2、蛋白质分离的双向电泳过程
2．1溶液配制
常用水化上样缓冲液
（Ⅰ）
尿素 8M 4.805g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 65Mm 0.098g
Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％）
溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
（Ⅱ）
尿素 7M 4.2g
硫脲 2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 65Mm 0.098g
Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％）
溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
(Ⅲ)
尿素 5M 3.0g
硫脲 2M 1.52g
SB3-10 2% 0.2g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 65Mm 0.098g
Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％）
溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml 分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液
尿素 6M 36g
SDS 2% 2g
Tris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl) 甘油 20％ 20ml
MilliQ水定容至100ml
分装成10管，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液Ⅰ
胶条平衡缓冲液母液 10ml
DTT 0.2g
充分混匀，用时现配。
胶条平衡缓冲液Ⅱ
胶条平衡缓冲液母液 10ml
碘乙酰胺 0.25g
充分混匀，用时现配。
低熔点琼脂糖封胶液
低熔点琼脂糖 0.5％ 0.5g
Tris 25mM 0.303g
甘氨酸 192mM 1.44g
SDS 0.1% 1ml(10%SDS)
溴酚蓝 0.001％ 100μl(1% 溴酚蓝) MilliQ水定容至100ml
加热溶解至澄清，室温保存。
30％聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺 150g
甲叉双丙稀酰胺 4g
MilliQ水 500ml
滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris碱pH8.8
Tris碱 90.75g
MilliQ水 400ml
用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml, 4℃冰箱保存。
10% SDS
SDS 10g
MilliQ水 100ml
10%过硫酸铵
过硫酸铵 0.1g
MilliQ水 1ml
现用现配。
10×电泳缓冲液
（1×＝25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3）
Tris碱 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水 1L
混匀后，室温保存。
2．2操作步骤
2.2.1 第一向等电聚焦
1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，
2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，
ReadyStrip TM IPG胶
条长度上样体积分析型的上样量
（银染）
制备型的上样量
（考马斯亮兰染色）
7cm 125-250μl10-100ug 200-500ug
17cm 300-600μl100-300ug 1-3mg
2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。
3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。
4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。
5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
6.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
7cm胶条
水化 12h（17-20℃）主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐
S2 500V 慢速 1 h 除盐
S3 1000V 快速 1 h 除盐
S4 4000V 线性 3 h 升压
S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦
S6 500V 快速任意时间保持
17cm胶条
水化 12h（17-20℃）主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐
S2 500V 慢速 1 h 除盐
S3 1000V 快速 1 h 除盐
S4 8000V 线性 5 h 升压
S5 8000V 快速 60,000 伏h 聚焦
S6 500V 快速任意时间保持
●选择所放置的胶条数。
●设置每根胶条的极限电流。
●设置等电聚焦时的温度。
7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。
2.2.2 第二向SDS－PAGE电泳
1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。
2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。
3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。
4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。
5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。
6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
8.将放有胶条的SDS－PAGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。
10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。
11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：5-10mA/gel；17cm胶条：10mA/gel）或低电压(7cm胶条：50-75V/gel；17cm胶条75-100V/gel)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流(7cm胶条：10-15mA/gel；17cm胶条：20-30mA/gel)或电压(7cm胶条：150-200V/gel；17cm胶条：300-400V/gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。然后进行染色。
2．3染色方法
2.3.1考马斯亮蓝G-250染色
固定液：45％（V/V）甲醇，1％（V/V）乙酸
G-250染色液：17％（W/V）硫酸铵，34％（V/V）甲醇，0.5％（V/V）乙酸，0.1％（W/V）G-250.
