Transwell细胞侵袭实验与移动实验
一、试剂和耗材
1)细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10%FBS的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。
2)10×PBS (pH7.0)：
Na2HPO4·12H2O （MW 358.4） 2.87g
KH2PO4（MW 136.09）0.2g
NaCl（MW 58.44）8.0g
KCl（MW 74.55）0.2g
去离子水至100 ml
高压灭菌后，室温保存。使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9 稀释)。
3)冰乙酸:甲醛（1:3）
4)Transwell小室(BD, Bioscience)
5)Matrigel基质胶（BD, Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20°。
6)各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的
离心管于-20oC预冷，备用。
7)5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad）
8)细胞计数板、6孔板
二、实验步骤
（一）侵袭实验
1.润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血
清培养基，润化5-15min。
2.细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培
养24h。
3.细胞的接种：
1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，
控制在1min以内。
2)加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃
离心管中（带螺口盖子），水平转子4℃、700rpm/min，离心5min；
3)弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；
4)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细
胞密度大于1.5×105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul 细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；
5)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；
6)将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl（含5×104细胞）逐滴加入小
室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。
7)将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。
4.细胞染色及拍照：
1)弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，此过程要求快
速完成，避免让小室的膜过于干燥，将小室置于已加入500ul固定液的培养孔中，在上室中加入200ul 固定液，固定5-10分钟左右。此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。
2)弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500ul苏木素染液的培养
孔中，上室中加入200ul固定液，染色10-15min。
3)将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。
4)往小室内加入100ul PBS，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200×光镜下计数10个视野的侵袭细胞数,
取其平均值,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。
5)若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当颜色后即可。
（二）移动实验
1.小室润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量
无血清培养基，润化5-15min，备用。
2.细胞准备：常规培养细胞，用PBS（已灭菌）或无血清培养基洗涤3次后，加入常规量无血清培养基
饥饿12h。
3.接种Transwell小室
1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，
控制在1分钟以内。
2)加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃
离心管中（带螺口盖子），水平转子4℃、700rpm/min，离心五min；
3)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞
密度大于1.5×105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul 细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；
4)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；
5)将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl逐滴加入小室；取500μl含
10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。
6)将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。
