细胞色素C的制备和含量测定
王甲马腾刘鑫林刘晓峰管伟
（北京科技大学化学与生物工程学院生物技术系北京100083）[摘要] 建立了以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸
铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤快速制备细胞色素C的方法，进而考察了制备蛋白质制品的一般原理和操作技术。测定细胞色素C含量时，其520nm处吸光度的标准曲线为：y = 0.7762x + 0.05，R2 = 0.9974；将细胞色素C粗品溶液稀释适当倍数，加入少许联二亚硫酸钠后，在520nm下测其吸光度A=0.210。样品原液浓度C=1.072 mg/mL；每500g心肌碎肉含细胞色素C=64.0 mg。
[关键词] 细胞色素C 分离纯化分光光度法
1引言
生物大分子主要是指蛋白质、酶和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前提，结构与功能的研究就无从谈起。
细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。
细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。
细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜动物心脏为材料提取、纯化细胞色素C，制备其粗品溶液，方法简单易操作。
2实验部分
2．1 试剂和仪器
2.1.1 材料
猪心。
2.1.2 试剂
2mol/LH2SO4溶液，1mol/LNH4OH（氨水）溶液，0.2%NaCl溶液，25% （NH4）2SO4溶液，BaCl2试剂，20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石白色颗粒，不溶于水，溶于酸，选用60-80目。联二亚硫酸钠（dithionite，Na2S2O4·2H2O）。
2.1.3 器材
绞肉机，电磁搅拌机，电动搅拌机，离心机，722型分光光度计，玻璃柱（2.5×30cm），500mL下口瓶，烧杯（2000mL，1000mL，500mL，400mL，200mL各一个），量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃搅棒，透析纸，纱布。
2. 2 细胞色素C的制备
2.2.1 材料处理
新鲜或冰冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎。
2.2.2 提取
称取心肌碎肉150g，放入1000mL烧杯中，加蒸馏水300mL。用电动搅拌器搅拌，加入2mol/LH2SO4，调pH 至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取2h。用1mol/LNH4OH调pH至6.0，停止搅拌。用数层纱布挤压过滤，收集滤液，滤渣加入750mL蒸馏水，按上述条件重复提取1h，两次提取液合并（为减少学时，可只提取一次）。
2.2.3 中和
用1mol/LNH4OH将上述提取液调pH至7.2，静置适当时间后过滤，所得红色滤液通过人造沸石柱吸附。
2.2.4 吸附
人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25%硫酸铵溶液洗脱下来，利用此特性细胞色素C与其他杂蛋白分开。具体操作如下：
称取人造沸石11g，放入烧杯中，加水后搅动，用倾泻法除去12s内不下沉的细颗粒。
剪裁大小合适的一块圆形泡沫塑料，安装入干净的玻璃柱底部，将柱架至垂直，往下端连接乳胶管，用夹子夹住，向柱内加蒸馏水至2/3体积，然后将预处理好的人造沸石装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。将中和好的澄清滤液装入下口瓶，使之沿柱壁缓缓流入柱内，进行吸附，流出液的速度约为10mL/min。随着细胞色素C的被吸附，人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。
2.2.5 洗脱
吸附完毕，将红色人造沸石自柱内取出，放入烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水洗涤至水清，再用100mL0.2%NaCl溶液分3次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，重新装柱，也可在柱内，用同样的方法洗涤沸石，然后用 2.5%硫酸铵溶液洗脱，流速控制在2mL/min以下，收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），洗脱完毕，人造沸石可再生利用。
2.2.6 盐析
为了进一步提纯细胞色素C，在洗脱液中，继续慢慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度），放置30min以上
（最好过夜），杂质蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液。
2.2.7 三氯乙酸沉淀
在搅拌下，每100mL细胞色素C溶液加入2.5-5.0mL20%三氯乙酸，细胞色
素C沉淀析出，立即以3000r/min的转速离心15min，倾去上清液（如上清液带
红色，应在加入适量三氯乙酸，重复离心），收集沉淀的细胞色素C，加入少许
蒸馏水，用玻璃棒搅动，使沉淀溶解。
2.2.8 透析
将沉淀的细胞色素C溶解于少量蒸馏水后，装入透析袋，放进500mL烧杯
中（用电磁搅拌器搅拌），对蒸馏水透析，15min换水一次，换水3-4次，检查
是否已被除净。检查的方法是，取2mLBaCl2溶液放入一支普通试管，滴加2-3
滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示未除净，如果无沉淀出现，表示透
析完全。将透析滤过液，即得清亮的细胞色素C粗品溶液。
2.2.9 含量测定
取1mL标准品（81mg/mL），用水稀释至25mL，从中取0.2，0.4, 0.6，0.8
和1.0mL，分别放入5支试管中，每管补加蒸馏水至4mL，并加少许联二亚硫酸
钠作还原剂，然后在520nm波长处测得各管的光吸收值，以上述经稀释25倍标
