抗菌肽替代抗生素对肉鸡生产性能、免疫功能及肠道健康的作用效果
试验方案
一、研究背景
由于饲用抗生素的危害日趋严重，目前允许使用的种类越来越少，欧盟已于去年全面禁止在饲料中添加使用，所以开展抗生素替代物的研究显得非常重要。本试验以抗菌肽为研究材料，添加到肉鸡日粮中，研究不同的添加量对肉鸡的生长、消化和免疫系统的影响，并通过肠绒毛结构的观察及免疫指标的检测，探索抗菌肽增强肉鸡生产功能的机理，旨在确定应用抗菌肽替代饲用抗生素的可行性，为抗菌肽制剂在肉鸡生产中推广利用提供试验数据。
二、试验设计
本试验采用单因子完全随机化试验设计，将900（或720）只AA肉鸡随机分
成6个处理，每个处理6个重复，每个重复25（20）只鸡，试验期为6周。
试验材料：富力泰C（海纳川药业的抗菌肽）、抗菌肽D对照组（国内某企业生
产的抗菌肽）、恩拉鼎F-40（先灵葆雅的恩拉霉素）。
具体试验设计见表1。
表1 试验设计
处理
组别
A空白对照组（日粮不添加任何抗生素）
B富力泰C1组（空白对照组日粮+50mg/kg抗菌肽）
C富力泰C2组（空白对照组日粮+100mg/kg抗菌肽）
D 富力泰C3组（空白对照组日粮+150mg/kg抗菌肽）
E抗生素对照组（日粮+200mg/kg恩拉鼎F-40组, 4ppm,不休药）
F 抗菌肽D对照组（日粮+200mg/kg肽生素）
三、测定指标
1.生产性能
在试验的第21d和42d，每个重复的鸡空腹称重，记录前后两期（1-21d，22-42d）每个重复鸡的体重和采食量，统计计算平均日采食量、平均日增重和料重比。
平均日采食量（ADFI）=总耗料量/饲养日
平均日增重（ADG）=（试验末体重-起始体重）/试验天数
料重比（F/G）=总耗料/总增重试验鸡每周统计一次耗料。
2.免疫功能
1）免疫器官指数测定
试验第21d和42d，从个每个重复中随机取2只鸡，称重后宰杀，解剖剥离或摘取胸腺、脾脏、法氏囊，称取各免疫器官重量。免疫器官指数计算公式：脾脏指数=脾脏重量（g）/鸡体重（kg）
胸腺指数=胸腺重量（g）/鸡体重（kg）
法氏囊指数=法氏囊重量（g）/鸡体重（kg）
2）血清生化指标
试验第21d和42d，从每个重复中随机取2只鸡，翅静脉采血，离心分离血清，用免疫透射比浊法试剂盒，测定血清中血清白蛋白、IgG、IgM以及补体C3、C4含量。同时用免疫比浊法试剂盒测定血清中的溶菌酶。
3.肠道健康的影响
1）肠道食糜消化酶活性
样品采集和处理：21d和42d，从个每个重复中随机取2只鸡，宰杀，取小肠食糜。食糜用4℃的0.4mol/L氯化钠溶液稀释10倍，匀浆。将匀浆液4℃下1200rpm 离心5min，将上清液置于﹣20℃保存备测。测定淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等活性，采用南京建成生物有限公司试剂盒。
2）肠道内容物菌群测定
试验第21d和42d，从每个重复中随机取2只鸡，宰杀，无菌取回盲交接处回肠、盲肠段，两端结扎，无菌操作台内称取0.5g左右肠段内容物于灭菌稀释瓶内，加入先配好已灭菌的生理盐水4—10倍稀释，将回盲肠内容物稀释液10ul 分别接种于麦康凯培养基、MRS培养基，培养肠道内大肠杆菌、乳酸杆菌。
细菌数量统计：根据菌落可数性原则，选择合适稀释度，用血球计数板统计菌落个数，换算出每克肠道内容物中所含有的细菌数，并以其对数值表示（lgN/g）。
3）小肠绒毛长度及隐窝深度比值
试验第21d和42d，从个每个重复中随机取2只鸡，宰杀，取空肠（卵黄囊遗迹之上5cm）肠管约2cm，用10%甲醛磷酸缓冲液固定，做石蜡切片，HE染色，显微镜观察。
4.残留检测
42d杀鸡，取肌肉及肝脏样，检测肌肉样及肝脏恩拉霉素残留，将每个重复中随机取的2只鸡的样品合并检测，加上空白对照共：3组*6重复*2肌肉及肝脏样=36个样。对于抗菌肽组，检测高、中、低及空白对照组的肌肉、肝脏、粪便中的抗菌肽基因。共4组*6重复*3=72个样。具体的引物设计请参考“转柞蚕抗菌肽CAD基因毕赤酵母GS115.CAD-1在广东省环境释放”。
5. 经济效益分析
4%的恩拉鼎F-40价格为120元/千克，富力泰C成本约120元/千克，肽生素成本约80元/千克。根据生长性能指标评估成本。
体外试验
1、产品评价
检测富力泰、肽生素的药物残留（即产品是否掺有抗生素）
2、体外抑菌试验
采用琼脂打孔法对恩拉鼎F-40、富力泰C、肽生素进行体外抑菌试验。以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌为病原指示菌，测以上三种产品的MIC值。以富力泰C对大肠杆菌的MIC检定为例，方法如下：
1.试剂：
液体LB培养基配制
胰蛋白胨：1% OXOID牌TRYPTONE
酵母浸粉：0.5% OXOID牌YEASTEXTRACT
NaCl:1%
技术琼脂粉（进口）：1.2～1.5% 广东环凯微生物科技有限公司
将上述培养基配比，以水为溶剂，调pH值7.0，灭菌备用。
2.大肠杆菌（ATCC25922）培养液制备：
2.1 菌液制备：将大肠杆菌（ATCC25922）先接种在营养平板上，35～37℃培养16～24h。将培养后营养平板上的单菌落（5~6个）接种至50ml的无菌LB 液体培养基中，置于摇床（转速220rpm）培养，培养温度：30度，培养时间：10—12h。置4℃冰箱中贮存备用（菌液贮存时间不得超过3天）
2.2测试菌的配制：将上述测试菌培养液放置于常温后，置分光光度计于600nm处测吸光值至2.3，如高于此吸光值，可用培养液调整测试菌液吸光值至
2.3。
3.检测培养基制备：
3.1将灭菌后的LB培养基置室温使其冷却至48-50°C，按100ml无菌LB培养基中加入100ul菌液（OD=2.3），摇匀。吸取含测试菌的LB培养基10.5ml，置90mm碟底内均匀摊布，使其在水平台面上凝固，凝固后放置20分钟后盖好陶瓦盖，备用。
4.样品制备：
4.2精密称定待测的试样1.0000 g，精密加入灭菌水10mL，40℃超声水浴15分钟使溶解。放至室温，吸取适量上述溶液于具塞灭菌离心管中，10000 rpm 离心5分钟，取上清液，过0.4微米除菌膜，作供试样品溶液。
4.3在上述3.1项制备好的检测培养基上用灭菌的打孔器（2.7 mm）打孔，记录每孔的号码（1-5号），每孔中分别加入5 μL 的富力泰C测试样品溶液。
盖好陶瓦盖，置在37°C培养箱中培养16至20小时后，用多功能微生物分析测量仪测定抑菌圈直径，取平均值。
