酸性α醋酸萘酯酶染色法
来源：生物学实验中心发布时间：2010-04-04 查看次数：1597
一、原理
淋巴细胞内含有许多种酶，如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthy l acetate esterase，ANAE)，在弱酸性条件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法可作为鉴别T 淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。
二、材料和方法
(一) 材料
1 25%戊二醛溶液(固定液)在01mol/L pH值74磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。
2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。
3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。
4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。
5 α醋酸萘酯溶液：
α醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。
6 0067(1/15)mol/L pH值76磷酸盐缓冲液：
甲液KH2PO4 908g加蒸馏水至1，000ml
乙液Na2HPO4 974g加蒸馏水至1，000ml。(如为Na
2HPO
4
?12H2O则称取23 22g)
取甲液13ml，加入乙液87ml，即为0067mol/L pH值76磷酸盐缓冲液。
7 反应液
0067mol/L pH值76磷酸盐缓冲液89ml 六偶氮副品红 6ml(缓慢加入) α醋酸萘酯液25ml(缓慢加入)
8 甲基绿染色液充分混匀，调pH值58～60，临用前配制。
甲基绿1g 蒸馏水100ml 置37℃溶解，冰箱保存备用。
(二) 方法
1 分离单个核细胞取家兔肝素抗凝血1ml加入Hank s液1ml，加入到含有2m l淋巴细胞分
层液(比重1077±0001)的离心管中，以2 000 r/min离心30min。洗涤后，加少量Hanks液，摇匀。
2 制片取上述细胞悬液1滴，加到洁净玻片上，涂片，自然干燥。
3 固定和染色将制备的细胞涂片用25%戊二醛液4℃固定10min，流水冲洗，待干。将玻片置于反应液内，37℃孵育1h，取出用水冲洗，待干。
4 复染用甲基绿染色液染1min(或瞬时染色)，水洗，吹干。油浸镜下观察计数。
三、结果判定
镜检时，首先要判定是否为淋巴细胞。淋巴细胞经ANAE染色后，可区分为两大类：一类淋巴细胞的胞浆内不见呈色物质，为ANAE阴性细胞；另一类在胞浆中出现棕红色物质，为ANAE阳性细胞。根据呈色物质的形态和分布又分为块状AN AE阳性淋巴细胞和点状ANAE阳性淋巴细胞。ANAE阴性淋巴细胞呈黄绿色，胞浆内无明显着色颗粒。
四、注意事项
1 不同质量的试剂，尤其是偶氮染料对反应产物的颜色、鲜艳程度、颗粒粗细和定位清晰程度等影响很大，应加注意。
2 由于本反应为酶化学反应，反应非常灵敏，各种条件应严格掌握。尤其是试剂的pH值要求准确，需用精密pH试纸或pH计测定。
3 配制反应液时，各溶液混合，必须边摇边缓慢加入，若滴入过快，可出现沉淀，影响染色结果。
4 制片过程中，标本要求尽快固定、干燥和冲洗。若时间过长，可影响酯酶活性。
5 涂片插入染色缸时，要注意必须将标本面与反应液接触，切勿将标本面紧贴缸壁，以免影响染色反应。如片子较多，反应液相对减少，会使阳性率减低。
染色后冲洗不宜过久，防止酶反应产物的红色消减，造成标本观察困难。
α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE 法) 简介： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。每一种酯酶常能水解许多不同的底物，多种不同的酯酶又能水解相同的底物，因此这一系列酯酶被称为非特异性酯酶。非特异性酯酶的最适pH 为5.0～8.0，定位于溶酶体和内质网，在肝脏、肾脏、胰和小肠具有较高的酶活性。单核-吞噬细胞系统的单核巨噬细胞、树突细胞也含有丰富的非特异性酯酶。 Leagene α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE 法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的非特异性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 载玻片、湿盒 2、 显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入α-NAE 固定液固定。 2、 水洗，晾干。 3、 入配制好的α-NAE 孵育液，放入湿盒中，避光孵育，水洗。 4、 入甲基绿染色液复染，水洗，镜检。 编号 名称 DE0038 3×10ml DE0038 3×20ml Storage 试剂(A): NAE 固定液 10ml 20ml RT 避光 试剂(B): α-NAE 孵育液 B1: α-NAE solution 0.2ml 0.4ml 4℃ 避光 B2: FBB solution 5ml 10ml -20℃ 避光 B3: α-NAE buffer 5ml 10ml RT 临用前，B1:B2:B3混合，即为α-NAE 孵育液，即配即用。 试剂(C): 甲基绿染色液 10ml 20ml RT 避光 试剂(D): NaF solution 0.2ml 0.4ml RT 避光 使用说明书 1份