准样品的毫升数或计算得到的浓度值（mg/mL）为横坐标，A值为纵坐标，作出
标准曲线图，从而求得斜率。
取样品1mL，稀释适当倍数（本实验稀释25倍），再取此稀释液1mL加水
3mL，再加少许连二亚硫酸钠，然后再波长520nm处测得A值，重复一次，取
平均值。根据此Ａ值查标准曲线，得细胞色素Ｃ浓度，再计算其样品原浓度，或
根据标准曲线斜率计算样品原液浓度。
3 结果与讨论
3. 1 细胞色素C的含量测定
3.1.1 分光光度法的优化
本实验方法制备的细胞色素C是还原型和氧化型的混合物，因此在测定含量时，要加入联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型细胞色素C变为还原型。还原型
细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用国产722
型分光光度计选一标准品，作出细胞色素C浓度和对应吸光度的标准曲线，然后
根据所测溶液的光吸收值，由标准曲线的方程求出所测样品的含量。
3.2.2 标准曲线的绘制
试管编号 1 2 3 4 5 样1 样2
2.5mg/mL标准细胞色素C溶液
0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0 （mL）
去离子水（mL） 3.8 3.6 3.4 3.2 3 4 4
联二亚硫酸钠（mL）0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
粗品液（mL）0 0 0 0 0 1 1
总体积（mL） 4.2 4.2 4.2 4.2 4.2 5.2 5.2 浓度（mg/mL）0.119 0.238 0.357 0.476 0.595 X1X2 A520nm0.150 0.231 0.316 0.423 0.516 0.221 0.200
用Excel软件绘制标准曲线，方程：y = 0.7765x + 0.05；R2 = 0.9974 标准曲线近似为一条直线，R2 = 0.9974，说明线性程度较好，引起的偏差较小。
3.2.3 样品含量的计算
样品稀释液ā520nm=1/2(A1+A2)=0.210；将其带入标准曲线方程y = 0.7765x + 0.05，计算稀释液浓度X= 0.2061 mg/mL。
稀释倍数=5.2mL/1.0mL=5.2，所以样品原液浓度d=0.2061×5.2=1.072 mg/mL，细胞色素C溶液体积=18.0 mL，所以粗品总量（150.77g心肌碎肉）含细胞色素C=18.0mL*1.072 mg/mL=19.30 mg。
每500g心肌碎肉含细胞色素C=19.30 mg ×500g/150.77g=64.0mg。
理论上，每500g心肌碎肉，应获得75mg以上的细胞色素C粗制品。本实验结果偏低可能是在用数层纱布挤压过滤时，滤渣中的细胞色素C未充分提取的缘故；也可能是由于洗脱时在洗脱液仍为微红色时就停止洗脱。
3.2.4 生物大分子制备的一般步骤
生物大分子的制备通常可以按以下步骤进行:
①确定目的和要求；②建立相应可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键；③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质；④生物材料的破碎和预处理；⑤分离纯化方案的选择和探索；⑥生物大分子制备物纯度的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC的毛细管电泳都是一个峰；⑦产物的浓缩，干燥和保存。
3.2.5 生物大分子的分离纯化
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于某一物相中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等，目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。由于生物大分子不能加热溶化和汽化，因此所能分配的物相只限于固相和液相，在此两者之间交替进行分离纯化。实际工作中，往往要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
生物大分子能否高效率的制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。
制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：①以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。②以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。③以电荷差异
为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。
在分离纯化流程中，早期和晚期的分离纯化方法的选择有明显的不同：
（1）早期分离纯化
1）特点：①粗提取液中物质成份十分复杂。②欲制备的生物大分子浓度很稀。③物理化学性质相近的物质很多。④希望能除去大部分与目的
产物物理化学性质差异大的杂质。
2）对所选方法的要求：①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力不必太高。④负荷能力要大。
3）可选用的方法：吸附，萃取，沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等），离子交换（批量吸附、胖柱交换），亲和层析等。
（2）晚期分离纯化
1）可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。
2）要注意的一些问题；
①盐析后要及时脱盐。
②用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能
是柱床体积的1/10~1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。
③必要时也可重复使用同一种分离纯化方法，例如分级有机溶剂沉淀，
分级盐析，连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。