注：肽生素检定方法同富力泰C，恩拉霉素检定参考资料兽药典。
抗生素的种类和作用机理 一抗生素的定义： 抗生素（英语：antibiotic）在定义上是一较广的概念，包括抗细菌药、抗真菌药（anti-fungal medication）以及对付其他微小病原之药物；但临床实务中，抗生素常常是指抗细菌药 二抗生素的种类： 由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体不同的抗生素药物或其它活性的一类物质。自1943年以来，青霉素应用于临床，现抗生素的种类已达几千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类有以下几种： (一)β-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有β-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类(thienamycins)、单内酰环类(monobactams)，β-内酰酶抑制剂 (β-lactamadeinhibitors)、甲氧青霉素类(methoxypeniciuins)等。 (二)氨基糖苷类：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。 (三)四环素类：包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。 (四)氯霉素类：包括氯霉素、甲砜霉素等。 (五)大环内脂类：临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等、阿奇霉素。 (六)糖肽类抗生素：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁，后者在抗菌活性、药代特性及安全性方面均优于前两者。 (七)喹诺酮类：包括诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、加替沙星等。 (八)硝基咪唑类：包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等。 (九)作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。 (十)作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、杆菌肽等. (十一)抗真菌抗生素：分为棘白菌素类、多烯类、嘧啶类、作用于真菌细胞膜上麦角甾醇的抗真菌药物、烯丙胺类、氮唑类。 (十二)抗肿瘤抗生素：如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。 (十三)抗结核菌类：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺等。 (十四)具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。 三抗生素的作用机理 抗生素等抗菌剂的抑菌或杀菌作用，主要是针对“细菌有而人（或其它高等动植物）没有”的机制进行杀伤，有4大类作用机理： 1）阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下溶胀破裂死亡，以这种方式作用的抗生素主要是β-内酰胺类抗生素。哺乳动物的细胞没有细胞壁，不受这类药物的影响。 2）与细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌肽等。
多肽类抗生素：具有多肽结构特征，其包括多粘菌素类（多粘菌素B、多粘菌素E）、杆菌肽类（杆菌肽、短杆菌肽）和万古霉素。 具有多肽结构特征的一类抗生素。包括多粘菌素类（多粘菌素B、多粘菌素E）、杆菌肽类（杆菌肽、短杆菌肽）和万古霉素 多粘菌素类：大多数革兰氏阴性杆菌有较好抗菌作用，对革兰氏阳性菌无效 杆菌肽及短杆菌肽：均是由肽链连结的氨基酸组成，两种抗生素对大部分革兰氏阳性细菌有高度抗菌活性；对革兰氏阴性杆菌则完全无效；为这两种抗生素均有严重肾脏毒性 万古霉素：对革兰氏阳性菌具有强大的抗菌作用 多肽类抗生素属杀菌剂，其抗菌谱窄，但具独特的抗菌作用，且细菌一般不易产生耐药性，长期用于敏感菌所致的感染包括严重感染、院内感染、耐药菌感染、免疫缺陷者感染其疗效确切，是抗感染疗法的重要药物。然而，大多数品种的毒性较突出，尤以肾毒性为显著，故临床适应证严格，一般不作为首选药。 多肽类药物的优势是：它属于蛋白类药物，来源于自然，生物活性高，在人体内不结存，无副作用。其劣势是在体内降解快，稳定性低，给药途径有限制，水溶性较差，生产成本高。多肽类抗生素具有抗菌、抗肿瘤、促进创伤面愈合等多种生物学特性，尤其是替代广谱高效抗菌医药的开发潜力巨大。
多肽类抗生素从多粘杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得。常用的多肽类抗生素有多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽（枯草菌肽）、万古霉紊（凡可霉素）等。 多肽类抗生素中，不同的抗生素所具有的抗菌作用不同，可分别对抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染，对败血症、呼吸道感染、泌尿道感染、牛乳腺炎等疾病有较好的治疗作用。小剂量时抑菌，大剂量时杀菌。多肽类抗生素的作用机理也各不相同，多粘菌素类可改变细菌胞浆膜的功能，而杆菌肽则作用于细胞壁和细胞质。多肽类抗生素的最大优点是细菌不易产生耐药性，但缺点为毒性较大，除对细菌细胞膜损伤外，对动物细胞膜也起作用，主要对肾、神经系统有一定毒性。 下面介绍几种常用的多肽类抗生素的使用方法： （1）硫酸多粘菌素B：本品为白色或淡黄色粉末，无臭或带有微臭。易溶于水，在PH值为5．7～7．5时的水溶液最稳定，在碱性液中不稳定。主要对革兰氏阴性杆菌有较强的杀伤作用，临床上主要用于绿脓杆菌等敏感菌引起的肺部、泌尿系统感染及败血症等病症。用法用量为：肌内注射，一日量，每1公斤体重马、牛、猪、羊1万单位，分2次注射；牛乳室灌注每乳室5～10万单位；牛子宫灌注10万单位。 