4.细胞染色（Giemsa试剂盒）及拍照：
（三）Transwell小室重复利用处理方法
1．拍照结束后，将小室直接放入6孔板/24孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温放置过夜（约6h以上）；
2．将小室取出，用75%乙醇浸泡5min（可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色；3．无菌水漂洗几次以除去残留物质，甩干水后，置于室温自然晾干；
4．再次使用之前，将晾干的小室及所用的细胞板置于超净台紫外下除菌，小室正反面各照射30min。
注：小室可重复利用多次，但在棉签擦拭的时候力度避免过大，以免损伤小室膜；重复使用之前可观察小室膜是否出现裂痕，若出现较多裂痕可停止使用。
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
消防水带技术参数 1 范围 消防水带(以下简称水带)的性能要求、试验方法、检验规则以及标志、包装、运输、贮存等。 适用于各类由织物层、衬里(或兼有覆盖层)紧密结合组成的水带。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB／T 532—1997 硫化橡胶或热塑性橡胶与织物粘合强度的测定(idt ISO 36：1993) GB／T 3690—1994 织物芯输送带拉伸强度和伸长率测定方法(eqv ISO 283：1990) QB／T 2443—1999 钢卷尺 JB／T 5520—1991 干燥箱技术条件 JB／T 7444—1994 空气热老化试验箱 3 性能要求 3．1 水带的织物层应编织得均匀，表面整洁；无跳双经、断双经、跳纬及划伤。 3．2 水带衬里(或覆盖层)的厚度应均匀，表面应光滑平整、无折皱或其他缺陷。 3．3 水带内径的公称尺寸及公差应符合表1的规定。
3．4 水带的长度及尺寸公差应符合表2的规定。 3．5 水带的设计工作压力及耐压值应不低于表3的规定。 表1 mm 规格公称尺寸公差 2525.0 4038.0 5051.0 6563.5 8076.0 表2 m 长度公差 15 20 25 30 40 表3 MPa 工作压力试验压力爆破压力 0.8 1.2 2.4 1.0 1.5 3.0 1.3 2.0 3.9 1.6 2.4 4.8
3．6 水带的单位长度质量 3．6．1 设计工作压力为0.8MPa、1.0MPa、1.3MPa、1.6MPa的水带，其单位长度的质量不应超过表4的规定。 表4 g／m 3．6．2 设计工作压力为2.0MPa、2.5MPa的水带，其单位长度的质量不应超过表5的规定。 表5 g／m 3．7 设计工作压力为0.8MPa、1.0MPa、1.3MPa、1.6MPa的水带，在设
第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 Fig1 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面 Fig2 将Transwell小室放入培养板中，小室称上室，培养板称下室，上室盛装上层培养液，下室盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 Fig3 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： (1).共培养体系：
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
消防水带连接方法及流程培训 消防试水水带的连接方法，包括水带的铺设和收卷方法，水带与水带、水带与水枪、水带与消防栓的连接方法，水枪的正确使用方法等。要求在一分钟内完成消防水带的抛设、连接及出水，并观察不同类型喷嘴的灭火效应。 （1）单手铺设水带的方法和要求 ①右手捏住卷好的水带，大拇指及食指捏住最外两圈（接头朝前），其余三个手指钩住第三、四圈水带。 ②左脚在前、右脚在后、弯腰，将水带前后摆动（摆幅不宜过大），接着向前甩出水带，甩出水带时大拇指及食指始终捏住最外两圈皮龙，其余三指伸直，水带就会顺势滚向前方。 ③水带抛出后应成直线、完全展开，偏离正前方左右范围≤1米。水带抛出时，金属连接头不得脱手落地。 （2）两人收卷水带的方法和要求 ①水带使用完毕后，要先倒出水带中的余水。 ②协助卷带学员将水带对折形成双层，下层水带要比上层水带长出约30公分，用脚踩住水带的靠近接头部位，卷带学员在另一端将两层水带抖动拉直、平铺叠好后开始弯腰卷带，协助卷带学员前往卷带学员前方约2米处，双脚立于水带左右跨于水带上方，俯身弯腰双手托起上层水带，使两层水带叠放整齐，便于卷带学员卷带。随着卷带学员向前卷带，协助卷带学员慢慢向后退，直至卷带完毕。
③盘卷好的水龙带两金属连接头差距小于10公分。 （3）水带与水带、水带与水枪、水带与消防栓的连接方法将水带的一端金属接头的两个锁舌对准另一水带或水枪或消防栓接头的对应的凹槽内并推进后转动锁定即可。 （4）水枪手、辅助枪手规范站姿 ①水枪手站姿：左脚在前，右脚在后，向左侧身，左手握水枪中部，右手握水枪连接口处并夹紧腋下，站稳。 ②辅助枪手站姿：右脚在前，左脚在后，向右侧身站在枪手相对应一侧稍后的位置，双手托住水龙带。 （5）消防水枪射水的基本姿势 消防水枪射水的基本姿势有立射、跪射、卧射和肩射四种，（6）消防水枪射水的形状 两用水枪射水的形状有直流和雾状两种。应根据火场的实际情况及需要，对二者随时进行相互转换。