步骤：1.固定液固定20min或过夜（无需固定液可）。
2.倒出固定液
3.加入G-250染色液，18-24h。
4.倒出染色液
5.用水洗（20min一次，45～55℃温水有助于水洗）
6.可用塑料包裹，4℃贮于密封盆里。
2.3.2胶体考染法
1.用去离子水清洗凝胶两次，每次10min，以去除SDS。
2.固定：50％乙醇/10％冰醋酸/的水溶液，至少30min,可过夜。
3.染色：染色液为45％甲醇/10％冰醋酸/0.25％G-250溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少2h。
4.脱色：多次更换脱色液（25％乙醇/8％冰醋酸溶液）直至背景脱净。
5.保存：用保险膜包裹，可存一个月。
2.3.3银染法
步骤试剂体积（ml）不同类型胶所需时间(min) 1mm 1.5mm
1.固定 10％乙酸 / 40％乙醇 / 水 2×250 2×15 2×60
2.敏化 75ml乙醇 / 17g乙酸钠 /
10ml 5% Na
2S
2
O
3
/ 250 30 60
1.25ml戊二醛 / 加水至
3.水洗去离子水 3～5×250 3×15 5×8
4.银染 25ml AgNO
3
(2.5%) /
100μl甲醛/ 加水至 250 20 60 5.水洗去离子水 2～4×250 2×1 4×1
6.显色 6.25g Na
2CO
3
/ 100μl甲醛
7μl Na
2S
2
O
3
(5%) 250 4 6
7.停止 3.65g EDTA 加水至 250 10 40
8.水洗去离子水 2～3×250 3×5 2×30
3、等电聚焦蛋白样品的浓度检测
3．1 Bio-Rad RC DC Protein Assay 微离心管检测方法
（1）将5μl DC试剂S与250μl DC试剂A混合（试剂A’），每份样品或标准溶液需要127μl试剂A’。
（2）将标准蛋白稀释为3-5份蛋白浓度在0.2-1.5mg/ml范围内的标准溶液，在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。（为得到最佳结果，标准蛋白应与样品使用同样的缓冲液）
（3）从每份样品或标准蛋白中取出25μl，分别加至清洁、干燥的微离心管中。
（4）向每管中加入125μl RC试剂Ⅰ，混旋后室温放置1min。
（5）向每管中加入125μl RC试剂Ⅱ并混旋，之后在15，000×g速度下离心3-5min。
（6）吸去上清，然后将管子倒置在干净吸水纸上，使溶液彻底被吸干。
（7）向每个微离心管中加入 127μl试剂A’并混旋，在室温下放置5min 或直至沉淀彻底溶解。在进行下一步之前再次混旋。
（8）在每个管中加入1ml DC试剂B，立即混旋，室温下放置15min。
（9）在750nm下读取吸光度，吸光度测定要在1h内完成。
3．2 Bradford法
1、溶液的配制
Bradford储存液
100ml 95% 乙醇
200ml 88% 磷酸
350mg 考马斯亮蓝G-250
室温下长期保持稳定。
Bradford 工作液
425ml MilliQ 水
15ml 95% 乙醇
30ml 88% 磷酸
30ml Bradford储存液
Whatman 1号滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，用前过滤。
2.1mg/ml BSA蛋白质标准溶液
10mg BSA标准蛋白
10ml MilliQ 水
分装成10小管，-20℃冰箱保存。
2、标准曲线的测定
ID BSA蛋白质 MilliQ水 Bradford Abs
标准溶液（μl）（μl）工作液（ml） (A595) Blank 0 100 1 0
0 100 1 0
1 2.5 97.5 1 0.0656
2.5 97.5 1 0.0656 2 5 95 1 0.1626
5 95 1 0.1852 3 7.5 92.5 1 0.2248 7.5 92.5 1 0.2543 4 10 90 1 0.2611
10 90 1 0.3020 5 12.5 87.5 1 0.3034
12.5 87.5 1 0.3080 6 15 85 1 0.3218
15 85 1 0.3523 7 17.5 82.5 1 0.3514 17.5 82.5 1 0.4236 8 20 80 1 0.4279 20 80 1 0.4234 3、未知蛋白浓度的测定
步骤：
（1）将未知蛋白溶液移至试管，补加MilliQ水至100μl。
（2）加入1ml Bradford 工作液，充分混匀。
（3）3.2min后测A
的OD值。
595
的OD值，及未知蛋白的稀释倍数，即可算出未知蛋白（4）根据测得的A
595
的浓度。
3．3 考马斯亮蓝G-250染色法
1、溶液的配制
（1）染色液配制
95％乙醇 50ml
85％磷酸 100ml
考马斯亮蓝 G-250 100mg
用MilliQ水稀释定容至1000ml,滤纸过滤，保存于棕色瓶中，4℃冰箱
备用。
（2） 300u g/ml标准蛋白质溶液配制
BSA 标准蛋白质 30mg
MilliQ水定容至100ml
2、标准曲线的测定
ID 标准蛋白质 MilliQ水蛋白浓度染色液 ABS 溶液（μl）（μl）（ug/ml）（ml） (A