④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高
效率。例如吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效
率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可
以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。
⑤分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多
敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低
温下（如在冷室中）进行。
⑥得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，-20℃
或-70℃保存。
4 参考文献
[1] 时国庆生物化学实验讲义
HPLC含量测定分析方法验证中数据可接受标准讨论 在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，中国药典2005年版附录规定了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文提出了在对HPLC含量测定方法进行验证时的可接受标准，供大家讨论。 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在80％至120％的浓度范围内配制5份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。 3．精密度 1）重复性 配制6份相同浓度或分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 2）中间精密度 配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。 5．检测限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 6．定量限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。 7．耐用性 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，选择至少三个不同厂家或不同批号的同类色谱柱，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，分离度应大于1.5；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。 8、系统适应性
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
细胞色素C的制备及测定 一．摘要 本实验以猪心为原料提取细胞色素C，通过三氯乙酸溶液沉淀、硫酸铵粉末抽提和透析等一系列步骤制备得细胞色素C溶液，并利用消光法对其进行鉴定。由实验可得，重量为166.6g心肌可得到38.0ml的细胞色素C溶液，其中蛋白质含量为0.71724mg/ml，细胞色素C产量为9.9023mg，产率为59.44mg/公斤；从实验中还可得，氧化型样品的最大吸收峰应在410毫微米、530毫微米。还原型样品的最大吸收峰应在410毫微米、520毫微米及550毫微米。 二．关键词：细胞色素C、猪心、制备、测定 正文 1.前言 细胞色素是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素 C 是其中的一种【1】。自然界中，细胞色素C 的含量与组织的活动强度成正比。以哺乳动物的心肌、鸟类的胸肌和昆虫的翼肌含量最多，肝、肾次之，皮肤和肺中最少。细胞色素 C 是一种重要的细胞呼吸激活剂，常作为组织缺氧治疗的急救用药和辅助用药，如 C O 中毒、安眠药中毒、初生婴儿窒息、严重休克期缺氧、麻醉前处理以及肺部疾患引起的呼吸困难、高山缺氧、各种脑部疾病引起的脑缺氧、各种心脏疾患的缺氧。也用于脑血管障碍、中风后遗症、乙型脑炎后遗症等的治疗。另外细胞色素 C 还能促进受损肝细胞的再生、骨髓造血机能修复以及显著减轻由放疗引起的白细胞减少症。通常外源性细胞色素 C 不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素 C 便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用，最终在一定程度上恢复损伤的电子传递链【2-4】。因文献中有关细胞色素C的研究鲜见，本实验采用猪心为原料对其进行研究。 2．实验部分 2.1实验原理
HPLC 含量测定分析方法验证中数据可接受标准讨论 在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，中国药典2005年版附录规定了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文提出了在对HPLC 含量测定方法进行验证时的可接受标准，供大家讨论。 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD ）应不大于2.0%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在80％至120％的浓度范围内配制5份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X ），峰面积为纵坐标（Y ），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R ）不得小于0.998，Y 轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。
