酯酶染色---中性非特异性脂酶(α—NAE)染色
[方法学]
酯酶染色的方法很多，根据与pH底物等不同作用，将常用的酯酶染色法分为两大类，即特异性酯酶染色和非特异性酯酶染色。后者又可分为3类：
①中性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酚酯酶、乙酸菜酚酯酶和乙酸菜酚
AS-D酯酶。②酸性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酯酶和α—丁酸菜酯酶。②碱性非特异性酯酶染色法：α—丁酸菜酯酶。中性非特异性酯酶染色是单核细胞与粒细胞白血病区别的重要方法，一般实验室可选用此法。
[原理]
α—乙酸萘酚经酯酶水解产生萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成灰黑或棕黑色沉淀物，定位于胞浆中。
[试剂]
1．α—醋酸萘酯丙酮液：α—醋酸萘酯1g，加丙酮和蒸馏水混合液100m1，溶解后贮于磨口带塞三角瓶内，4℃保存，可使用半年。
2.pH7．4磷酸盐缓冲液：0．07MNa2HPO4(即Na2HPO4)
3．基质液：磷酸盐缓冲液82ml，缓慢滴加α-醋酸萘酯丙酮液1．6ml(滴速约每分钟40滴)，边加边用力振摇。根据5分钟后，加坚牢蓝B80mg，剧
烈振摇10分钟，立即过滤，滤液两杯，各40ml。
4．氟化钠基质液：称取氟化钠(NaF)61mg加入上述其中基质液1杯内，混匀后，标上标记。
[操作]
(1)新鲜涂片两张，分别标上NSE和NaF记号，滴加10％甲醛生理盐水，固
定5分钟，用自来水轻轻冲洗，当心血膜脱落，晾干。
(2)两张涂片同时放入各自染色杯内，37℃水浴1小时。
(3)取出后水洗，晾干后镜检。不用复染。
[结果观察]
在胞浆内若有棕黑色或灰黑色弥漫性颗粒沉淀者为阳性，细胞脑浆为黄色者为阴性。
[临床意义]
1．阳性：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟
化钠抑制。
编写：谢平制定日期：2011.12.1
2．弱阳性及阴性：粒细胞、淋巴细胞一般为阴性，若有弱阳性也可被氟化钠抑制。
3．临床鉴别：主要用于鉴别急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病，前者NSE阳性，且受氟化钠(NaF)抑制；而后者NSE阴性，若有阳
性也不受氟化钠抑制。
[附注]
(1)坚牢蓝B和氟化钠可小包分装后干燥器保存
(2)基质液配制过程中要振摇，以促使基质溶解。冬天配制时应适当加温(置
于37℃水箱操作)。基质液现配现用，不能保存，过滤后应尽快试验，以免大量沉淀物析出，影响染色效果。
编写：谢平制定日期：2011.12.1
α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE 法) 简介： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。每一种酯酶常能水解许多不同的底物，多种不同的酯酶又能水解相同的底物，因此这一系列酯酶被称为非特异性酯酶。非特异性酯酶的最适pH 为5.0～8.0，定位于溶酶体和内质网，在肝脏、肾脏、胰和小肠具有较高的酶活性。单核-吞噬细胞系统的单核巨噬细胞、树突细胞也含有丰富的非特异性酯酶。 Leagene α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE 法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的非特异性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 载玻片、湿盒 2、 显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入α-NAE 固定液固定。 2、 水洗，晾干。 3、 入配制好的α-NAE 孵育液，放入湿盒中，避光孵育，水洗。 4、 入甲基绿染色液复染，水洗，镜检。 编号 名称 DE0038 3×10ml DE0038 3×20ml Storage 试剂(A): NAE 固定液 10ml 20ml RT 避光 试剂(B): α-NAE 孵育液 B1: α-NAE solution 0.2ml 0.4ml 4℃ 避光 B2: FBB solution 5ml 10ml -20℃ 避光 B3: α-NAE buffer 5ml 10ml RT 临用前，B1:B2:B3混合，即为α-NAE 孵育液，即配即用。 试剂(C): 甲基绿染色液 10ml 20ml RT 避光 试剂(D): NaF solution 0.2ml 0.4ml RT 避光 使用说明书 1份