)
595
1 0 1000 0 3 0
0 1000 0 3 0
2 50 950 15
3 0.2879
50 950 15 3 0.2884
3 100 900 30 3 0.4912
100 900 30 3 0.4948
4 200 800 60 3 0.7835
200 800 60 3 0.7901
5 300 700 90 3 1.0738
300 700 90 3 1.0775
6 400 600 120 3 1.1804
400 600 120 3 1.1831
7 500 500 150 3 1.2663
500 500 150 3 1.2712
8 600 400 180 3 1.3434
600 400 180 3 1.3497
9 800 200 240 3 1.4482
生物信息学复习题 名词解释 1. Homology (同源):来源于共同祖先的序列相似的序列及同源序列。序列相似序列并不一定是同源序列。 （直系同源）：指由于物种形成的特殊事件来自一个共同祖先的不同物种中的同源序列，它们具有相似的功能。 （旁系（并系）同源）：指同一个物种中具有共同祖先，通过基因复制产生的一组基因，这些基因在功能上的可能发生了改变。基因复制事件是促进新基因进化的重要推动力。 (异同源)：通过横向转移，来源于共生或病毒侵染而产生的相似的序列，为异同源。 Score：The sum of the number of identical matches and conservative (high scoring) substitutions in a sequence alignment divided by the total number of aligned sequence characters. Gap总是不计入总数中。 6.点矩阵（dot matrix）：构建一个二维矩阵，其X轴是一条序列，Y轴是另一个序列，然后在2个序列相同碱基的对应位置（x，y）加点，如果两条序列完全相同则会形成一条主对角线，如果两条序列相似则会出现一条或者几条直线；如果完全没有相似性则不能连成直线。 7. E值：得分大于等于某个分值S的不同的比对的数目在随机的数据库搜索中发生的可能性。衡量序列之间相似性是否显著的期望值。E值大小说明了可以找到与查询序列（query）相匹配的随机或无关序列的概率，E值越小意味着序列的相似性偶然发生的机会越小，也即相似性越能反映真实的生物学意义，E值越接近零，越不可能找到其他匹配序列。 值：得分为所要求的分值比对或更好的比对随机发生的概率。它是将观测得到的比对得分S，与同样长度和组成的随机序列作为查询序列进行数据库搜索进行比较得到的HSP（高分片段对）得分的期望分布联系起来计算的。通常使用低于来定义统计的显著性。P=1-e-E 9.打分矩阵（scoring matrix）：在相似性检索中对序列两两比对的质量评估方法。包括基于理论（如考虑核酸和氨基酸之间的类似性）和实际进化距离（如PAM）两类方法,是序列相似性分析的基础，其不同的选择将会出现不同的分析结果。 10．空位（gap）：在序列比对时，由于序列长度不同，需要插入一个或几个位点以取得最佳比对结果，这样在其中一序列上产生中断现象，这些中断的位点称为空位。 ：美国国家生物技术信息学中心，属于美国国立医学图书馆的一部分，具有BLAST, Entrez ,GenBank等工具，还具有PubMed文献数据库。另外还具有Genome, dbEST, dbGSS , dbSTS, MMDB, OMIM, UniGene, Taxonomy, RefSeq, etc. 序列格式：是将DNA或者蛋白质序列表示为一个带有大于号（>）开始的核苷酸或者氨基酸序列的新文件，其中大于号后可以跟上序列的相关信息，其他无特殊要求。 13genbank序列格式：是GenBank 数据库的基本信息单位，是最为广泛的生物信息学序列格式之一。该文件格式按域划分为4个部分：第一部分包含整个记录的信息（描述符）；第二部分包含注释，主要包含生物功能或数据库信息；第三部分是feature，对序列的注释；第四部分是序列本身，以“统发生树（Phylogenetic tree ）是研究生物进化和系统发育过程中的一种用树状分支图来概括各种生物之间亲缘关系，是一种亲缘分支分类方法。在树中，每个节点代表其各分支的最近共同祖先，而节点间的线段长度对应演化距离（如估计的演化时间）。是用来研究物种进化与多样性的基础，是相近物种相关生物学数据的来源。17.基因树与物种树：物种树反映一组物种进化历程的系统树，其中每一个内部节点就代表一个物种形成的过程，而基因树则是代表来源于不同物种的单个同源基因的差异构建的系统树，而其内部的一个节点则代表一个祖先基因分化为两个新的独特的基因序列的事件。基因