酸性α－乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)使用说明 货号：G2390 规格：3×10ml 保存：有效期6个月。 产品内容： 试剂A：ANAE固定液10ml RT避光 试剂B；ANAE孵化液B1：pararosaniline solution0.05ml4℃避光 B2：Nitrite solution0.05ml4℃避光 B3：α-NAE solution0.5ml4℃避光 B4：ANAE buffer9.5ml4℃避光 临用前，按B1：B2：B3：B4=1：1：10：190充分混合，即为ANAE孵化液，即配即用。注意应先B1：B2=1:1混匀后，再与B3、B4混匀。 试剂C:甲基绿染色液10ml RT避光 试剂D：NaF solution0.2ml RT避光 自备材料： 载玻片、湿盒、显微镜 产品简介： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)酸性α-乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是酸性条件下细胞中的酸性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与六偶氮副品红偶联，生成不溶性红色沉淀，定位于细胞质。酸性α－乙酸萘酚酯酶染色液(ANAE)对酯酶
染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。该染色液仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 操作说明： 1.血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片入ANAE固定液固定10-15min。 2.水洗5min。 3.入配置好的ANAE孵育液，放入湿盒中，室温避光孵育1h，水洗。 4.入甲基绿染色液复染5-15min，水洗，镜检。 染色结果： 细胞质暗红色/棕色 细胞核绿色 氟化钠抑制实验： 按NaF solution：ANAE孵育液=1：25的比例，在ANAE孵育液中加入NaF solution，其余按上述染色法进行。 注意事项： 1.血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。 2.ANAE孵育液易失效或降低阳性程度，即配即用，不宜久置。 3.ANAE孵育液配置后易出现浑浊，但不会影响染色效果。 4.单核细胞为中度阳性至强阳性，对NaF敏感。正常粒细胞呈阴性反应。 5.每次染色时，应有阳性对照。
1.检验原理 盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下分解产生α-萘酚，α-萘酚与六偶氮副品红结合生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称非特异性酯酶染色。 2.主要组成成分 组成主要成分 2.1、固定剂（A液）甲醛 2.2、偶氮溶液（B液）副品红 2.3、亚硝酸钠溶液（C液）亚硝酸钠 2.4、磷酸盐缓冲溶液（D液）磷酸盐 2.5、α-醋酸萘酚溶液（E液）α-醋酸萘酚 2.6、甲基绿溶液（F液）甲基绿 2.7、NaF溶液氟化钠 3.储存条件及有效期 有效期：一年（十二个月）。 储存条件：本试剂盒应储存于2～8℃低温环境。 4.样本要求 新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。 5.检验方法 5.1. 工作液配制： 5.1.1. 浸染工作液配制（一份浸染工作液量为33ml,至少可同时放置8-10张涂片）： 5.1.1.1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟； 5.1.1.2、染缸（自备染液缸）内加入D液30ml; 5.1.1.3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀； 5.1.1.4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀。 B液C液D液E液 NaF液 A染缸1ml 1ml 30ml ml —— B染缸（抑制试验）1ml 1ml 30ml 1ml 40mg 5.1.2. 