免疫组化常见问题与回答集锦一、石蜡切片和冰冻切片的比较？ 1. 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 3. 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到 4 口左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 二、一抗的选择要点和技巧是什么？ 1. 单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。 2. 应用范围的选择。有的一抗只能用于WB ( Western blotting )或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 3. 种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。 4. 种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。 5. 生产厂家的选择。如santa Cruz 公司抗体一般1 ml ，价格2100 元左右；而chemicon公司一抗一般100卩,1价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体，它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做WB 效果还可以。 三、在什么情况下使用Triton-X100 ？ 1. Triton X-100 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（10
做好免疫组化染色必须注意的问题 一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。 二、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。 三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折 应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。 四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。 免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。 五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。 应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，
酸性α－乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)使用说明 货号：G2390 规格：3×10ml 保存：有效期6个月。 产品内容： 试剂A：ANAE固定液10ml RT避光 试剂B；ANAE孵化液B1：pararosaniline solution0.05ml4℃避光 B2：Nitrite solution0.05ml4℃避光 B3：α-NAE solution0.5ml4℃避光 B4：ANAE buffer9.5ml4℃避光 临用前，按B1：B2：B3：B4=1：1：10：190充分混合，即为ANAE孵化液，即配即用。注意应先B1：B2=1:1混匀后，再与B3、B4混匀。 试剂C:甲基绿染色液10ml RT避光 试剂D：NaF solution0.2ml RT避光 自备材料： 载玻片、湿盒、显微镜 产品简介： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)酸性α-乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是酸性条件下细胞中的酸性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与六偶氮副品红偶联，生成不溶性红色沉淀，定位于细胞质。酸性α－乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)对酯酶
染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。该染色液仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 操作说明： 1.血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片入ANAE固定液固定10-15min。 2.水洗5min。 3.入配置好的ANAE孵育液，放入湿盒中，室温避光孵育1h，水洗。 4.入甲基绿染色液复染5-15min，水洗，镜检。 染色结果： 细胞质暗红色/棕色 细胞核绿色 氟化钠抑制实验： 按NaF solution：ANAE孵育液=1：25的比例，在ANAE孵育液中加入NaF solution，其余按上述染色法进行。 注意事项： 1.血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。 2.ANAE孵育液易失效或降低阳性程度，即配即用，不宜久置。 3.ANAE孵育液配置后易出现浑浊，但不会影响染色效果。 4.单核细胞为中度阳性至强阳性，对NaF敏感。正常粒细胞呈阴性反应。 5.每次染色时，应有阳性对照。