应注意按兽医推荐剂量使用，否则使用剂量较大可引起肾脏损害及神经系统功能紊乱等。另本类抗生素内服不吸收，不能用于全身感染。肌内注射也吸收不良。 （2）硫酸多粘菌素E（硫酸粘菌素、硫酸抗敌素）：本品为白色或微黄色粉末，微臭，味苦，易溶于水，在酸性溶液中稳定。本品对大多数革兰氏阴性杆菌有较强的抗菌作用，特别是对绿脓杆菌作用效果更为显著，主要用于绿脓杆菌、大肠杆菌引起的呼吸道感染、泌尿系统感染、败血症等病症，细菌一般对本品不产生耐药性，但本品与多粘菌素B之间有交叉耐药性。使用方法和剂量为：肌肉注射，一日量，每1公斤体重马、牛、猪、羊1万单位，分2次注射。 本品不宜与氨基甙类抗生素联用，因联用可导致神经系统中毒而产生肌无力和呼吸暂停的危险；不宜与磺胺嘧啶钠、碳酸氢钠、氢化可的松、细胞色素C、氯霉素等配伍，以免产生沉淀或降效。 （3）杆菌肽：是由一种苔藓样杆菌所产生的多肽类抗生素。为白色或淡黄色粉末，无臭或微臭，味苦，有吸湿性。易溶于水，但水溶液在室温很快变质失效。故加锌使成杆菌肽锌，并制成1克中含杆菌肽锌100毫克（4000单位）或1克中含杆菌肽锌150毫克（6000
临床常用抗生素分类及化学名、商品名 β-内酰胺类（β-lactams）抗生素：包括青霉素类、头孢菌素类和非典型类。 （一）青霉素类 １.阿莫西林（Amoxicillin）：即羟氨苄青霉素，商品名：“阿莫仙”、“阿莫灵”、“弗莱莫星”。 ２.哌拉西林（Piperacillin）：氧哌嗪青霉素。 ３.替卡西林（Ticarcillin）：羧噻吩青霉素钠，是羧苄青霉素的替代药。 ４.阿洛西林（Azlocillin）：苯咪唑类广谱半合成青霉素新品，商品名：“阿乐欣”。 ５.美洛西林（Mezlocillin）：商品名：“天林”。 ６.β-内酰胺酶抑制剂：克拉维酸（Clavulanic acid）——棒酸；舒巴坦（Sulbactam）——青霉烷砜；三唑巴坦（Tazobactam）——他唑巴坦。 ７.奥格门汀（Augmentin）：阿莫西林／克拉维酸，商品名：“安灭菌”、“力百汀”、“安奇”。 ８.泰门汀（Timentin）：替卡西林／克拉维酸，商品名：“特美汀”。 ９.优立新（Unasyn）：氨苄西林／舒巴坦。 10.克菌（Copliscan）：阿莫西林／双氯西林，同类产品：新灭菌（Biflocin）。 11.他唑西林（Tazocillin）：哌拉西林／三唑巴坦，商品名：“特治星”、“海他欣”。 （二）头孢菌素类 一代头孢 1.头孢唑啉（Cefazolin）：先锋Ⅴ。 2.头孢拉定（Cephradine）：先锋Ⅵ，商品名：“泛捷复”（Velosef）。 3.头孢噻吩(Cefinase)： 二代头孢 1.头孢呋辛（Cefuroxime）：又名头孢呋肟，商品名：“西力欣”（Zinacef）、“力复乐”。 2.头孢克罗（Cefaclor）：商品名：“希刻劳”（Ceclor）、“可福乐”（Keflor），为口服药。 3.头孢替安（Cefotiam）：商品名：“泛可博林”。 4.头孢丙烯（Cefprozil）：商品名：“施复捷”（Cefzil）。 三代头孢 1.头孢噻肟（Cefotaxime）：商品名：“头孢氨噻肟钠”、“泰可欣”（Taxime）、“凯福隆”（Clafolan） 2.头孢曲松（Ceferiaxone）：又名头孢三嗪，商品名：“罗氏芬”(Rocephin)。
多 肽 类 抗 生 素 的 进 展 和 应 用 学院：专业：姓名：学号:
多肽类抗生素的研究进展及其应用 摘要多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽, 一般具有抗细菌或真菌的作用。按照化学结构的不同, 多肽抗生素可分为5 类: 具有螺旋结构的线性多肽;富含某种氨基酸的线性多肽; 含有一个二硫键的多肽; 含有两个或两个以上二硫键的多肽; 羊毛硫抗生素。根据作用机理的不同, 多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。多种动物的免疫系统中都含有多肽抗生素。这些多肽抗生素具有广泛的抗菌谱多肽。抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面, 并且有着很大的发展潜力。 关键词：多肽抗生素; 自然免疫; 研究进展败血症裂解肽; 作用机理 ABSTRACT As for the μopioid receptor, there are some disputes about the domains involved in the selective recognition of ligands, the relative spatial orientation of the amino acids within the T M affect the affinities of selective lig ands. Regulation of opioid receptor activities does not appear to involve in their ability to promote the association of GTP onto the G proteins and the subsequent dissociation of heterotrimers. It is not very clear if phosphorylation correlates with agonist- induced receptor desensitization. The celluar processing of μ opioid receptors requires
实验五药物的体外抗菌试验 药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。 药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。 药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。 （一）稀释法（结果示教） 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。 （二）琼脂扩散法 它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。 滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作 滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。 至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，