3．精密度 1）重复性 配制6份相同浓度或分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 2）中间精密度 配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。 5．检测限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 6．定量限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。 7．耐用性 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH 值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，选择至少三个不同厂家或不同批号的同类色谱柱，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于
实验三吸附法制备细胞色素C 粗品 一、实验目的 1．学习细胞色素C 的理化性质及其生物学功能。 2．掌握制备细胞色素C 的原理。 3．掌握制备细胞色素C 的操作技术。 二、实验原理 细胞色素C（cytochrome,Cyt）是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b 和细胞色素aa3 之间，细胞色素C 的作用是在生物氧化过程中传递电子。 细胞色素C 分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000 道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。细胞色素C 分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C 制成还原型的，氧化型细胞色素C 在408nm、530nm 有最大吸收峰，还原型细胞色素C 的最大吸收峰为415nm、520nm 和550nm，这一特性可用于细胞色素C 的含量测定。 由于细胞色素C 在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。 三、实验材料 1. 实验器材 绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；72l 型分光光度计；烧杯(2000、1000、500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋 2. 实验试剂 ⑴1M H2S04 溶液；1M NH40H 溶液；固体硫酸铵 ⑵25％硫酸铵溶液: 100m1 蒸馏水中含25 克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度 ⑶0.2％氯化钠溶液：称0.2 克氯化钠，用蒸馏水溶解并定容至100ml. ⑷10%乙酸钡试剂：称10 克乙酸钡, 溶于100ml 蒸馏水中。 ⑸20％三氯醋酸溶液 (6) 人造沸石(60～80 目)
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
实验四高效液相色谱法测定V E含量 1 实验目的 1.1了解高效液相色谱仪的基本操作； 1.2了解高效液相色谱仪测定V E的原理。 2 实验原理 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。 V E（维生素E）又名生育酚或产妊酚，在食油、水果、蔬菜及粮食中均存在。有抗氧化作用，能增强皮肤毛细血管抵抗力，并维持正常通透性；有改善血液循环及调整生育功能、抗衰老作用等。V E通过高效液相色谱柱进行分离，PDA检测器检测，外标法定量。 3实验器材 3.1 实验样品 V E样品溶液 3.2 实验试剂 浓度为50μg/ml的V E标样 3.3 实验仪器 高效液相色谱仪附PDA检测器 4 色谱条件 色谱柱：C18柱；流动相速度：0.3ml/min； 进样量：5μl；柱温：30℃。
5 实验结果与讨论 5.1实验结果 本次实验采用的是单点法测定。实验结果见表1。 表1. 液相色谱仪测定苹果的VE含量 样品中VE的浓度=乙烯标样的总量×苹果的峰面积/乙烯标样的峰面积 =5μl×50μg/mL×17369/（5μl×42217）=20.57μg/mL 5.2实验讨论 本次实验中，测定标样溶液V E含量时，在指定的保留时间内并未出峰。讨论分析原因：样品溶液在上周实验后，一直置于离心管中，未避光低温保存，导致样品中V E氧化，液相测定时没有在相应的时间出峰。本次实验时间较短，且主要目的是了解高效液相色谱仪的基本操作，以及液相色谱仪测定V E的原理，故结合前组同学对V E含量的测定数据进行讨论与分析。 因时间有限，实验采用了单点法进行测量分析，且无平行重复，这样误差较大。我们以后实验时，V E标样可以选择5个浓度，每个浓度分别测定3-4次，取其峰面积的平均值后作标准曲线，这样误差更小。 6知识扩展 6.1高效液相色谱仪包括哪几个部分组成？ 答：高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测器这四个部分组成，其流程图见图1。 输液系统包括贮液槽和输液管道、高压泵和梯度洗脱装置。贮液槽，通常是由玻璃或不锈钢等材料制成的，用来存贮足够数量、符合分析要求流动相的容器。输液管道是管道内径很小的用于连接高效液相色谱仪各主要流路系统。高压泵是将流动相在高压下连续送入色谱柱，使样品在色谱柱内完成分离过程。高效液相色谱仪采用的是往复式恒流泵，是具有输出压力高、流量稳定、流量可调范围宽、泵内死体积小、具有梯度洗脱及耐酸碱腐蚀、溶剂更换迅速等性能。梯度洗脱装
细胞色素C的制备及提取 一、实验目的 (1 ) 了解细胞色素C的理化性质。 (2）通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤 （3）掌握制备细胞色素C的操作 二、实验原理 细胞色素是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分，细胞色素C 的作用是在生物氧化过程中传递电子。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为PH10.8，易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变形，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，猪心细胞色素C相对分子质量为12200，酵母细胞色素C相对分子质量为13000左右。 