一、Transwell小室制备 1、无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜: 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜: 吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。 2、有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 μl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度就是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞,24 h内对细胞增殖并无明显抑制,但24 h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟就是由于侵袭被抑制引起,还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我瞧到细胞在小室内的形态不就是正常培养贴壁的形态,而就是圆形的,仍就是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张,就是正常现象 在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这就是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧,确信没有大气泡产生。
不同实验中transwell 小室的选择和使用 Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。 根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6孔板小室、12孔板小室和24孔板小室以及和transwell 皿配套的75 mm直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。 小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。例如共培养实验和caco-2细胞转运模型实验。 共培养实验： 常用0. 4、34μm，将细胞A 种于上室，细胞B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A 的影响。 caco-2细胞转运模型： 选用0.44μm 膜，将Caco-2细胞以约l×10个/mL，每孔0.5 mL的密度接种在Transwell 内培养21d左右，前1周隔天换液，1周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。 涉及到细胞迁移的实验： 要用5. 0、8. 0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。
趋化性实验： 细胞B 对细胞A 的趋化作用，将细胞A 种于上室，细胞B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 细胞迁移实验： 常用8. 0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 细胞侵袭实验： 常用8. 0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，但与细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映细胞的侵袭能力。
消防水带 1 范围 本标准规定了消防水带的型号规格、性能要求、试验方法、检验规则以及标志、包装、运输、使用与维护。 本标准适用于有衬里消防水带、消防湿水带等消防水带。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 528 硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定 GB/T 532 硫化橡胶或热塑性橡胶与织物黏合强度的测定 GB/T 1040.1 塑料拉伸性能的测定第1部分：总则 GB/T 2481.2 固结磨具用磨料粒度组成的检测和标记第2部分：微粉 HG/T 2369 橡胶塑料拉力试验机技术条件 JB/T 5520 干燥箱技术条件 JB/T 7444 空气热老化试验箱 QB/T 2443 钢卷尺 3 型号规格 消防水带（以下简称水带）的型号规格由设计工作压力、公称内径、长度、编织层经/纬线材质、衬里材质和外覆材料材质组成。 示例1：设计工作压力为1.0MPa、公称内径为65mm、长度为25m、编织层经线材质为涤纶纱，纬线材质为涤纶长丝、衬里材质为橡胶的水带，其型号表示为：10-65-25-涤纶纱/涤纶长丝-橡胶。 示例2：设计工作压力为2.0MPa、公称内径为80mm、长度为40m、编织层经线材质为涤纶长丝，纬线材质为涤纶长丝、衬里材质为聚氨酯、外覆材料材质为塑料的水带，其型号表示为：20-80-40-涤纶长丝/涤纶长丝-聚氨酯/塑料。
4 性能要求 4.1外观质量 4.1.1 水带的织物层应编织均匀，表面整洁，无跳双经、断双经、跳纬及划伤。 4.1.2水带衬里（或外覆层）的厚度应均匀，表面应光滑平整、无褶皱或其他缺陷。 4.2内径 水带内径的公称尺寸及公差应符合表1的规定。 表1 单位为毫米 4.3长度 水带的长度及尺寸公差应符合表2的规定。
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
1 总则 1．0．1 为了合理设计消防给水及消火栓系统，保障施工质量，规范验收和维护管理，减少火灾危害，保护人身和财产安全，制定本规范。 1．0．2 本规范适用于新建、扩建、改建的工业、民用、市政等建设工程的消防给水及消火栓系统的设计、施工、验收和维护管理。 1．0．3 消防给水及消火栓系统的设计、施工、验收和维护管理应遵循国家的有关方针政策，结合工程特点，采取有效的技术措施，做到安全可靠、技术先进、经济适用、保护环境。 1．0．4 工程中采用的消防给水及消火栓系统的组件和设备等应为符合国家现行有关标准和准入制度要求的产品。 1．0．5 消防给水及消火栓系统的设计、施工、验收和维护管理，除应符合本规范外，尚应符合国家现行有关标准的规定。 2 术语和符号 2．1 术语 2．1．1 消防水源fire water 向水灭火设施、车载或手抬等移动消防水泵、固定消防水泵等提供消防用水的水源，包括市政给水、消防水池、高位消防水池和天然水源等。 2．1．2 高压消防给水系统constant high pressure fire protection water supply system 能始终保持满足水灭火设施所需的工作压力和流量，火灾时无须消防水泵直接加压的供水系统。