《医学免疫学》实验教学大纲 实验名称：医学免疫学 学时：6学时 学分： 适应专业：护理学专业 执笔人：边藏丽 审定人：王恺兵 一、实验目的与任务 实验教学是医学免疫学教学的重要组成部分，通过实验教学加深对基础理论知识的理解，了解常用的免疫学检查方法，掌握免疫学基本实验技术（试管凝集、玻片凝集、对流免疫电泳、免疫细胞形态观察、淋巴细胞分离、ELISA等），培养学生严谨求实的科学态度以及观察、分析、综合能力、创造思维能力和初步的科研能力。 二、教学基本要求 医学免疫学实验对象多为具有传染性的材料，要求学生在实验教学中严格遵守实验室规则，牢固树立无菌观念，认真操作与观察实验结果，实事求是的记录实验结果，并对实验结果进行认真分析和讨论。 四、实验教学内容及学时分配 实验一凝集反应（试管凝集、玻片凝集） 3学时 1．目的要求 掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；掌握凝集反应原理、方法和用途。 2．方法原理 颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。 3．主要实验仪器及材料 试管、玻片、水浴箱、吸管、伤寒杆菌“H”“O”诊断菌液、大肠埃希菌、大肠埃希菌
诊断血清等。 4．掌握要点 掌握凝集反应原理、方法和用途；血清效价；凝集现象的观察。 5．实验内容： （1）玻片凝集（抗原定性试验） （2）试管凝集（抗体定量试验） 实验二对流免疫电泳、血型鉴定 2学时1．目的要求 掌握沉淀的反应原理、方法和用途；了解对流免疫电泳的操作步骤，结果观察；掌握血型鉴定的反应原理、方法及结果判断。 2．方法原理 对流免疫电泳是将经典沉淀反应与电泳技术结合而设计的一项实验。沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在一定条件下发生结合并出现肉眼可见的沉淀物的一种血清学反应。 带电的胶体颗粒可在电场中移动，其移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。抗原在的缓冲带负电荷，将抗原加于琼脂板阴极端的小孔中，由阴极向阳极移动；抗体为球蛋因电渗作用而流向阴极。当抗原抗体在两孔间相遇时，在两者比例适当处形成白色沉淀线。此种在双向琼指扩散基础上加电泳的方法，称为对流免疫电泳。 血型鉴定属直接凝集反应。将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。如果抗原与抗体相对应，则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。 3．主要实验仪器及材料 标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）、酒精棉球、采血针、载玻片、待测血清、甲胎蛋白诊断血清，肝癌病人阳性血清， L巴比妥缓冲液，琼脂对流免疫板、打孔器、加样器、电泳仪等。 4．掌握要点 （1）对流免疫电泳的操作步骤，结果观察； （2）血型鉴定的方法及结果判断。 5．实验内容： （1）讲述沉淀的反应原理、方法和用途；对流免疫电泳的操作步骤，结果观察；血型鉴定的反应原理、方法及结果判断； （2）对流免疫电泳的操作及结果观察； （3）血型鉴定的操作及结果观察； 实验三小鼠吞噬细胞及转化细胞形态观察 2学时 1.目的要求 观察吞噬细胞的吞噬现象；了解机体的非特异性免疫功能。观察转化细胞、淋巴母细胞的形态了解机体的特异性免疫功能。 2．方法原理 巨噬细胞可吞噬异种或异体细胞等体积较大的异物，中性粒细胞可吞噬多种细菌。观察这两类细胞的吞噬现象，可计算出吞噬异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数，用以评价机体的免疫状态。 淋巴细胞，在受抗原的刺激后，可转化为淋巴母细胞，淋巴细胞转化率的高低可反映机体细胞免疫水平。
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
■一、选择题: 1.以下哪一个是mRNA条目序列号： A. J01536■. NM_15392 C. NP_52280 D. AAB134506 2.确定某个基因在哪些组织中表达的最直接获取相关信息方式是：■. Unigene B. Entrez C. LocusLink D. PCR 3.一个基因可能对应两个Unigene簇吗？■可能 B. 不可能 4.下面哪种数据库源于mRNA信息：■dbEST B. PDB C. OMIM D. HTGS 5.下面哪个数据库面向人类疾病构建： A. EST B. PDB ■. OMIM D. HTGS 6.Refseq和GenBank有什么区别： A. Refseq包括了全世界各个实验室和测序项目提交的DNA序列B. GenBank提供的是非冗余序列 ■. Refseq源于GenBank，提供非冗余序列信息D. GenBank源于Refseq 7.如果你需要查询文献信息，下列哪个数据库是你最佳选择： A. OMIM B. Entrez ■PubMed D. PROSITE 8.比较从Entrez和ExPASy中提取有关蛋白质序列信息的方法，下列哪种说法正确：A. 因为GenBank的数据比EMBL更多，Entrez给出的搜索结果将更多B. 搜索结果很可能 一样，因为GenBank和EMBL的序列数据实际一样■搜索结果应该相当，但是ExPASy中的SwissProt记录的输出格式不同 9.天冬酰胺、色氨酸和酪氨酸的单字母代码分别对应于：■N/W/Y B. Q/W/Y C. F/W/Y D. Q/N/W 10.直系同源定义为：■不同物种中具有共同祖先的同源序列B. 具有较小的氨基酸一致性但是有较大的结构相似性的同源序列 C. 