酯酶同工酶的醋酸萘酯-铁氰化钾染色法的研究 摘要：酯酶可将＠-醋酸萘酯和?-醋酸萘酯水解生成醋酸和萘酚，利用萘酚能与铁氰化钾反应生成有色物质萘醌的性质可对电泳凝胶上的酯酶同工酶进行染色。 关键词：酯酶同工酶；醋酸萘酯；铁氰化钾；染色法 经典的酯酶同工酶的染色方法的原理是，酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可与坚牢蓝反应生成蓝紫色物质，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出蓝紫色的酶带。 经过摸索，本文介绍一种新的酯酶同工酶的染色方法———醋酸萘酯N 铁氰化钾染色法，其原理是酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可被铁氰化钾氧化成萘醌，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出酶带。 一 材料与方法 1.1实验材料 以新鲜的肉鸡肝脏为材料。 1.2试剂 Acr 为广东省汕头化学试剂厂产品，Bis 、坚牢蓝RR 盐为上海化学试剂公司产品，TEMED 为上海前进试剂厂产品，溴酚蓝为上海试剂三厂产品，＠-醋酸萘酯为上海青浦合成试剂厂产品，?-醋酸萘酯为上海试剂一厂产品， Tris,HCL,NaCL,2Na HP 4o ,磷酸二氢钠，三氯醋酸，乙醇，甘油，丙酮，丙酮、铁氰化钾、过硫酸铵等均为国产分析纯。 1.3仪器设备 研钵、电泳仪与电泳槽、冰箱、离心机、微量加样器、恒温水浴锅、染色盒、67$紫外光栅分光光度计等。 1.4实验方法 （1）样品制备：取一定量的新鲜鸡肝，按一定比例加入8*9:1的磷酸缓冲液后进行研磨，经4000r/min,15min 离心后取上清液，置于1?冰箱中保存备用。 （2）酯酶活力的测定：参照禹邦超等人的方法进行。 （3）聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照赵永芳的方法进行。 （4）酯酶同工酶的染色方法有： 经典法：（即醋酸萘酯-固蓝RR 盐染色法）染色液：称取?-醋酸萘酯与＠-醋酸萘酯、坚牢蓝RR 各200mg ，分别用10mL 丙酮溶解后，混合，再用磷酸缓冲液定容至200mL 。 电泳后，将凝胶条浸入染色液中，于37摄氏度保温直至酶带出现。 染色新法（即醋酸萘酯B 铁氰化钾染色法）染色液G ：仅将经典法染色液中的坚牢蓝RR 除去；染色液B ：4%的铁氰化钾溶液。电泳后将凝胶条浸入染色液A 中，于37摄氏度保温2min 后弃去染色液A ，用蒸馏水稍加漂洗，再用染色液B 染色，直至显出酶带。 二 结果与讨论 电泳前，将完整的一块凝胶按计划等分为$部份，每部份都按相同的酶活力梯度进行点样。电泳结束后，将该凝胶按计划等分切为2块凝胶。1块用经典法进行染色，1块用染色新法进行染色 通过观察实验现象，我们发现这2种染色方法所得的酶谱是相同的。前文已再次证实鸡
1.检验原理 盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下分解产生α-萘酚，α-萘酚与六偶氮副品红结合生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称非特异性酯酶染色。 2.主要组成成分 组成主要成分 2.1、固定剂（A液）甲醛 2.2、偶氮溶液（B液）副品红 2.3、亚硝酸钠溶液（C液）亚硝酸钠 2.4、磷酸盐缓冲溶液（D液）磷酸盐 2.5、α-醋酸萘酚溶液（E液）α-醋酸萘酚 2.6、甲基绿溶液（F液）甲基绿 2.7、NaF溶液氟化钠 3.储存条件及有效期 有效期：一年（十二个月）。 储存条件：本试剂盒应储存于2～8℃低温环境。 4.样本要求 新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。 5.检验方法 5.1. 工作液配制： 5.1.1. 浸染工作液配制（一份浸染工作液量为33ml,至少可同时放置8-10张涂片）： 5.1.1.1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟； 5.1.1.2、染缸（自备染液缸）内加入D液30ml; 5.1.1.3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀； 5.1.1.4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀。 B液C液D液E液 NaF液 A染缸1ml 1ml 30ml ml —— B染缸（抑制试验）1ml 1ml 30ml 1ml 40mg 5.1.2. 滴染工作液配制（一份滴染工作液量为1.65ml）； 使用器材：一次性塑料试管、微量移液器、一次性吸嘴、滴管。 操作：于试管内加B液50ul、C液50ul 、混匀，静置1分钟；再加D液1.5ml,E液50ul，混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。 B液C液D液E液 NaF液 A染缸50μl 50μl 1.5ml 50μl —— B管（抑制试管）50μl 50μl 1.5ml 50μl 1滴 注：100Tests中的15mlD液（浓缩缓冲液）用蒸馏水稀释成150ml缓冲液使用。 5.2.染色步骤： 5.2.1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液固定涂片30秒，蒸馏水冲洗，待干编写：杨松钱审核：黄萱批准：白云辉页码：17
免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种： （一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