细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并且易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm、550nm，这一特性可用于细胞色素C的含量测定。 通常外源性的细胞色素C不能进入健康细胞的，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的急救和辅助治疗。细胞色素C可作为细胞呼吸激活剂，常用于组织缺氧的急救和辅助用药，适用于治疗由脑缺氧、心肌缺氧和其他组织缺氧引起的一系列症状。 细胞色素C注射液为细胞色素C的灭菌水溶液，内含物的稳定剂双甘氨肽和抗氧化剂亚硫酸氢钠，为橙红色的澄明液体。注射液细胞色素C系用细胞色素C加适宜的赋形剂和抗氧剂，用经冷冻干燥制得的无菌制品，为桃红色冻干块状物，易溶于水。本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取、人造沸石吸附、硫酸铵溶液洗脱、三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。 三、实验试剂、仪器与材料 1、材料：冰冻猪心、人造沸石、纱布、阳离子交换树脂AmberliteIRC-50 2、试剂：硫酸、氨水、氯化钠、硫酸铵、氢氧化钠、三氯醋酸、亚硫酸氢钠、双甘肽。 3、仪器：绞肉机、磁力搅拌器、色谱柱、酸度计、电子天平、烧杯、量筒、透析袋。 四、实验步骤 1、材料处理 取冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切碎，放入绞肉机中绞碎。 2、提取、压滤 称取绞碎猪心肌肉，加1.5倍蒸馏水，搅拌均匀，用2mol/l的H2SO4调PH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在温室条件下搅拌提取2h，提取过程中，使抽提液的PH值保持在4.0左右。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液，用1mol/l氨水(NH4OH)调PH至6.2离心，分离取清夜。滤渣加入等量蒸馏水，再按上述条件提取一次，两次提取液合并。 猪心__绞碎__碎肉__加入H2SO4,提取，压滤__滤液__NH3.H2O,PH6.2,分离__提取液 3、中和 将上述提取液用2mol/lNH4OH调至PH7.2，在水浴中静置沉淀蛋白质（此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），30—40min后过滤，所得滤液准备通过人
本贴的目的：讨论目前审评尺度下，药品研发过程中，分析方法的验证项目及目的，试验方法，试验要求本帖仅仅针对于HPLC方法进行讨论 方法开发的内容不在本帖讨论范围内 1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体） 有关物质方法验证的前提条件： 1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离 2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。 3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度 4.各杂质纯度已知 5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度 6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明 1.1专属性： 1.1.1概念 在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。 1.1.2试验方法 1.1. 2.1定位试验： A.目的 对各已知杂质和主峰进行定位 B.试验方法： a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液 b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液 c．使用拟定分析方法分别进行定位。 C.试验要求： a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点 b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定 c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）； 1.1. 2.2强制降解试验 A.目的 一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。 B.试验方法 对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。试验一般的范围为： 强酸：0.1~5.0mol/L HCl溶液或视情况调节时间，温度，体积
细胞色素C的制备测定及SDS—PAGE纯度鉴定 摘要：本文研究细胞色素C的制备及测定方法和SDS-PAGE测定蛋白质分子质量及纯度鉴定，以猪心未原料，采用离心、透析、抽提、抽滤、沉淀等技术，制备出细胞色素C，然后用消光法，紫外吸收法测得细胞色素C的产量，蛋白质的总含量。再运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定细胞色素C的分子质量。实验结果细胞色素C的产量为8.84mg，产率为60.86mg/kg,蛋白质浓度为0.722mg/ml,纯度为38.04%，细胞色素C的分子质量为12417，相对误差为0.14%。 关键词：细胞色素C 离心抽提抽滤透析消光法紫外吸收法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯度 前言：细胞色素C是一种细胞色素C(Cytochrome C)是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,是呼吸链中的一个基本成分,广泛存在于所有的需氧组织中。一般说来,组织的细胞色素C的含量与它们的呼吸活性大致成平行关系,在心肌与其它作剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。