同一物种中由基因复制产生的同源序列 D. 同一物种中具有相似的并且通常是冗余的功能的同源序列 11.下列那个氨基酸最不容易突变： A. 丙氨酸B. 谷氨酰胺 C. 甲硫氨酸■半胱氨酸 12.PAM250矩阵定义的进化距离为两同源序列在给定的时间有多少百分比的氨基酸发生改变： A. 1% B. 20%■. 80% D. 250% 13.下列哪个句子最好的描述了两个序列全局比对和局部比对的不同：A. 全局比对通常用于比对DNA序列，而局部比对通常用于比对蛋白质序列B. 全局比对允许间隙，而局 部比对不允许C. 全局比对寻找全局最大化，而局部比对寻找局部最大化■全局比对比对整体序列，而局部比对寻找最佳匹配子序列 14.假设你有两条远源相关蛋白质序列。为了比较它们，最好使用下列哪个BLOSUM和PAM矩阵：■BLOSUM45和PAM250 B. BLOSUM45和PAM 1 C. BLOSUM80和PAM250 D. BLOSUM10和PAM1 15.与PAM打分矩阵比较，BLOSUM打分矩阵的最大区别是：A. 最好用于比对相关性高的蛋白B. 它是基于近相关蛋白的全局多序列比对 ■它是基于远相关蛋白的局部多序列比对D. 它结合了全局比对和局部比对 16.如果有一段DNA序列，它可能编码多少种蛋白质序列： A. 1 B. 2 C. 3 ■. 6 17.要在数据库查询一段与某DNA序列编码蛋白质最相似的序列，应选择： A. blastn B. blastp C. tblastn D. tblastp■blastx 18.为什么ClustalW（一个采用了Feng-Doolittle渐进比对算法的程序）不报告E值：A. ClustalW报告E值■使用了全局比对 C. 使用了局部比对 D. 因为是多序列比对 19.Feng-Doolittle方法提出“一旦是空隙，永远是空隙”规则的依据是：A. 保证空隙不会引物序列加入而填充B. 假定进化早期分歧的序列有较高优先级别■假定最近序列空隙应 该保留 D. 假定最远序列空隙应该保留 20.根据分子钟假说：A. 所有蛋白质都保持一个相同的恒定进化速率 B. 所有蛋白质的进化速率都与化石记录相符合C. 对于每一个给定的蛋白质，分子进化的速率是逐 渐减慢的，就如同不准时的钟■对于每一个给定的蛋白质，其分子进化的速率在所有的进化分支上大致是恒定 21.系统发生树的两个特征是： A. 进化分支和进化节点■树的拓扑结构和分支长度C. 进化分支和树根D. 序列比对和引导检测方法 22.下列哪一个是基于字母特征的系统发生分析的算法：A. 邻位连接法（NJ法）B. Kimura算法■最大似然法（ML）D. 非加权平均法（UPGMA） 23.基于字母特征和基于距离的系统发生分析的算法的基本差异是：■基于字母特征的算法没有定义分支序列的中间数据矩阵 B. 基于字母特征的算法可应用于DNA或者蛋白质序列，而基于距离仅能用于DNA C. 基于字母特征的算法无法运用简约算法 D. 基于字母特征的算法的进化分支与进化时间无关 24.一个操作分类单元（OTU）可指：A. 多序列比对■蛋白质序列C. 进化分支D. 进化节点 25.构建进化树最直接的错误来源是：■多序列比对错误B. 采样的算法差异C. 假设进化分支是单一起源D. 尝试推测基因的进化关系 26.第一个被完整测定的基因组序列是：A. 啤酒酵母的3号染色体B. 流感病毒■ФX174 D. 人类基因组 27.普通的真核生物线粒体基因组编码大约多少个蛋白质：■10 B. 100 C. 1000 D. 10000 28.根据基因组序列预测蛋白质编码基因的算法的最大问题是：A. 软件太难使用■. 假阳性率太高，许多不是外显子的序列部分被错误指定C. 假阳性率太高，许 多不是外显子功能未知 D. 假阴性率太高，丢失太多外显子位点 29.HIV病毒亚型的系统演化研究可以：A. 证实HIV病毒是由牛病毒演化而来■. 用于指导开发针对保守蛋白的疫苗C. 证实哪些人类组织最容易遭受病毒侵染 30.一个典型的细菌基因组大小约为多少bp：A. 20000■. 200000 C. 2000000 D. 20000000
植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.doczj.com/doc/b1193737.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
生物信息学课后习题及答案 （由10级生技一、二班课代表整理） 一、绪论 1.你认为，什么是生物信息学？ 采用信息科学技术，借助数学、生物学的理论、方法，对各种生物信息（包括核酸、蛋 白质等）的收集、加工、储存、分析、解释的一门学科。2.你认为生物信息学有什么用？对你的生活、研究有影响吗？（1）主要用于： 在基因组分析方面：生物序列相似性比较及其数据库搜索、基因预测、基因组进化和分 子进化、蛋白质结构预测等 在医药方面：新药物设计、基因芯片疾病快速诊断、流行病学研究：SARS 、人类基因组计划、基因组计划：基因芯片。 （2）指导研究和实验方案，减少操作性实验的量；验证实验结果；为实验结果提供更多的支持数据等材料。 3.人类基因组计划与生物信息学有什么关系？ 人类基因组计划的实施，促进了测序技术的迅猛发展，从而使实验数据和可利用信息急剧增加，信息的管理和分析成为基因组计划的一项重要的工作 。