微量肉汤稀释法（borth microdilution method） 实验方法： 1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储 备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液， 4 ?C下保存备用。 2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管 中的MH肉汤，37 ?C，180 r/min过夜培养。将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 μL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 μLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。37 ?C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍） 3.最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以 上细菌生长的最小肽浓度。用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC 的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。 4.最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残 余菌落生长的肽的最低浓度。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 μL涂布到MH琼脂平板上，37 ?C培养18 h，以此来确定肽的MBC。 参考文献： 【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273. 抗菌肽的体外抑菌实验（平板法） 1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同 样做6个浓度的稀释 2.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10^6 CFU/mL
大环内酯类、林可霉素类及多肽类抗生素 一、大环内酯类抗生素 红霉素(erythromycin) 麦迪霉素(medecamycin) 吉他霉素(kitasamycin) 交沙霉素(josamycin) 乙酰螺旋霉素(acetylspiramycin) 阿奇霉素(azithromycin) 罗红霉素(roxithromycin) 克拉霉素(clarithromycin) 1、抗菌作用：抗菌谱较广（与青霉素比），为抑菌药 作用机制：大环内酯类抗生素能与细菌核蛋白体的50s亚基结合，抑制转肽作用和抑制信息核糖核酸（mRNA）的移位，从而阻碍了细菌的蛋白质合成而起到抑菌的作用。 2、体内过程：与青霉素G大致相似。 ①剂型：红霉素（erythromycin）在酸性条件下易被破坏，碱性条件下抗菌作用增强， 为避免口服时受胃酸的破坏，而制成肠溶片或包肠溶膜或制成酯类及酯化合物的盐类，如红霉素肠溶片等和可供静脉滴注的乳糖酸红霉素（erythromycin lactobionate）等。 ②分布：广泛分布至各种组织与体液中，可通过胎盘屏障，但难以透过血脑屏障。 ③代谢与排泄：经肝脏代谢，经胆汁排泄，存在肝肠循环，仅少量经肾排泄。 3、耐药性：同类不完全交叉耐药，与 -内酰胺类无交叉耐药。 细菌耐药机制： 1）产生灭活酶 2）靶位结构的改变 3）细菌对药物通透性下降是耐药的主要原因 4、临床应用：呼吸道感染(替代)、软组织感染 ①主要用于耐青霉素的轻、中度金葡菌感染及对青霉素过敏的患者，但作用不及青霉素， 而且易产生耐药性，但停药数月后，细菌又可恢复对其的敏感性。 ②用于其他G+球菌如肺炎球菌所致的大叶肺炎，溶血性链球菌引起的扁桃体炎、猩红 热、丹毒、急性中耳炎或鼻窦炎。 ③可作为治疗军团菌病、弯曲杆菌所致败血症或肠炎、支原体肺炎、沙眼衣原体所致的 婴儿肺炎及结肠炎、白喉带菌者的首选药； ④替代青霉素治疗炭疽、气性坏疽、放线菌病、梅毒等。 5、不良反应：毒性低，不良反应少见。 ①口服引起胃肠道不良反应，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。 ②静注引起血栓性静脉炎。 ③引起肝损。 ④口服引起伪膜性肠炎。 红霉素(erythromycin) 代表药 ①不耐酸、口服需用肠溶片及酯类化合物 ②广泛分布于组织、体液中 ③难通过血脑屏障临床应用：呼吸道感染、软组织感染幽门螺杆菌肠炎、支原体肺炎 ④不良反应：局部刺激性、肝损害、伪膜性肠炎 ⑤主要经肝代谢，胆汁排泄 新一代大环内酯类特点
一抗生素的定义： 抗生素（英语：antibiotic）在定义上是一较广的概念，包括抗细菌药、抗真菌药（anti-fungal medication）以及对付其他微小病原之药物；但临床实务中，抗生素常常是指抗细菌药 二抗生素的种类： 由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体不同的抗生素药物或其它活性的一类物质。自1943年以来，青霉素应用于临床，现抗生素的种类已达几千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类有以下几种： (一)β-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有β-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类(thienamycins)、单内酰环类(monobactams)，β-内酰酶抑制剂 (β-lactamadeinhibitors)、甲氧青霉素类(methoxypeniciuins)等。 (二)氨基糖苷类：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。 (三)四环素类：包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。 (四)氯霉素类：包括氯霉素、甲砜霉素等。 (五)大环内脂类：临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等、阿奇霉素。 (六)糖肽类抗生素：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁，后者在抗菌活性、药代特性及安全性方面均优于前两者。 (七)喹诺酮类：包括诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、加替沙星等。 (八)硝基咪唑类：包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等。 (九)作用于G-菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。 (十)作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、杆菌肽等. (十一)抗真菌抗生素：分为棘白菌素类、多烯类、嘧啶类、作用于真菌细胞膜上麦角甾醇的抗真菌药物、烯丙胺类、氮唑类。 (十二)抗肿瘤抗生素：如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。
第十九章 药物的体外抗菌试验 教学要求 .（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。 .（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。 .（三）了解体外抗菌试验的影响因素。 第一节 常用的体外抑菌试验 一、药物的体外抗菌试验 .又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。 .最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 .优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。 .缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌 .细菌、霉菌和酵母菌常用 .标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。 .临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。控制培养时间。 .接种菌量的多少的计算培养基 .根据试验菌的营养要求进行选择 .培养基质量控制供试药物 .药物的浓度和总量要精确配制 .供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。 .中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验 .试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长 .已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。 .溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用 （一）连续稀释法 .方法：液体法和固体法。 .用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。 .抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长 .杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。 1、液体培养基稀释法 .方法：两倍稀释法 .步骤： 液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每 管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。 液体稀释法图解 抗菌药物的浓度增加最低抑菌浓度移种平板
6 脂肽抗生素的研究概况 脂肽（Lipopeptide）又名脂酰肽（Acylpeptide），是一类重要的抗菌肽，主要来源于一些由细菌、酵母菌、真菌分泌的代谢产物，其种类繁多、结构复杂，是一类由脂肪链和肽链组成的具有两亲结构的微生物次级代谢产物（Kosaric，1987）。脂肽一般来源于植物、动物和微生物，但大多数脂肽来源于微生物，而其中又以来源于细菌的脂肽居多。在细菌中，脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物。1968年，Arima等首次从枯草芽孢杆菌株发现脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素（surfactin）（Arima，1968）。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素（surfactin）、芬荠素（Fengycin）、伊枯草菌素（iturin）、和杆菌霉素（Bacillomycin），抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、制磷脂菌素（plipstatin）等。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性（Stein，2005）。脂肽在环境治理，医药、微生物采油等领域有重要的应用前景（Jitemdra，1997；Banat，2003）。 6.1 脂肽抗生素的种类及结构特性 芽孢杆菌产生的抗菌脂脂肽的分子结构由脂肪酸链和肽链两部分组成，分子中的多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，β-羟基或者氨基脂肪酸的烃链形成亲油基，即是具两亲性的生物表面活性剂。