滴染工作液配制（一份滴染工作液量为1.65ml）； 使用器材：一次性塑料试管、微量移液器、一次性吸嘴、滴管。 操作：于试管内加B液50ul、C液50ul 、混匀，静置1分钟；再加D液1.5ml,E液50ul，混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。 B液C液D液E液 NaF液 A染缸50μl 50μl 1.5ml 50μl —— B管（抑制试管）50μl 50μl 1.5ml 50μl 1滴 注：100Tests中的15mlD液（浓缩缓冲液）用蒸馏水稀释成150ml缓冲液使用。 5.2.染色步骤： 5.2.1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液固定涂片30秒，蒸馏水冲洗，待干编写：杨松钱审核：黄萱批准：白云辉页码：17
酸性α-醋酸萘酚酯酶染色液（ANAE） 预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查 检验原理：盐酸副品红与亚硝酸钠反应生成六偶氮副品红（重氮盐），底物α-醋酸萘酚在酯酶的作用下水解α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成棕红色沉淀，定位于细胞浆中，本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色 主要组成成分： 储存条件及有效期：有效期：一年 储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。 样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血） 检验方法： 一、工作液配制 （一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是33ml,至少可同时放置8-10张涂片） 1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟； 2、染缸（自备染液缸）内加入D液40ml； 3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀 4、再加E液1ml入染缸内，轻轻混匀 （二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是1.65ml） 使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。 操作：于试管内加B液50μL，C液50μL混匀，静置1分钟，再加D液1.5ml，E液50μl,混匀，静置2分钟备用（NaF抑制试验加NaF液1滴）。
二、染色步骤 1、干燥涂片，直接滴加工作液做第二步或滴加A液（用前恢复室温，并充分摇匀）固定 约30-60秒，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干（涂片不固定直接做ANAE染色，阳性反 应强于固定者）； 2、滴加或浸入工作液布满涂片（37℃）孵育分钟，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干 3、F液复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检 参考范围：1.单核细胞系统：呈阳性反应，其反应可被氟化钠抑制。 2.粒细胞系统：各期粒细胞多呈阴性反应，有时少数粒细胞可呈弱阳性反应，其反应不被氟化钠抑制。 3.巨核细胞及血小板为阳性。 4.淋巴细胞多呈点状阳性，部分淋巴细胞及浆细胞为阴性反应。 5.单核细胞源性的组织细胞、巨噬细胞呈强阳性反应，高雪氏细胞、海蓝组织细胞为阳性。 6.幼红细胞呈阴性反应。 检验结果的解释 细胞浆内红色或棕红色颗粒为阳性。①点样型：主要见于成熟T淋巴细胞，阳性反应呈棕色或棕红色1-4个圆形、团块、边界清楚的大点状颗粒定位于细胞浆中。②弥散型：阳性 反应呈棕红色尘粒状、弥散分布，可位于细胞浆的某一局部，边界不清。③单核细胞型：阳性反应为均匀棕红色弥漫性遍布整个细胞浆。 检验方法的局限性 仅限于形态学染色观察使用 注意事项 1、5Tests只限滴染使用
第二单元组化染色 1. 碱性磷酸酶主要存在于 A．幼红细胞 B. 单核细胞 C. 成熟中性粒细胞 D. 嗜碱性粒细胞 E. 淋巴细胞 2．病毒感染时中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分值 A．常为“0” B. 一般大于200分 C. 一般无明显变化或略低 D. 明显增高 E. 常大于100分 3.急性淋巴细胞白血病细胞化学染色正确的是 A .POX(-) B .SB(十) C .PAS(+) D. POX(+) E.NAE(+++) 4.骨髓原始细胞过氧化物酶染色呈阴性反应的是 A急性粒细胞白血病 B急性单核细胞白血病 C急性淋巴细胞白血病 D慢性粒细胞白血病 E慢性粒单核细胞自血病 5.诊断M6常用的细胞化学染色为 A.Pox B.SB C.PAS D. ACP E.a-NBE 6.为了鉴别小原始粒细胞白血病与急淋，下列首选试验是 A.POX染色 B. PAS染色 C. ALP染色 D.ASD NCE染色 E. a-NAE染色 7.正常血细胞POX反应，下述结果错误的是 A.中性粒细胞随细胞的成熟阳性程度逐渐增强 B嗜酸性粒细胞阳性程度最强，嗜碱性粒细胞呈阳性反应 C原单细胞呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弥散状弱阳性反应D淋巴细胞系呈阴性反应 E巨核细胞系呈阴性反应