2．1．3 临时高压消防给水系统temporary high pressure fire protection water supply system 平时不能满足水灭火设施所需的工作压力和流量，火灾时能自动启动消防水泵以满足水灭火设施所需的工作压力和流量的供水系统。 2．1．4 低压消防给水系统low pressure fire protection water supply system 能满足车载或手抬移动消防水泵等取水所需的工作压力和流量的供水系统。 2．1．5 消防水池fire reservoir 人工建造的供固定或移动消防水泵吸水的储水设施。 2．1．6 高位消防水池gravity fire reservoir 设置在高处直接向水灭火设施重力供水的储水设施。 2．1．7 高位消防水箱elevated/gravity fire tank 设置在高处直接向水灭火设施重力供应初期火灾消防用水量的储水设施。 2．1．8 消火栓系统hydrant systems/standpipe and hose systems 由供水设施、消火栓、配水管网和阀门等组成的系统。 2．1．9 湿式消火栓系统wet hydrant system/wet standpipe system 平时配水管网内充满水的消火栓系统。 2．1．10 干式消火栓系统dry hydrant system/dry standpipe system
1 总则 1.0.2 本规范适用于新建、扩建、改建的工业、民用、市政等建设工程的消防给水及消火栓系统的设计、施工、验收和维护管理。 1.0.3 消防给水及消火栓系统的设计、施工、验收和维护管理应遵循国家的有关方针政策，结合工程特点，采取有效的技术措施，做到安全可靠、技术先进、经济适用、保护环境。 1.0.4 工程中采用的消防给水及消火栓系统的组件和设备等应为符合国家现行有关标准和准入制度要求的产品。 1.0.5 消防给水及消火栓系统的设计、施工、验收和维护管理，除应符合本规范外，尚应符合国家现行有关标准的规定。 条文说明 1 总则 1.0.1 本条规定了本规范的编制目的。 建国60年来我国消防给水及消火栓系统设计、施工及验收规范从无到有，至今已建立了完整的体系。特别是改革开放30年来，快速的工业化和城市化使我国工程建设有了巨大地发展，消防给水及消火栓系统伴随着工程建设的大规模开展也快速发展，与此同时与国际交流更加频繁，使我们更加认识消防给水及消火栓系统在工程建设中的重要性，以及安全可靠性与经济性的关系，首先是安全可靠性，其次是经济合理性。 水作为火灾扑救过程中的主要灭火剂，其供应量的多少直接影响着灭火的成效。根据统计，成功扑救火灾的案例中，有93%的火场消防给水条件较好；而扑救火灾不利的案例中，有81.5%的火场缺乏消防用水。例如，1998年5月5日，发生在北京市丰台区玉泉营环岛家具城的火灾，就是因为家具城及其周边地区消防水源严重缺乏，市政消防给水严重不足，消防人员不得不从离火场550m、600m的地方接力供水，从距离火场1400m的地方运水灭火，延误了战机，以至于两万平方米的家具城及其展销家具均被化为一片灰烬，直接经济损失达2087余万元。又如2000年1月11日晨，安徽省合肥市城隍庙市场庐阳宫发生特大火灾，火灾过火面积10523m2，庐阳宫及四周126间门面房内的服装、布料、五金和塑料制品等烧损殆尽，1人被烧死，619家经营户受灾，烧毁各类商品损失折款1763万元，庐阳宫主体建筑火烧损失416万元，两项合计，庐阳宫火灾直接经济损失2179万元，这场火灾的主要原因是没有设置室内消防给水设施，以致火灾发生后蔓延迅速，直至造成重大损失。火灾控制和扑救所需的消防用水主要由消防给水系统供应，因此消防给水的供水能力和安全可靠性决定
不同实验中 transwell 小室的选择和使用 Transwell 小室在细胞实验中很常用，共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同。 根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为6 孔板小室、12 孔板小室和 24 孔板小室以及和 transwell 皿配套的 75 mm 直径的小室；根据孔径的不同，从小孔径到大孔径又分为0.4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。 小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，应该选择3μm 以下的孔径。例如共培养实验和 caco-2 细胞转运模型实验。 共培养实验：常用 0.4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响。 caco-2 细胞转运模型：选用0.44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10个/mL，每孔 0.5 mL 的密度接种在 Transwell 内培养 21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液。在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求。 涉及到细胞迁移的实验：要用 5.0、8.0、12.0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。 趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用，将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 细胞迁移实验：常用 8.0、12.0μm 膜，上室种细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 细胞侵袭实验：常用8.0、12.0μm 膜，原理与细胞迁移实验类似。上室