在细胞内细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,是线粒体电子传递链中重要成员,在生物氧化过程中起着重要作用。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂,早期研究发现在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态,在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢,使细胞恢复正常呼吸,病情得到缓解或痊愈目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。本实验以猪心为原料，向心肌中加入三氯乙酸溶液中，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸溶液中。将硫酸氨粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白，血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C则仍留于溶液中。进一步用三氯乙酸酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。鉴定及测定细胞色素C用消光法。在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9*10^4/克分子/厘米，还原型细胞色素C：K2=2.77*10^4/克分子/厘米，样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者还原型转变为氧化型，消光值的情况相同。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入了离子去污剂和强还原剂，使SDS蛋白质络合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小。当蛋白质的分子质量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 正文： 1.材料与方法 1.1原料：农贸市场购买的猪心 1.2仪器：PHILIPS 组织捣碎机 SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司） LXJ-ⅡB 离心机（上海安亭科学仪器制造厂） 透析袋 MD44 V-2100 紫外分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司） 721分光光度计（上海第二仪器制造厂） JB-3型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）
不同物种的细胞色素c分子异同比较分析细胞色素C 是生物氧化反应中一种起重要作用的蛋白质, 它以铁叶琳为辅基, 卟琳的SH 基和Fe 原子可与蛋白质分子中的氨基酸相结合，人和其他各种生物的细胞色素 C 已经分离提纯，其蛋白质结构比较清楚，对近百个生物种，包括各种不同的动物、植物、真菌和细菌的细胞色素 C 的蛋白质结构进行了化学分析，证明了大部分生物细胞色素C的蛋白质由105个左右的氨基酸组成，一除少数氨基酸顺序略有变动外，大部分氨基酸的顺序是相同的。 所选用的物种分类
十四个物种的细胞色素c蛋白质一级结构 黑猩猩和牛的细胞色素c的序列对比 黑猩猩和玉米的细胞色素c序列对比
上图中，十四个物种分别来自于不同的界门纲目，共有的保守氨基酸序列有43个，一致性非常高，其中黑猩猩和智人的序列式完全相同的，通过黑猩猩和 牛的序列对比发现，同为哺乳动物，它们的细胞色素c序列几乎完全一直，只有少数几个突变点；通过黑猩猩和玉米的细胞色素c的序列对比发现，它们显然没有黑猩猩和牛的序列一致性高，但仍有超过一半的一致性序列。 虽然有的物种在亲缘关系中相隔很远, 但是氨基酸顺序很多相同, 说明它们在进化过程中, 是由共同祖先演化而来的，又由于生物有机体突变,，在某一个历史阶段, 产生了许多不同的个体, 各自朝不同的方向演化, 所以, 各个生物有机体细胞色素C 氨基酸排列顺序不完全相同。不同物种之间的亲缘关系越近, 其细胞色素 C 的结构越相似, 反之差异越大。但同时虽然朝着不同的方向进化，但是细胞色素c的很多氨基酸序列的进化是非常保守的，因此可以推测这些序列在细胞色素c的基本功能方面发挥着很重要的作用，对细胞色素c的结构稳定起着关键的作用。
细胞色素C 的制备及其测定及思考题答案 一、实验原理 1、通过细胞色素C 的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤； 2、掌握制备细胞色素C 的操作技术及其含量的测定方法。 二、实验原理： 细胞色素C 的特点与实验原理 三、实验器材、材料及试剂： 1、器材：捣碎机、离心机、磁力搅拌器、可见分光光度计、玻璃层析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、纱布、广泛PH 试纸、精密PH 试纸、烧杯（2000、1000、500mL ）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等； 2、材料：（1）新鲜猪心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH 和1mol/L NaCl 混合液、（4）0.2% NaCl ，12%BaCl2，20%TCA ，2mol/L H2SO4、 （5）0.06mol/L 磷酸氢二钠、0.4mol/L 氯化钠、（6）1%BaCl2 三、实验步骤： 1、细胞色素C 的制备：
2.细胞色素C含量的测定： 根据还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大光吸收这一特性，作出细胞色素C浓度和光吸收值标准曲线，然后根据所测定的光吸收值，由标准曲线的斜率来求得所测样品的含量。具体操作如下： (1)标准曲线的绘制 配制细胞色素C标准母液（3.24mg/mL）。按下表配制标准样品的浓度梯度，再在各管中加入3mL的水，混匀，以0号管做空白对照，在520nm波长处测得各管的光吸收值（A520nm），如图：