而这些数据信息的管理、分析、解释和使用促使了生物信息学的产生和迅速发展。 4简述人类基因组研究计划的历程。 通过国际合作，用15年时间（1990-2005）至少投入30亿美元，构建详细的人类基因组遗传图和物理图，确定人类DNA 的全部核苷酸序列，定位约10万基因，并对其他生物进行类似研究。 1990，人类基因组计划正式启动。 1996，完成人类基因组计划的遗传作图，启动模式生物基因组计划。 1998完成人类基因组计划的物理作图，开始人类基因组的大规模测序。Celera 公司加入，与公共领域竞争启动水稻基因组计划。 1999，第五届国际公共领域人类基因组测序会议，加快测序速度。 2000，Celera 公司宣布完成果蝇基因组测序，国际公共领域宣布完成第一个植物基因组——拟南芥全基因组的测序工作。 2001，人类基因组“中国卷”的绘制工作宣告完成。 2003，中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的.目标全部实现。2004，人类基因组完成图公布。 2.我国自主知识产权的主要基因组测序计划有哪些？水稻（2002），家鸡（2004），家蚕（2007），家猪（2012），大熊猫（2010） 2．第一章 、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。管线敷设技术包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行 高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。 、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
第六节免疫药理学实验方法与技术简介 免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。 免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。 一、免疫细胞的分离与纯化 体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。 外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。 从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。 淋巴细胞的分离纯化包括：①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B 细胞及T细胞亚群的分离纯化常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magnetic activated cell sorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flow cytometry，FCM）。 二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介 1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。 2、对免疫细胞功能的影响常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。 3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）、体内检测T H细胞活性。 4、对B细胞影响的体内外实验血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。 5、对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。 6、对超敏反应影响的体内外实验总IgE水平测定：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫单扩散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被动血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、纸片放射免疫吸附试验（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特异性IgE抗体测定：ELISA、放射过敏原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）、P-K试验、被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮内试验（intradermal test）。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定：微量固相放射免疫测定法（microtiter solid-phase