第二单元组化染色 1. 碱性磷酸酶主要存在于 A．幼红细胞 B. 单核细胞 C. 成熟中性粒细胞 D. 嗜碱性粒细胞 E. 淋巴细胞 2．病毒感染时中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分值 A．常为“0” B. 一般大于200分 C. 一般无明显变化或略低 D. 明显增高 E. 常大于100分 3.急性淋巴细胞白血病细胞化学染色正确的是 A .POX(-) B .SB(十) C .PAS(+) D. POX(+) E.NAE(+++) 4.骨髓原始细胞过氧化物酶染色呈阴性反应的是 A急性粒细胞白血病 B急性单核细胞白血病 C急性淋巴细胞白血病 D慢性粒细胞白血病 E慢性粒单核细胞自血病 5.诊断M6常用的细胞化学染色为 A.Pox B.SB C.PAS D. ACP E.a-NBE 6.为了鉴别小原始粒细胞白血病与急淋，下列首选试验是 A.POX染色 B. PAS染色 C. ALP染色 D.ASD NCE染色 E. a-NAE染色 7.正常血细胞POX反应，下述结果错误的是 A.中性粒细胞随细胞的成熟阳性程度逐渐增强 B嗜酸性粒细胞阳性程度最强，嗜碱性粒细胞呈阳性反应 C原单细胞呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弥散状弱阳性反应D淋巴细胞系呈阴性反应 E巨核细胞系呈阴性反应
8.正常情况下，过氧化酶染色(POX)呈弱阳性的细胞是A单核细胞 D淋巴细胞 C幼红细胞 D嗜酸性粒细胞 E巨核细胞 9.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性增高的疾病是 A再生障碍性贫血 B急性粒细胞白血病 C 慢性粒细胞白血病 D急性单核细胞白血病 E骨髓增生异常综合征 10．成熟中性粒细胞过氧化物酶活性减低的疾病是A再生障碍性贫血 B化脓性感染 C急性淋巴细胞白血病 D急性单核细胞白血病 E，慢性淋巴细胞自血瘸 12正常血象中嗜酸性粒细胞过氧化酶反；应呈 A.阴性 B 弱阳性 C强阳性 D 阴性或弱阳性 E弱阳性或阳性 12.正常血象中中性分叶核粒细胞过氧化酶：．反应呈 A.阴性 B.弱阳性 C 阴性或弱阳性 D弱阳性或阳性 E强阳性 13.正常血象中嗜碱性粒细胞过氧化酶反＼应呈 A强阳性 B阴性 C 弱阳性 D阴性或弱阳性 E 弱阳性或阳性 14.异常组织细胞的过氧化酶反应呈 A．阴性 B．阴性或弱阳性 C 弱阳性 D强阳性 E．弱阳性或阳性 15.中性粒细胞碱性磷酸酶积分减低常见于 A．真性红细胞增多症
酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液（ANAE） 预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查 检验原理：盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下水解α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色 主要组成成分： 储存条件及有效期：有效期：一年 储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。 样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血） 检验方法： 一、工作液配制 （一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是33ml,至少可同时放置8-10张涂片） 1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟； 2、染缸（自备染液缸）内加入D液40ml； 3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀 4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀 （二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是1.65ml） 使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。 操作：于试管内加B液50μL，C液50μL混匀，静置1分钟，再加D液1.5ml，E液50μl,混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。
二、染色步骤 1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液（用前恢复室温，并充分摇匀）固定 约30-60秒，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干（涂片不固定直接做ANAE染色，阳性反 应强于固定者）； 2、滴加或浸入工作液布满涂片（37℃）孵育分钟，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干 3、F液复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检 参考范围：1.单核细胞系统：呈阳性反应，其反应可被氟化钠抑制。 2.粒细胞系统：各期粒细胞多呈阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，其反应不被氟化钠抑制。 3.巨核细胞及血小板为阳性。 4.淋巴细胞多呈点状阳性，部分淋巴细胞及浆细胞为阴性反应。 5.单核细胞源性的组织细胞、巨噬细胞呈强阳性反应，高雪氏细胞、海蓝组织细胞为阳性。 6.幼红细胞呈阴性反应。 检验结果的解释 细胞浆内红色或棕红色颗粒为阳性。①点样型：主要见于成熟T淋巴细胞，阳性反应呈棕色或棕红色1-4个圆形、团块、边界清楚的大点状颗粒定位于细胞浆中。②弥散型：阳性 反应呈棕红色尘粒状、弥散分布，可位于细胞浆的某一局部，边界不清。③单核细胞型：阳性反应为均匀棕红色弥漫性遍布整个细胞浆。 检验方法的局限性 仅限于形态学染色观察使用 注意事项 1、5Tests只限滴染使用