其中亲水的氨基酸通过肽键相互连接，再与脂肪烃链上的羧基和β-羟基或者氨基结合形成环状，因此，抗菌脂肽一般是以内脂或者酰胺键结合而成的环脂肽（刘向阳，2005；吕应年，2005；Wang，2004）。芽孢杆菌脂肽抗生素主要包括表面活性素（Surfactin），伊枯草菌素（Iturin），芬荠素（Fengycin）三大类。 6.1.1 表面活性素（Surfactin） Surfactin类群的脂肪酸的碳链长度在13~16个，具有LLDLLDL的手性七肽通过一内酯键与脂肪酸链碳原子的β-羟基基相连，其在水溶液中分子成“马鞍状”构像，该家族成员包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素（Surfactin），地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素（Llichenyishin），短小芽孢杆菌的表面活性剂（Pumilacidin）、埃斯波素（Esperin），其中Liehenyishin、Pumilacidin、Esperin 主要应用于工业和环境治理（Meiji et al.，1969.；Yakimo et al.，1995；Naruse et al.，1990）。而Surfactin是一种脂肽类抗菌物质，它是由β-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和脂肪酸的β-羟基缩合形成
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》 专业班级： 学号： 姓名： 小组成员： 实验日期：5月27日-5月30日 微生物综合实验
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验 班级16级生物技术1、2班姓名 学号座位号 实验日程安排 日期开始时间实验内容备注 5月27日（周一）14:30-15:30 实验背景、原理、方法 讲解 15:30-18:00 分组准备试剂、培养基、 实验器具 5月28日（周二） 上午 8:00-8:30 体内抑菌实验细菌接 种、培养 8:30-10:30 体外抑菌实验：MIC法 10:30-11:40 固体培养基的配制、体 外抑菌实验：纸片法、 5月28日（周二） 下午12:30-13:30 体内抑菌实验：4小时 实验组稀释涂布 5月28日（周二） 晚上20:00-21:00 体内抑菌实验：12小时 实验组稀释涂布 5月29日（周三） 上午10:00-12:00 体内抑菌实验：24小时 实验组稀释涂布； 体外抑菌实验：纸片法、 MIC法结果观察，分析； 5月30日（周四） 上午8:30-12:00 体内抑菌实验：4小时、 12小时、24小时实验组 结果观察、分析； 所有实验结果的统计与 讨论 抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
一、实验原理 抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。 药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。 琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。 世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如： 复方新诺明（SXT）左氧氟沙 星（LEV） 庆大霉 素（CN） 苯唑西 林（OXA） 氯霉素 （CM） MIC ug/ml 敏感（S）≤2/38 ≤1 ≤4 ≤2 ≤8 中度敏感（I）-- 2 8 -- 16 耐药（R）≥4/76 ≥4 ≥16 ≥4 ≥32
实验六、抗菌药物的体外药效试验 （药敏试验） 各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。 ［目的要求］ 1、熟悉体外抗菌试验操作技术。 2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。 ［实验原理］ 常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。 1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。革兰氏阴性球菌如淋球菌等。革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。 2、培养基：选MH(Muelkr-Hintop)培养基。链球菌、流感杆菌需接种到巧克力琼脂平板或加5％羊血。淋球菌接种到哥伦比亚培养基上。
糖肽类抗生素 糖肽类抗生素糖肽类抗生素主要有万古霉素、去甲万古霉素和替考拉宁。万古霉素是由东方链霉菌培养液中所得的一种无定形糖肽类抗生素而去甲万古霉素和替考拉宁是由放线菌所产生的一类糖肽类抗生素。常用糖肽类抗生素品名剂型规格万古霉素胶囊针剂 20mg0.25 0.51.0 去甲万古霉素针剂 0.4相当于万古霉素0.5 替考拉宁针剂 0.20.4 注射用万古霉素药理作用万古霉素是由东方链霉菌菌株产生的一种糖肽类窄谱抗生素。主要敏感菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌包括耐甲氧西林菌株、化脓性链球菌、肺炎链球菌、厌氧链球菌、草绿色链球菌、棒状杆菌、梭状芽胞杆菌对难辨梭状芽胞杆菌高度敏感、放线菌、肠球菌、淋球菌、粪链球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等。在体外试验中对本品敏感的菌株有单核细胞增多性李斯特氏菌、乳杆菌属、放线菌属、梭状杆菌属及杆菌属。对多数革兰阴性杆菌、分支杆菌或真菌、立克次体、衣原体等无效。体外试验显示本品与氨基苷类抗生素合用对肠球菌有协同抗菌作用。药代动力学本品口服不吸收肌肉注射可引起局部疼痛静脉注射后可广泛分布至全身大多数组织和体液内在血清、胸腔液、心包液、腹水、滑膜液、尿液、腹膜透析液和心房组织中可达到有效杀菌浓度但在胆汁中不能达到有效浓度。不易穿过正常血脑屏障进入脑脊液中当脑膜炎症时可渗入脑脊液并达到有效治疗浓度。本品也可通过胎盘。T1/2成人约6h411h小儿23h。给药量的8090在24h内由肾小球滤过经尿以原形排出少量经胆汁排泄。肾功能不全时T1/2延长。适应症本品静脉滴注主要用于治疗对甲氧西林耐药的葡萄球菌引起的感染对青霉素过敏的患者及不能使用其他抗生素包括青霉素、头孢菌素类或使用后治疗无效的葡萄球菌、肠球菌和棒状杆菌、类白喉杆菌属等感染患者如心内膜炎、骨髓炎、败血症或软组织感染等。也可用于防治血液透析患者发生的葡萄球菌属所致的动、静脉血分流感染。本品口服用于治疗甲硝唑无效的由于长期服