8.正常情况下，过氧化酶染色(POX)呈弱阳性的细胞是A单核细胞 D淋巴细胞 C幼红细胞 D嗜酸性粒细胞 E巨核细胞 9.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性增高的疾病是 A再生障碍性贫血 B急性粒细胞白血病 C 慢性粒细胞白血病 D急性单核细胞白血病 E骨髓增生异常综合征 10．成熟中性粒细胞过氧化物酶活性减低的疾病是A再生障碍性贫血 B化脓性感染 C急性淋巴细胞白血病 D急性单核细胞白血病 E，慢性淋巴细胞自血瘸 12正常血象中嗜酸性粒细胞过氧化酶反；应呈 A.阴性 B 弱阳性 C强阳性 D 阴性或弱阳性 E弱阳性或阳性 12.正常血象中中性分叶核粒细胞过氧化酶：．反应呈 A.阴性 B.弱阳性 C 阴性或弱阳性 D弱阳性或阳性 E强阳性 13.正常血象中嗜碱性粒细胞过氧化酶反＼应呈 A强阳性 B阴性 C 弱阳性 D阴性或弱阳性 E 弱阳性或阳性 14.异常组织细胞的过氧化酶反应呈 A．阴性 B．阴性或弱阳性 C 弱阳性 D强阳性 E．弱阳性或阳性 15.中性粒细胞碱性磷酸酶积分减低常见于 A．真性红细胞增多症
仅供科研版本号：180110 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色液(CAE法) 【产品组成】 【保存条件】 室温, 4℃，避光，6个月 【产品概述】 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specificesterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色液(CAE法)又称氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)染色液或特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的特异性酯酶将氯乙酸AS-D萘酚水解产生萘酚AS-D，萘酚AS-D再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色有特异性，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的特异性酯酶染色。色该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 【使用方法】 1、新鲜血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入预冷的CAE固定液4℃固定30s。如果固定培养细胞或细胞爬片等，宜采用PFA固定液固定10-20min。 2、水洗1-2min，晾干。 3、入配制好的AS-D孵育液，放入湿盒中，室温(15-25℃)避光孵育30min，水洗。 4、入Lea苏木素染色液复染5～15min，水洗，封片。 【染色结果】 阳性反应呈红色颗粒状，定位于细胞质中。 【注意事项】 1、血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。 2、AS-D孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。 3、AS-D孵育液配制后易出现浑浊，但不会影响染色效果。 4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.doczj.com/doc/bd9338075.html,/ 第1页
实验五：酸性α—醋酸萘酯酶 一、实验目的和要求： 1、掌握酸性α—醋酸萘酯酶实验的原理及在免疫学方面的应用； 2、学会应用该实验方法鉴别不同免疫细胞在不同疾病中的作用。 二、实验内容： 鉴别人和鼠中T、B淋巴细胞。 三、实验步骤： 1、配制试剂。 A液：PH7.6的磷酸盐缓冲液： 甲液：将9.08克的磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中； 乙液：将23.88克十二水合磷酸氢二钾溶于1L蒸馏水中； 取甲液12mL加乙液88mL即成磷酸盐缓冲液。 B液：4%副品红溶液： 将4克副品红溶于100mL2M盐酸内，溶解过滤，4℃保存。 C液：4%亚硝酸钠溶液： 取0.4克亚硝酸钠溶于10mL蒸馏水中，现用现配。 D液：2%醋酸ɑ萘酯液： 取2克醋酸ɑ萘酯，溶于100mL无水丙酮中，溶解后装棕色瓶，4℃保存。 孵育液：将2.4mLC缓慢滴入到2.4mLB中，震荡混匀，静置5min，之后将此溶液加进80mLA液中，混匀，滴入2mLD，调PH5.8-6.0。 1%孔雀石绿染液： 将1克孔雀石绿溶于100mL蒸馏水中，用氯仿处理后4℃保存。 2、血液涂片 取一只小鼠，断尾采血，涂抹于洁净玻片，编号为D，血液层越薄越好，另外手指尖取血涂片，编号D1。 3、孵育和染色 待血液自然干燥后置于孵育液内，37℃孵育90min，水冲洗5min，孔雀