免疫组化非特异性背景染色及其控制方法 一、非特异性染色的识别 常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。 二、非特异性染色的原因 1. Ig与Fc受体结合 多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。 避免方法： ①用以二抗相同种族的正常血清封闭切片； ②用不含Fc段的抗体，但价格贵 （V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化） 2．静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。 避免方法： ①尽量稀释一抗 ②降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS； ③用去垢剂如triton-100处理切片。Tween-20等； 3.二抗与组织中的Ig结合 如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越 明显，如人与猴，兔与豚鼠。 避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。 4．组织中残存醛基与Ig的结合
如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和Ig结合。 避免方法： ①彻底冲洗； ②0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗； 5．内源性过氧化物酶 红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。 避免方法： ①石蜡切片0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片； ②冰冻切片3%双氧水处理切片5分钟（99：1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏； ③对于骨髓涂片 最好用非过氧化物酶标记的抗体 如碱性磷酸酶（AP） ↓ 磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料 ↓ 快兰(fast blue)或快红(fast red) ↓ ↓ 兰色红色 用明胶甘油封片，不能用含二甲苯的封片剂，溶于二甲苯。 6. 内源性生物素 以24mg/ml的卵白素封片15分钟； 7. 交叉反应 PcAb敏感性高，但特异性稍低，容易出现非特异性染色。 避免方法： ①尽可能稀释抗体； ②尽可能用McAb; 三、抗体最大稀释度的求法
仅供科研版本号：180110 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色液(CAE法) 【产品组成】 【保存条件】 室温, 4℃，避光，6个月 【产品概述】 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specificesterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色液(CAE法)又称氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)染色液或特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的特异性酯酶将氯乙酸AS-D萘酚水解产生萘酚AS-D，萘酚AS-D再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色有特异性，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的特异性酯酶染色。色该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 【使用方法】 1、新鲜血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入预冷的CAE固定液4℃固定30s。如果固定培养细胞或细胞爬片等，宜采用PFA固定液固定10-20min。 2、水洗1-2min，晾干。 3、入配制好的AS-D孵育液，放入湿盒中，室温(15-25℃)避光孵育30min，水洗。 4、入Lea苏木素染色液复染5～15min，水洗，封片。 【染色结果】 阳性反应呈红色颗粒状，定位于细胞质中。 【注意事项】 1、血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。 2、AS-D孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。 3、AS-D孵育液配制后易出现浑浊，但不会影响染色效果。 4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.doczj.com/doc/a25986353.html,/ 第1页