实验一免疫球蛋白的粗提（盐析法） 一、实验目的 1、学习免疫球蛋白的粗提方法 2、实践IgG分离纯化过程 3、了解分离纯化抗体的原理 二、实验原理 随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。
二、实验材料与试剂配制 1．人全血清（购买商品） 2．硫酸铵饱和溶液 硫酸铵800g~850g H2O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH 调pH至7.0（不调pH值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。 3．0.01Mol/L pH7.4 PBS液 A液：0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4·2H2O 15.60g
UTR的含义是（B ） A.编码区 B. 非编码区 C. motif的含义是（D ）。 A.基序 B. 跨叠克隆群 C. algorithm 的含义是（B ）。 A.登录号 B. 算法 C. RGR^ （D ）。 A.在线人类孟德尔遗传数据 D.水稻基因组计划 下列Fasta格式正确的是（B） 低复杂度区域 D. 幵放阅读框 碱基对 D. 结构域 比对 D. 类推 B. 国家核酸数据库 C. 人类基因组计划 A. seql: agcggatccagacgctgcgtttgctggctttgatgaaaactctaactaaacactccctta B. >seq1 agcggatccagacgctgcgtttgctggctttgatgaaaactctaactaaacactccctta C. seq1:agcggatccagacgctgcgtttgctggctttgatgaaaactctaactaaacactccctta D. >seq1agcggatccagacgctgcgtttgctggctttgatgaaaactctaactaaacactccctta 如果我们试图做蛋白质亚细胞定位分析，应使用（D） A. NDB 数据库 B. PDB 数据库 C. GenBank 数据库 D. SWISS-PROT 数
据库 Bioinformatics 的含义是（A ）。 A. 生物信息学 B. 基因组学 C. 蛋白质组学 D. 表观遗传学 Gen Bank中分类码PLN表示是（D ）。 A.哺乳类序列 B. 细菌序列 C.噬菌体序列 D. 植物、真菌和藻类序列 ortholog 的含义是（A）0 A.直系同源 B.旁系同源 C.直接进化 D.间接进化 从cDNA文库中获得的短序列是（D ）o A. STS B. UTR C. CDS D. EST con tig的含义是（B ）o A.基序 B. 跨叠克隆群 C. 碱基对 D. 结构域 TAIR （AtDB）数据库是（C）o A.线虫基因组 B. 果蝇基因组 C. 拟南芥数据库 D. 大肠杆菌基因组ORF的含义是（D ）o A.调控区 B. 非编码区 C.低复杂度区域 D. 幵放阅读框
1实验内容： 2显微镜油镜的使用与保护。 3细菌的形态与结构的观察。 4实验目的： 5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。 6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。 7熟悉细菌的特殊结构。 8实验材料： 显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。 4实验方法： (1)显微镜油镜的使用与保护 显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的 工具。因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。 1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。 2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。 3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。 ⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。 ⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。 4、显微镜的保护： ⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。 ⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。 ⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。置于干燥处，以防受潮。 (二)细菌形态观察
1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌 2、细菌的特殊结构： 荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌 鞭毛：水弧菌（周毛菌） 芽胞：破伤风杆菌（芽胞位于菌体顶端，呈鼓槌状）