（2）样品测定 取纯化后的细胞色素C液1mL加水3mL，混匀，测A520nm。如果光吸收值不在标准曲线范围内（0～0.30），应用水稀释适当倍数后，重复上步的操作，然后换算。 五、结果计算： 实验中测得的细胞色素C的光吸收值为： A520nm=0.266 按照老师的计算公式(y=0.1675x)： 样品浓度=1.588mg/mL 我得到的吸光度与浓度换算公式(y=0.166x+0.0014)： 样品浓度=1.594mg/mL 原因：可能是所用软件运用不同的算法造成的误差。 细胞色素C的含量=细胞色素C的浓度×稀释倍数×终体积 =0.266×1×5.40=1.44mg 六、思考题: 1、制备细胞色素C通常选取什么动物组织？为什么？ 答：采取动物的心脏或着酵母；因为细胞色素C是呼吸链中极重要的电子载体，主要存在于线粒体中，动物的心脏需氧量较大，因此细胞色素C含量也较大。 2、本实验采用的酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素及含量测定，各是根据什么原理? 答：酸溶液提取：细胞色素C易溶于水和酸性溶液； 人造沸石吸附：物理吸附，沸石的多孔结构能够吸附溶解的细胞色素C； 硫酸铵洗脱：（未有明确答案，待询问老师） 三氯乙酸沉淀：低浓度的三氯乙酸可使细胞色素C产生可逆变性沉淀，通过离心可将其分离，加入清水后
高效液相色谱法含量测定 1检验方法 高效液相色谱法 2检验原理 高效液相色谱法系采用高压输液泵，将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对样品进行测定的色谱方法。注入样品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依此进入检测器，由数据处理系统记录和处理色谱信号。 3检验试剂 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、纯水（高纯水）、磷酸等。 4供试品溶液制备 取要测试的供试品适量，参照《药典》及《制剂规范》，用规定的溶剂适宜的提取精制方法，配制成一定浓度的供试品溶液。供试品溶液注入色谱柱前要经适宜的0.45nm的滤膜滤过。5对照品溶液制备 根据供试品所要测定的成分取相应的对照品，用适宜的溶剂配制成相应浓度的对照品溶液。6流动相配制 用高纯度的试剂配制流动相，水应为新鲜配制的高纯水。配制好的流动相通过适宜的0.45nm 的滤膜滤过，用前脱气。 7操作 7.1打开自动进样器、检测器、泵、柱温箱，进入工作站。 7.2自动进样器排气 自动进样器排气用50%甲醇（用前脱气），点击自动进样器界面上的purge键，自动排气25分钟。 7.3泵排气 分析界面中，设置方法参数，下载方法参数。用流动相冲洗吸滤头，再把吸滤头浸入流动相中，逆时针旋转排气阀90-180度，点击purge键，排气3-4分钟，顺时针旋转排气阀90-180度，激活仪器。 7.4进样操作 7.4.1.将对照品溶液和供试品溶液分别置于样品瓶中，盖上带有垫片的瓶盖，顺时针旋紧，7.4.2将样品瓶按顺序放置于样品瓶架上。 7.4.3设置方法参数，选择波长、柱温、流速、结束时间等，下载并保存方法文件，待色谱系统充分稳定，基线平直。 7.4.4设置批处理分析表。分析界面主项目中，点击批处理分析，依次设置样品瓶号、样品瓶架号、样品名、方法文件、数据文件、进样体积，保存批处理分析表，点击批处理分析开始，开始数据采集。 7.4.5不同浓度的对照品溶液和同一浓度的供试品溶液应分别进样不少于5针。 7.5色谱数据的收集处理 7.5.1 建立标准曲线 7.5.1.1再解析界面中，选择要处理的对照品数据的其中一个数据，点击向导，出现化合物表向导，选择最小面积，点击下一步，选择有效峰，点击下一步，输入浓度单位，最大级别数，点击下一步，输入化合物名，依次输入几个对照品溶液浓度，点击完成。保存方法文件。7.5.1.2在方法中，打开上述所保存的方法文件，出现校准曲线视图，将相应浓度的对照品色谱数据拖至数据文件相应的级别中，形成标准曲线图，查看R数值不大于0.9999，表明线性关系良好，方法文件另存为标准曲线。
细胞色素C的提取 一、实验目的 1、掌握提取细胞色素C的原理。 2、学习提取细胞色素C的操作技术。 3、了解吸附法的原理和方法。 二、实验原理 细胞色素C是一种含有铁卟啉基团的蛋白质，是细胞色素的一种，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，是呼吸链的一个重要组成成分。细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。 细胞色素C溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，制品可分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。 吸附法指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。 由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C。 三、实验试剂和器材 试剂
1、2mol/L硫酸溶液 2、1mol/L氨水溶液 3、0.2%氯化钠溶液 4、25%硫酸铵溶液 5、20%三氯乙酸溶液 6、人造沸石 7、猪心 器材 磁力搅拌器、组织匀浆机、层析柱、恒流泵 四、实验步骤 1、材料处理 取新鲜或冷冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心搅成小块。 2、提取 称取碎猪心肌肉100g，放入500ml烧杯中，加蒸馏水200ml，搅匀，用硫酸调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取0.5h。提取完毕，用氨水调pH至6.0，搅拌均匀，停止搅拌。用八层普通纱布挤压过滤；滤渣加入750ml蒸馏水，再按上述条件提取0.5h，两次提取液合并。 3、中和 用氨水调上述提取液至pH7.2（此时，等电点接近pH7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），静置30—40min后过滤，所得滤