免疫组化染色 一、固定 在12孔板中先用PBS洗两遍，把培养液洗掉，然后加入4%的多聚甲醛（PFA）10min（室温），再用PBS洗3次，每次间隔5 min。 二、破膜 将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.05% Triton PBS 破膜2 min（室温条件下），PBS洗3次，每次间隔5 min。 注释：第一步和第二步可以合并，具体操作如下 固定和破膜 1、在12孔板中加入4%的多聚甲醛（PFA），轻柔摇匀使其铺满孔板后将玻片加到孔板中，37℃，20~30 min。 2、将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.1 % Triton PBS （浓度最高不超过0.3 %）破膜2 min，PBS洗3次，每次间隔5 min（清洗时应该沿孔壁清洗不要接触玻片，否则其表面的细胞会被清洗掉）。 三、封闭 用二抗来源的10% 的血清封闭，室温封闭1 h。 封闭缓冲液（20mL） 10 % NGS （山羊血清Normal Goat Serum） 0.05 % Tween 20 （10 % Tween 20 100uL） 1×PBS 加至20mL 注释：如果时间来不及可放置在4°中过夜。 四、一抗 用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。4℃过夜，每个玻片150ul。PBS洗6次，每次间隔5 min。 或者 用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。将封闭缓冲液吸掉，加入PBS，轻柔摇匀使其铺满孔板。 将一抗先滴加在封口膜上，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在一抗上，室温放置2~3 h。 五、二抗 用1:500 （PBS），每个玻片150ul，避光1 h。PBS洗6次，每次间隔5 min。 加二抗的方法同上 六、封片 10ul 封片液先滴在载玻片上，尽量不要产生气泡，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在封片剂上，注意封片剂容易凝固。室温避光放置过夜。用指甲油将玻片周围封闭，4°放置即可。
免疫组化非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去 。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。【肝粉的制法】 （1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。 （2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。 （3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。 （4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。 （5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。 （二）透析法 荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。 （1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。 （2）浸入0.02mol/pH 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～
α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE法)操作步骤及染色结果 货号：G1760 有效期：6个月 名称3×10ml3×20ml Storage 试剂(A):NAE固定液10ml20ml RT避光 B1:α-NAE Solution0.2ml0.4ml4℃避光 B2:FBB Solution5ml10ml-20℃避光试剂(B):α-NAE孵育液 B3:α-NAE Buffer5ml10ml RT 临用前，按1:25:25混合，现用现配 试剂(C):甲基绿染色液10ml20ml RT避光试剂(D):NaF solution0.2ml0.4ml RT避光 产品说明： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的非特异性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液。 操作步骤(仅供参考)： 1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入α-NAE固定液固定10-15min。 2、水洗5min，晾干。 3、入配制好的α-NAE孵育液，放入湿盒中，37℃避光孵育1h，水洗。 4、入甲基绿染色液复染，水洗，镜检。
染色结果： 细胞质：灰黑色或棕黑色弥漫性或颗粒状沉淀 细胞核：绿色 注意事项： 1、血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，2天内染色，否则会影响酶活 2、α-NAE孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。 3、α-NAE孵育液配置后可能出现浑浊，这不会影响染色效果 4、每次染色时，应有阳性对照片