文章编号:1001-8689(2007)05-0263-05 第二代糖肽类抗生素的研究进展 尚新艳1 阮丽军2,3 许激扬 1,* 陈代杰 2,3 (1中国药科大学生命科学与技术学院, 南京210009; 2上海医药工业研究院, 上海200040; 3上海来益生物药物研究开发中心, 上海201203) 摘要: 随着细菌耐药的不断升级,耐万古霉素肠球菌、高度耐糖肽类抗生素的金葡菌的出现,给临床抗感染治疗带来极大困难。开发新型糖肽类抗生素刻不容缓。人们对万古霉素等天然糖肽类抗生素进行化学修饰,得到了一系列有价值的衍生物,其中oritavancin 、dalbav ancin 和telavancin 已进入Ⅲ期临床和新药注册。本文对第二代糖肽类抗生素的结构特征、药效学与药动学特征以及临床应用作一综述。 关键词: 第二代糖肽类抗生素; O ritav ancin; Dalbavancin; T elav ancin 中图分类号:R978.1 文献标识码:A Advance of research on the second generation of glycopeptide antibiotics Shang Xin-y an 1, Ruan Li-jun 2,3 Xu Ji-yang 1 and Chen Dai-jie 2,3 (1Depar tment o f Biological Science and Biotechnolo gy ,China Pharmaceutical U niversity , Nanjing 210009; 2Shang hai Institute of Phar macuetical Indust ry , Shang hai 200040;3Health Cr eat ion Center for Biopharm aceutical R&D, Shang hai 201203) ABSTRACT Developm ent of resistance to antibacterial agents,especially the advent of vancomy cin-resistant Enterococcus (VRE)and glycopeptide-resistant Stap hy lococcus aureus (GRSA)is a mounting problem that continues to compromise the clinical effectiveness of anti -infectious drugs .It is essential to develop new glycopeptide antibi-otics .Three of these new derivatives obtained by sem i -synthesis starting from natural compounds ,are now in clinical development (oritavancin and telavancin,as derivatives of vancom ycin;and dalbavancin,as a derivative of te-icoplanin).T he review focuses on the structures,pharmacokinetic and pharmacody namic parameters and the clinical research status related to the second -generation glycopeptide antibiotics . KEY WORDS The second-generation g lycopeptide antibiotics; Oritavancin; Dalbavancin; T elavancin 收稿日期:2006-03-14 修回日期:2006-07-12 作者简介:尚新艳,女,生于1979年,在读硕士研究生。 *通讯作者,E-mail:jiyangx@https://www.doczj.com/doc/b618773510.html, 自从青霉素被发现并用于临床后,抗生素为人类解除细菌性感染发挥了巨大的作用。当抗生素第一次被临床使用后,耐药性问题逐渐成为人们关注的热点,它对人类生命健康所构成的威胁绝不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病。万古霉素和替考拉宁这两个重要的糖肽类抗生素诞生之初,缓解了耐药细菌的问题,人们称它们为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。但随着在临床上耐万古霉素肠球菌(VRE)、对万古霉素中度敏感的金葡菌(VISA )以及耐万古霉素金 葡菌(VRSA )的出现,这道防线也渐渐趋于瓦解。人们必须重视细菌耐药性的升级,并不断寻找开发一系列新的糖肽类抗生素及其衍生物。 1 第二代糖肽类抗生素的开发背景 第一代糖肽类抗生素直接来源于微生物的代谢产物,20世纪50年代开始发展起来。万古霉素于1956年被发现[1] ,但由于其纯度问题、抗菌谱窄(仅针对革兰阳性菌和部分厌氧菌),市场需求不大。当耐甲氧西林金葡菌(M RSA )成为导致社区、医院内严重细菌感 ? 263?中国抗生素杂志2007年5月第32卷第5期