被分离组分在柱中的洗脱原理 Ⅱ基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）. ⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。 ⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。 ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。 ⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。 ⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。 ⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝2.507σh=1.064Wh/2h 2.定性参数（保留值） ⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 ⊕死体积（dead volume,V0）――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速） ⊕保留时间（retention time,tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。⊕保留体积（retention volume,VR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F*tR . ⊕调整保留时间（adjusted retention time,tR’）--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0 ⊕调整保留体积（adjusted retention volume,VR’）--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’ 3.柱效参数 ⊕理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W：峰宽；σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
HPLC测定有关物质和含量方法验证1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体） 有关物质方法验证的前提条件： 1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离 2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。 3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度 4.各杂质纯度已知 5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度 6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明 1.1专属性： 1.1.1概念 在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。 1.1.2试验方法 1.1. 2.1定位试验： A.目的 对各已知杂质和主峰进行定位 B.试验方法： a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液
b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液 c．使用拟定分析方法分别进行定位。 C.试验要求： a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点 b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定 c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）； 1.1. 2.2强制降解试验 A.目的 一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。 B.试验方法 对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。试验一般的范围为： 强酸：0.1~5.0mol/L HCl溶液或视情况调节时间，温度，体积 强碱：0.1~5.0mol/L NaOH溶液或视情况调节时间，温度，体积
细胞色素C的制备和含量测定 王甲马腾刘鑫林刘晓峰管伟 （北京科技大学化学与生物工程学院生物技术系北京100083）[摘要] 建立了以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸 铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤快速制备细胞色素C的方法，进而考察了制备蛋白质制品的一般原理和操作技术。测定细胞色素C含量时，其520nm处吸光度的标准曲线为：y = 0.7762x + 0.05，R2 = 0.9974；将细胞色素C粗品溶液稀释适当倍数，加入少许联二亚硫酸钠后，在520nm下测其吸光度A=0.210。样品原液浓度C=1.072 mg/mL；每500g心肌碎肉含细胞色素C=64.0 mg。 [关键词] 细胞色素C 分离纯化分光光度法 1引言 生物大分子主要是指蛋白质、酶和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前提，结构与功能的研究就无从谈起。 细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。 细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。 细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。 细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜动物心脏为材料提取、纯化细胞色素C，制备其粗品溶液，方法简单易操作。 2实验部分 2．1 试剂和仪器 2.1.1 材料