医院检验中心酯酶染色---中性非特异性脂酶(α—NAE)染色操作规程 [方法学] 酯酶染色的方法很多，根据与pH底物等不同作用，将常用的酯酶染色法分为两大类，即特异性酯酶染色和非特异性酯酶染色。后者又可分为3类：①中性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酚酯酶、乙酸菜酚酯酶和乙酸菜酚AS-D酯酶。②酸性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酯酶和α—丁酸菜酯酶。②碱性非特异性酯酶染色法：α—丁酸菜酯酶。中性非特异性酯酶染色是单核细胞与粒细胞白血病区别的重要方法，一般实验室可选用此法。 [原理] α—乙酸萘酚经酯酶水解产生萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成灰黑或棕黑色沉淀物，定位于胞浆中。 [试剂]
1．α—醋酸萘酯丙酮液：α—醋酸萘酯1g，加丙酮和蒸馏水混合液100m1，溶解后贮于磨口带塞三角瓶内，4℃ 保存，可使用半年。 2.pH7．4磷酸盐缓冲液：0．07MNa2HPO4(即Na2HPO4) 3．基质液：磷酸盐缓冲液82ml，缓慢滴加α-醋酸萘酯丙酮液1．6ml(滴速约每分钟40滴)，边加边用力振摇。 根据5分钟后，加坚牢蓝B80mg，剧烈振摇10分钟， 立即过滤，滤液两杯，各40ml。 4．氟化钠基质液：称取氟化钠(NaF)61mg加入上述其中基质液1杯内，混匀后，标上标记。 [操作] (1)新鲜涂片两张，分别标上NSE和NaF记号，滴加10％ 甲醛生理盐水，固定5分钟，用自来水轻轻冲洗，当 心血膜脱落，晾干。 (2)两张涂片同时放入各自染色杯内，37℃水浴1小时。 (3)取出后水洗，晾干后镜检。不用复染。 [结果观察]
在胞浆内若有棕黑色或灰黑色弥漫性颗粒沉淀者为阳性，细胞脑浆为黄色者为阴性。 [临床意义] 1．阳性：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血 病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟化钠抑制。 2．弱阳性及阴性：粒细胞、淋巴细胞一般为阴性，若有弱阳性也可被氟化钠抑制。 3．临床鉴别：主要用于鉴别急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病，前者NSE阳性，且受氟化钠 (NaF)抑制；而后者NSE阴性，若有阳性也不受氟 化钠抑制。 [附注] (1)坚牢蓝B和氟化钠可小包分装后干燥器保存 (2)基质液配制过程中要振摇，以促使基质溶解。冬天配 制时应适当加温(置于37℃水箱操作)。基质液现配现
酸性α 醋酸萘酯酶染色法 一、原理 淋巴细胞内含有许多种酶，如α 醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP) 、β 葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。 T淋巴细胞浆内含有的酸性α 醋酸萘酯酶(acid α naphthyl acetate esterase，ANAE) ，在弱酸性条件下，能使底物酸性α 醋酸萘酯水解成醋酸和α 萘酚，后者与六偶氮副品红偶 联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染， 反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法 可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及 血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。 二、材料和方法 (一) 材料 1 2 5%戊二醛溶液(固定液)在0 1mol/L pH值7 4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛 溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。 2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。 3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。 4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。 5 α 醋酸萘酯溶液： α 醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。 6 0 067(1/15)mol/L pH值 7 6磷酸盐缓冲液：
