），再点击右上角Pre Scan（如上图），
在Instrument Monitor菜单(见下图)的Data mode中选择Fluorescence, 在EX Start WL中输入激发波长200，EX End WL中输入激发波长500,在EM Start WL中输入发射波长210(有利于保护检测器)，在EM End WL中输入700(nm)，为节约扫描时间，扫描速度Scan speed可设置为30000。点击update,可知扫描需要多少时间。EX slit和EM slit一般选择5.0（若荧光强度太弱，可提高该数值， 若强度太高，可降低该数值），PMT Voltage （电压）中可选择700
（若荧光强度太弱，可提高该数值，若强度太高，可降低该数值），PMT Voltage 0-1000v前面的方框打勾后，可在上面的PMT Voltage 中随意填写电压值。在Response 中选择Auto。 在Processing菜单中(见下图)的 Y Axis中的Max中填5000或
眼角膜病理切片操作规程 1.取材 用镊子将眼球从10%福尔马林中取出，放在培养皿上，用剪刀 沿冠状方向剪掉眼球的后半部分（角膜面为前瓣部分，与角膜相对 的为眼球的后半部分），去除晶状体（透明坚硬小球）后，用剪刀 把巩膜剪掉，沿矢状面从角膜的正中把角膜平均分为两瓣，放入塑 料包埋盒内，标号，盖上盖子。 2.脱水 将包埋盒依次浸入70%酒精（14h），80%酒精（4h）,90%酒精 （4h），95%酒精（过夜），100%Ⅰ酒精（1h），100%Ⅱ酒精（1h）。 3.透明 将脱水完成后的包埋盒依次进入二甲苯Ⅰ（10min）,二甲苯Ⅱ（10min）。 4.浸蜡 将透明完成的包埋盒依次浸入蜡Ⅰ（1h），蜡Ⅱ(1h)。若为新 蜡块，在酒精灯熔化成液体状，室温凝固，再熔化为液体状才可使 用（去除气泡），将盛有液体状石蜡的烧杯放入烘箱（70℃）。 5.包埋 将包埋盒从液体石蜡中取出，打开包埋盒，将盖子去掉，用镊 子夹取角膜组织放入金属包埋模子中，沿着模子的一角缓缓倒入液 体石蜡，直到倒满整个模子。借助镊子使角膜的矢状面朝下垂直立 于模子中央，将塑料包埋盒底座盖在组织上，室温凝固后放入烧杯
中，用冷水冲洗10-20min，再拿出，去掉金属模子，将石蜡块放入 冰箱上层4℃保存。 6.切片 将石蜡块两侧多余部分修掉，使平齐，夹在刀片机上，调节厚 度5um，左手摇动手轮调节石蜡块与刀片间的距离，右手摇动手轮 切去多余部分，待切到组织时，左手停止摇动，右手摇动手轮切出 连续切片，用镊子和毛笔将切片展开在37℃水浴锅中，用镊子展平，待切片维持一定温度后，用载玻片（涂过多聚赖氨酸）倾斜入水， 从切片一端靠近，逐渐使切片贴在载玻片上，插在玻片架上。 7.烤片 将玻片架放入烘箱，设置温度70℃，烤片2h。 8.脱蜡 将载玻片连带玻片架依次浸入二甲苯Ⅰ（10min）,二甲苯Ⅱ（10min）。 9.水化 将脱蜡完的载玻片连带玻片架依次浸入100%、95%、70%、30% 乙醇各2min，温水2min，若脱蜡不干净，再温水2min。 10.染色 将载玻片用蒸馏水润湿1min，用滤纸吸干水分。用试剂一核染液染色3min，自来水冲洗3-5秒（背面冲洗）。用试剂二浆染液染色10-30秒，手拿载玻片放入盛有自来水的烧杯中涮几次。 将载玻片连带玻片架依次浸入30%、70%、95%、100%乙醇中各 2min（脱水），再依次浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中各2min（透 明）。用滤纸条吸干载玻片上液体。