中科院生物信息学期末考试复习题 陈润生老师部分： 1.什么是生物信息学，如何理解其含义？为什么在大规模测序研究中，生物信息学至关重要？ 答：生物信息学有三个方面的含义： 1)生物信息学是一个学科领域，包含着基因组信息的获取、处理、存储、分配、分析和 解释的所有方面，是基因组研究不可分割的部分。 2)生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，破译隐藏在DNA序列中的遗传语 言，特别是非编码区的实质；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测；其本质是识别基因信号。 3)生物信息学的研究目标是揭示“基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律”。它 是当今自然科学和技术科学领域中“基因组、“信息结构”和“复杂性”这三个重大科学问题的有机结合。 2.如何利用数据库信息发现新基因，其算法本质是什么？ 答：利用数据库资源发现新基因，根据数据源不同，可分2种不同的查找方式： 1)从大规模基因组测序得到的数据出发，经过基因识别发现新基因： （利用统计，神经网络，分维，复杂度，密码学，HMM，多序列比对等方法识别特殊序列，预测新ORF。但因为基因组中编码区少，所以关键是“数据识别”问题。）利用大规模拼接好的基因组，使用不同数据方法，进行标识查找，并将找到的可能的新基因同数据库中已有的基因对比，从而确定是否为新基因。可分为：①基于信号，如剪切位点、序列中的启动子与终止子等。②基于组分，即基因家族、特殊序列间比较，Complexity analysis，Neural Network 2)利用EST数据库发现新基因和新SNPs： （归属于同一基因的EST片断一定有overlapping，通过alignment可组装成一完整的基因，但EST片断太小，不存在数据来源，主要是拼接问题） 数据来源于大量的序列小片段，EST较短，故关键在正确拼接。方法有基因组序列比对、拼接、组装法等。经常采用SiClone策略。其主要步骤有：构建数据库；将序列纯化格式标准化；从种子库中取序列和大库序列比对；延长种子序列，至不能再延长；放入contig库①构建若干数据库：总的纯化的EST数据库，种子数据库，载体数据库，杂质、引物数据库，蛋白数据库，cDNA数据库； ②用所用种子数据库和杂质、引物数据库及载体数据库比对，去除杂质； ③用种子和纯化的EST数据库比对 ④用经过一次比对得到的长的片段和蛋白数据库、cDNA数据库比较，判断是否为已有序列，再利用该大片段与纯化的EST数据库比对，重复以上步骤，直到序列不能再延伸； ⑤判断是否为全长cDNA序列。 （利用EST数据库：原理：当测序获得一条EST序列时，它来自哪一个基因的哪个区域是未知的（随机的），所以属于同一个基因的不同EST序列之间常有交叠的区域。根据这种“交叠”现象，就能找出属于同一个基因的所有EST序列，进而将它们拼接成和完整基因相对应的全长cDNA序列。而到目前为止，公共EST数据库(dbEST)中已经收集到约800万条的人的EST序列。估计这些序列已覆盖了人类全部基因的95%以上，平均起来每个基因有10倍以上的覆盖率。）
免疫学实验整理 一、凝集试验、吞噬试验 （一）凝集试验 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （二）吞噬试验（示教） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 名解： 1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。 2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。 3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。 4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。 5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。 6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer. 实验及注意点： 1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原） 检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。
蛋白质组学复习资料 一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片 基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。 是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。 应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简