非特异性酯酶染色液(CAE 法) 简介： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。Leagene 氯乙酸AS-D 萘酚酯酶染色液(CAE 法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的非特异性酯酶将氯乙酸AS-D 萘酚水解产生萘酚AS-D ，萘酚AS-D 再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步 骤 (仅供 参 考)： 1、 新鲜血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入预冷的CAE 固定液4℃固定30s 。如果固定培 养细胞或细胞爬片等，宜采用PFA 固定液固定。 2、 水洗，晾干。 3、 入配制好的AS-D 孵育液，放入湿盒中，室温(15-25℃)避光孵育，水洗。 4、 入Lea 苏木素染色液复染，水洗，封片，镜检。 染色结果： 注意事项： 1、 血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。 编号 名称 DE0037 4×10ml DE0037 4×20ml Storage 试剂(A): CAE 固定液 10ml 20ml RT 避光 试剂(B): PFA 固定液(备选) 10ml 20ml 4℃ 避光 试剂(C): AS-D 孵育液 C1: AS-D solution 0.5ml 1ml -20℃ 避光 C2: GBC solution 0.1ml 0.2ml 4℃ 避光 C3: AS-D buffer 9.5ml 19ml RT 临用前，按C1:C2:C3=1:5:95比例混合，即为AS-D 孵育液，即配即用。 试剂(D): Lea 苏木素染色液 10ml 20ml RT 避光 使用说明书 1份 ALP 活性部位 紫红色 细胞核 蓝色
实验五：酸性α—醋酸萘酯酶 一、实验目的和要求： 1、掌握酸性α—醋酸萘酯酶实验的原理及在免疫学方面的应用； 2、学会应用该实验方法鉴别不同免疫细胞在不同疾病中的作用。 二、实验内容： 鉴别人和鼠中T、B淋巴细胞。 三、实验步骤： 1、配制试剂。 A液：PH7.6的磷酸盐缓冲液： 甲液：将9.08克的磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中； 乙液：将23.88克十二水合磷酸氢二钾溶于1L蒸馏水中； 取甲液12mL加乙液88mL即成磷酸盐缓冲液。 B液：4%副品红溶液： 将4克副品红溶于100mL2M盐酸内，溶解过滤，4℃保存。 C液：4%亚硝酸钠溶液： 取0.4克亚硝酸钠溶于10mL蒸馏水中，现用现配。 D液：2%醋酸ɑ萘酯液： 取2克醋酸ɑ萘酯，溶于100mL无水丙酮中，溶解后装棕色瓶，4℃保存。 孵育液：将2.4mLC缓慢滴入到2.4mLB中，震荡混匀，静置5min，之后将此溶液加进80mLA液中，混匀，滴入2mLD，调PH5.8-6.0。 1%孔雀石绿染液： 将1克孔雀石绿溶于100mL蒸馏水中，用氯仿处理后4℃保存。 2、血液涂片 取一只小鼠，断尾采血，涂抹于洁净玻片，编号为D，血液层越薄越好，另外手指尖取血涂片，编号D1。 3、孵育和染色 待血液自然干燥后置于孵育液内，37℃孵育90min，水冲洗5min，孔雀
石绿复染1min，流水冲洗，干燥后，制片显微镜观察（用油镜）。4、结果判定 淋巴细胞胞浆内出现大小不等、数量不一的深红色颗粒者为ANAE阳性细胞（T细胞），胞浆内无颗粒者为ANAE阴性细胞（B细胞）。 四、实验结果 2、分析和讨论 人的TB淋巴细胞相对于小鼠的都比较大，但是形态相似，胞浆内呈现大小不一的红色颗粒为T细胞，B细胞，胞核比较搭，几乎占据整个细胞。 五、作业 酸性α—醋酸萘酯酶在兽医临床上有何应用？ 在免疫学方面的应用，检测TB淋巴细胞的活性，鉴别不同免疫细胞在不同疾病中的作用，ANAE测定可作为评价肝细胞损伤、肝纤维化以及肝脏合成功能异常的一项新的血清学指标。
酯酶染色---中性非特异性脂酶(α—NAE)染色 [方法学] 酯酶染色的方法很多，根据与pH底物等不同作用，将常用的酯酶染色法分为两大类，即特异性酯酶染色和非特异性酯酶染色。后者又可分为3类： ①中性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酚酯酶、乙酸菜酚酯酶和乙酸菜酚 AS-D酯酶。②酸性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酯酶和α—丁酸菜酯酶。②碱性非特异性酯酶染色法：α—丁酸菜酯酶。中性非特异性酯酶染色是单核细胞与粒细胞白血病区别的重要方法，一般实验室可选用此法。 [原理] α—乙酸萘酚经酯酶水解产生萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成灰黑或棕黑色沉淀物，定位于胞浆中。 [试剂] 1．α—醋酸萘酯丙酮液：α—醋酸萘酯1g，加丙酮和蒸馏水混合液100m1，溶解后贮于磨口带塞三角瓶内，4℃保存，可使用半年。 2.pH7．4磷酸盐缓冲液：0．07MNa2HPO4(即Na2HPO4) 3．基质液：磷酸盐缓冲液82ml，缓慢滴加α-醋酸萘酯丙酮液1．6ml(滴速约每分钟40滴)，边加边用力振摇。根据5分钟后，加坚牢蓝B80mg，剧 烈振摇10分钟，立即过滤，滤液两杯，各40ml。 4．氟化钠基质液：称取氟化钠(NaF)61mg加入上述其中基质液1杯内，混匀后，标上标记。 [操作] (1)新鲜涂片两张，分别标上NSE和NaF记号，滴加10％甲醛生理盐水，固 定5分钟，用自来水轻轻冲洗，当心血膜脱落，晾干。 (2)两张涂片同时放入各自染色杯内，37℃水浴1小时。 (3)取出后水洗，晾干后镜检。不用复染。 [结果观察] 在胞浆内若有棕黑色或灰黑色弥漫性颗粒沉淀者为阳性，细胞脑浆为黄色者为阴性。 [临床意义] 1．阳性：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟 化钠抑制。 编写：谢平制定日期：2011.12.1