石绿复染1min，流水冲洗，干燥后，制片显微镜观察（用油镜）。4、结果判定 淋巴细胞胞浆内出现大小不等、数量不一的深红色颗粒者为ANAE阳性细胞（T细胞），胞浆内无颗粒者为ANAE阴性细胞（B细胞）。 四、实验结果 2、分析和讨论 人的TB淋巴细胞相对于小鼠的都比较大，但是形态相似，胞浆内呈现大小不一的红色颗粒为T细胞，B细胞，胞核比较搭，几乎占据整个细胞。 五、作业 酸性α—醋酸萘酯酶在兽医临床上有何应用？ 在免疫学方面的应用，检测TB淋巴细胞的活性，鉴别不同免疫细胞在不同疾病中的作用，ANAE测定可作为评价肝细胞损伤、肝纤维化以及肝脏合成功能异常的一项新的血清学指标。
α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE法)操作步骤及染色结果 货号：G1760 有效期：6个月 名称3×10ml3×20ml Storage 试剂(A):NAE固定液10ml20ml RT避光 B1:α-NAE Solution0.2ml0.4ml4℃避光 B2:FBB Solution5ml10ml-20℃避光试剂(B):α-NAE孵育液 B3:α-NAE Buffer5ml10ml RT 临用前，按1:25:25混合，现用现配 试剂(C):甲基绿染色液10ml20ml RT避光试剂(D):NaF solution0.2ml0.4ml RT避光 产品说明： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。α-乙酸萘酚酯酶染色液(α-NAE法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的非特异性酯酶将α-乙酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液。 操作步骤(仅供参考)： 1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入α-NAE固定液固定10-15min。 2、水洗5min，晾干。 3、入配制好的α-NAE孵育液，放入湿盒中，37℃避光孵育1h，水洗。 4、入甲基绿染色液复染，水洗，镜检。
染色结果： 细胞质：灰黑色或棕黑色弥漫性或颗粒状沉淀 细胞核：绿色 注意事项： 1、血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，2天内染色，否则会影响酶活 2、α-NAE孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。 3、α-NAE孵育液配置后可能出现浑浊，这不会影响染色效果 4、每次染色时，应有阳性对照片
酸性α 醋酸萘酯酶染色法 一、原理 淋巴细胞内含有许多种酶，如α 醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP) 、β 葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。 T淋巴细胞浆内含有的酸性α 醋酸萘酯酶(acid α naphthyl acetate esterase，ANAE) ，在弱酸性条件下，能使底物酸性α 醋酸萘酯水解成醋酸和α 萘酚，后者与六偶氮副品红偶 联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染， 反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法 可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及 血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。 二、材料和方法 (一) 材料 1 2 5%戊二醛溶液(固定液)在0 1mol/L pH值7 4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛 溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。 2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。 3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。 4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。 5 α 醋酸萘酯溶液： α 醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。 6 0 067(1/15)mol/L pH值 7 6磷酸盐缓冲液：