一、Transwell小室制备 1. ?无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成 0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有 tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。 2. ?有基质胶的Transwell小室制备 ?Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h 把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。? 四、结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法： 1. ?直接计数法 （1）“贴壁”细胞计数 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
一、Tran swell 小室制备 1. 无基质胶Tran swell 小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。 另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Tran swell 小室制备 Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基 重悬。调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多 过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点， 所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。 个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证 对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100 —200 加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小 室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200卩l。 ②24孔板下室一般加入500 □含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同 要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一 旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出 现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12 —48 h (主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Tran swell , 处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组 细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可 能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达， 到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点 研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞 在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成 团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培 养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1—2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
Transwell侵袭实验总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。
香雪xx消火栓箱及其配件技术要求 一、产品名称、规格、型号、数量见定货清单。 二、消火栓箱及其配件制造执行标准： GB/T1173铸造铝合金 GB/T1176铸造铝合金技术条件（GB1176-1987，neqISO1338-77） GB3265内扣式消防接口 GB3445-1993室内消火栓 GB/T 4942.2-1993低压电器外壳防护等级（eqvIEC947-1:1998） GB81消防水枪性能要求和试验方法 HG2184输水、通用橡胶软管 三、消火栓箱及其配件产品技术要求： 1、外观质量要求： （1）箱内配置的消防器材不得有歪斜翘曲等现象，表面应无凹凸不平等加工缺陷及磕碰痕迹。 （2）箱体内外表面应作防腐处理。进行涂漆防腐处理的箱体，其涂层应均匀一致、平整光亮，明装箱的箱体外表及其他型式栓箱的外露部位涂层应色泽美观，不得有流痕、气泡、剥落等缺陷。 （3）焊缝或焊点应平整均匀、焊接牢固、无烧穿、疤瘤等焊接缺陷。 （4）铆接应严实美观，铆钉排列整齐，铆接后铆钉连接应紧固无歪斜。 2、外型尺寸要求：
（1）箱体的长边、短边及厚度尺寸应符合设计要求的图集04S202-8页、4页甲型双栓、乙型单栓。 （2）箱门关闭到位后，应与四周框面平齐，最大允差为2mm. （3）箱门与框之间的间隙应均匀平直，最大间隙不超过 2.5mm. （4）栓箱正面上的零部件，凸出箱门外表平面的高度不得大于15mm;其余各面的零部件，凸出该面外表平面的高度不得超过10mm. 3、材料要求： （1）箱体材质、板厚符合作业标准。 4、技术要求 1、消火栓箱应符合国家标准GB14561－93中的技术要求。 1.1室内消火栓 1.1.1xx性能: 室内消火栓各xx部位应能承受 1.6MPa水压，持续2min，不得有渗漏现象。 1.1.2水压强度: 阀体和阀盖承受 2.4MPa水压，持续2min，应无破裂和渗漏现象，减压消火栓的减压阀阀后压力为 0.2Mpa。 1.2消防接口 1.2.1密封性能：在1.6MPa水压下，持续2min，不得有渗漏现象。