肽类生产单位 1.滨海吉尔多肽(20160343) 原料药(醋酸艾塞那肽、醋酸亮丙瑞林、醋酸特利加压素、醋酸兰瑞肽)*** 2.中肽生化(浙HaT20050090) 原料药胸腺五肽 3.南海朗肽制药(粤20160221)外用重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子外用溶液 4.中肽生化(浙20050090)原料药(醋酸亮丙瑞林) 5.大得利制药(甘20110116) 原料药（抑肽酶、绒促性素、胸腺肽溶液、胸腺五肽、生长抑素 6.豪逸明制药(沪20110064) 原料药（鲑降钙素、胸腺五肽、醋酸奥曲肽、生长抑素、胸腺法新、特利加压素、缩宫素、依替巴肽、比伐卢定） 7.雅赛利（）制药(浙20080495) 盐酸万古霉素，杆菌肽，杆菌肽锌 8.凯博生物化学技术(甘20110097)原料药（胸腺五肽、生长抑素）* 9.林叶生物科技(沪20110074) 原料药（糜蛋白酶、胰激肽原酶） 10.百年汉克制药(20110283) 原料药（人参糖肽）* 11.丹生生物制药(辽20100175)原料药（氨肽素）* 12.靖江市欣源医药科技(20120458)原料药（云芝糖肽、洛伐他汀） 13.生物化学制药厂(浙20000342)原料药（氨肽素、硫酸软骨素）* 14.大得利生物化学制药(厂) (甘20110025)原料药（抑肽酶、绒促性素、胸腺五肽、生长抑素）* 15.金城钟化生物药业(鲁20100350) 原料药（谷胱甘肽）*原料药（甲磺酸伊马替尼）* 16.亨通光华制药(陕20110030)
17.华津药业股份(浙20000050) 原料药(胰酶、脑蛋白水解物、促肝细胞生长素溶液、转移因子溶液、胸腺肽溶液、肌氨肽苷、肝水解肽、核糖核酸)*** 18.天马医药集团天吉生物制药(20160186) 原料药(醋酸奥曲肽、胸腺法新、比伐卢丁、醋酸兰瑞肽、醋酸西曲瑞克、特立帕肽、利拉鲁肽、利那洛肽、卡贝缩宫素、醋酸曲普瑞林、醋酸去氨加压素、醋酸特利加压素)*** 19.圣诺生物制药(川20160288) 原料药(左西孟旦、胸腺法新、恩夫韦肽、胸腺五肽、醋酸奥曲肽、生长抑素、醋酸特利加压素、醋酸阿托西班、恩替卡韦、比伐卢定、艾塞那肽、齐考诺肽、奈西立肽、卡贝缩宫素、依非巴特、利拉鲁肽、格拉替雷、加尼瑞克、醋酸去氨加压素、曲普瑞林、亮丙瑞林、戈舍瑞林、缩宫素、胰高血糖素), 20.星银药业集团(20160031) 原料药（醋酸阿托西班、卡贝缩宫素、醋酸去氨加压素、特利加压素、胸腺法新、鲑鱼降钙素、生长抑素、醋酸兰瑞肽、比伐卢定、醋酸普兰林肽、艾塞那肽、伐普肽、西曲瑞克、缩宫素、缩宫素溶液、利拉鲁肽、醋酸卡泊芬净、醋酸阿肽地尔、米卡芬净钠、醋酸亮丙瑞林、特利帕肽、醋酸奥曲肽、醋酸戈舍瑞林、依替巴肽、间甲酚、苯酚、醋酸地加瑞克、利那洛肽 21.诺泰生物制药股份(20160318) 原料药(比伐卢定、依替巴肽、胸腺法新、醋酸奥曲肽、醋酸兰瑞肽、盐酸决奈达隆、阿戈美拉汀)*** 22.中鑫东泰（莱阳）纳米基因生物技术(鲁20120415) 原料药(降纤酶、科博肽)*** 23.源生生物药业(川20100360) 原料药（紫杉肽） 24.希力药业(鲁20160241) 原料药(胰激肽原酶、弹性酶)*** 25.恒新药业(20160472) 原料药(脑蛋白水解物、硫酸软骨素钠、硫酸软骨素钠(供注射用)、氨肽素) 26.丹生生物制药(辽20150141)原料药(氨肽素), 27.百益制药有限责任公司(吉20160263) 原料药(艾塞那肽)*** 28.欣泰药业(豫20100222) 原料药（奥扎格雷、硫普罗宁、胸腺五肽、吗替麦考酚酯、伏格列波糖、科博肽、马来酸桂哌齐特）29.百草堂药业(20160429)
天然植物体外抑菌实验 中国中学：陆思怡尹意添陈玺梁栋指导老师： 摘要： 我国是一个农业大国，随着化学农药和化肥的大量不科学使用．很多弊端突出，在这种情况下，植物源农药悄然兴起。因此，本课题开始研究天然植物提取物的抑菌效果。课题采用，苹果，姜，大蒜进行汁液提取，抗生素溶解，使用大肠杆菌作为样品进行实验。经数据研究分析，抗生素具有明显抑菌作用，且这四种提取物所表现的抑制作用随浓度的增大而提高。但由于实验中出现的误差及实验材料的不完备，致使实验结果与预测有偏差。苹果，清水，蒜，姜均对大肠杆菌有一定抑制作用。其中蒜溶液的抑菌作用大于其他溶液，但相对于抗生素效果较弱。 关键词大肠杆菌抑菌试验天然植物提取液 前言 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。我国是一个农业大国。毋容置疑，农药、化肥对于从根本上解决我国人口温饱问题和促进农业经济的腾飞功不可没。但是，随着化学农药和化肥的大量不科学使用．很多弊端突出，如有害生物的抗药性、对环境的污染和生态系统的破坏等已成为当前应用农药的主要问题。在这种情况下，植物源农药悄然兴起，因其与环境兼容性好、高效、低毒、低残留，并且对有害生物的选择压力小．目前已成为农药研究开发领域的热门之一。因此，本课题探究的是天然植物源对于微生物的抑菌效果。为此，我们选用了清水，苹果，姜蒜和抗生素进行对大肠杆菌的抑菌试验。 研究方法和过程： 实验法：
1.实验材料 苹果、姜、蒜、大肠杆菌群落、清水、头孢药片 2.实验器材 培养皿、量筒、研钵、玻璃棒、烧杯、胶头滴管、滤纸、漏斗、移液管、酒精灯、涂布棒、镊子、接种环 实验步骤： 1.制作液体培养基（酵母菌提取物：0.50g 蛋白胨：1.06g 氯化钠：1.00g 水：100ml） 制作固体培养基（酵母菌提取物：0.55g 蛋白胨：1.00g 氯化钠：1.00g 琼脂：2.00g 水：100ml ）并调节PH值（弱碱性） 2.将固体、液体培养基进行高温蒸汽灭菌（121.3摄氏度 1.05kg/cm^2 20分钟） 3.将固体培养基倒入培养皿，制作培养基平板，静置16个小时 4.将接种环加热杀菌，待冷却后，用其刮取挂肠杆菌菌落，加入液体培养基内，放入恒温 摇床中，4小时 5.将苹果，蒜，姜放入研钵中进行研磨，获取苹果、姜、蒜汁液，并过滤。 6.将抗生素加水溶解，制成溶液，另取50ml清水。 7.制作抑菌纸片24片（圆形，直径8mm，滤纸），将抑菌纸片（12片）浸入过滤后的橙 皮橙肉溶液，将6片抑菌纸片浸入清水，同样6片浸入头孢溶液，静置1小时，后取出风干（斜置于干净培养皿中，不可直接粘贴在培养皿中） 8.将培养好的大肠杆菌液体培养基取出，带入无菌操作室中进行固体培养基大肠杆菌种 植，用移液管取1ml液体培养基加入培养基平板，涂布棒垂直均匀涂抹培养基平板。9.取已风干的完好的橙汁、橙皮、头孢溶液和清水的抑菌纸片（各3片），轻放于固体培 养基之上（每片抑菌纸片之间的间隔为2~3cm） 10.将已放入抑菌纸片的固体培养基放入人工气候箱（37摄氏度湿度24）培植大肠杆菌 静置16~24h 11.测量抑菌圈直径，并对结果进行数据分析