非特异性酯酶染色液(CAE 法) 简介： 酯酶主要分为非特异性酯酶(non-specific esterase)、酯酶(lipase)、胆碱酯酶(choli-esterase)。Leagene 氯乙酸AS-D 萘酚酯酶染色液(CAE 法)又称非特异性酯酶染色液，其原理是细胞中的非特异性酯酶将氯乙酸AS-D 萘酚水解产生萘酚AS-D ，萘酚AS-D 再与重氮盐偶联，生成不溶性有色沉淀，定位于细胞质。本染色液对酯酶染色无特异性，故又称作非特异性酯酶染色液，可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片的非特异性酯酶染色，亦可作氟化钠抑制试验。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步 骤 (仅供 参 考)： 1、 新鲜血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切入预冷的CAE 固定液4℃固定30s 。如果固定培 养细胞或细胞爬片等，宜采用PFA 固定液固定。 2、 水洗，晾干。 3、 入配制好的AS-D 孵育液，放入湿盒中，室温(15-25℃)避光孵育，水洗。 4、 入Lea 苏木素染色液复染，水洗，封片，镜检。 染色结果： 注意事项： 1、 血液或骨髓细胞涂片应新鲜，薄厚适宜，一般2天内染色，否则会影响酶的活性。 编号 名称 DE0037 4×10ml DE0037 4×20ml Storage 试剂(A): CAE 固定液 10ml 20ml RT 避光 试剂(B): PFA 固定液(备选) 10ml 20ml 4℃ 避光 试剂(C): AS-D 孵育液 C1: AS-D solution 0.5ml 1ml -20℃ 避光 C2: GBC solution 0.1ml 0.2ml 4℃ 避光 C3: AS-D buffer 9.5ml 19ml RT 临用前，按C1:C2:C3=1:5:95比例混合，即为AS-D 孵育液，即配即用。 试剂(D): Lea 苏木素染色液 10ml 20ml RT 避光 使用说明书 1份 ALP 活性部位 紫红色 细胞核 蓝色
医院检验中心酯酶染色---中性非特异性脂酶(α—NAE)染色操作规程 [方法学] 酯酶染色的方法很多，根据与pH底物等不同作用，将常用的酯酶染色法分为两大类，即特异性酯酶染色和非特异性酯酶染色。后者又可分为3类：①中性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酚酯酶、乙酸菜酚酯酶和乙酸菜酚AS-D酯酶。②酸性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酯酶和α—丁酸菜酯酶。②碱性非特异性酯酶染色法：α—丁酸菜酯酶。中性非特异性酯酶染色是单核细胞与粒细胞白血病区别的重要方法，一般实验室可选用此法。 [原理] α—乙酸萘酚经酯酶水解产生萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成灰黑或棕黑色沉淀物，定位于胞浆中。 [试剂]
1．α—醋酸萘酯丙酮液：α—醋酸萘酯1g，加丙酮和蒸馏水混合液100m1，溶解后贮于磨口带塞三角瓶内，4℃ 保存，可使用半年。 2.pH7．4磷酸盐缓冲液：0．07MNa2HPO4(即Na2HPO4) 3．基质液：磷酸盐缓冲液82ml，缓慢滴加α-醋酸萘酯丙酮液1．6ml(滴速约每分钟40滴)，边加边用力振摇。 根据5分钟后，加坚牢蓝B80mg，剧烈振摇10分钟， 立即过滤，滤液两杯，各40ml。 4．氟化钠基质液：称取氟化钠(NaF)61mg加入上述其中基质液1杯内，混匀后，标上标记。 [操作] (1)新鲜涂片两张，分别标上NSE和NaF记号，滴加10％ 甲醛生理盐水，固定5分钟，用自来水轻轻冲洗，当 心血膜脱落，晾干。 (2)两张涂片同时放入各自染色杯内，37℃水浴1小时。 (3)取出后水洗，晾干后镜检。不用复染。 [结果观察]
在胞浆内若有棕黑色或灰黑色弥漫性颗粒沉淀者为阳性，细胞脑浆为黄色者为阴性。 [临床意义] 1．阳性：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血 病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟化钠抑制。 2．弱阳性及阴性：粒细胞、淋巴细胞一般为阴性，若有弱阳性也可被氟化钠抑制。 3．临床鉴别：主要用于鉴别急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病，前者NSE阳性，且受氟化钠 (NaF)抑制；而后者NSE阴性，若有阳性也不受氟 化钠抑制。 [附注] (1)坚牢蓝B和氟化钠可小包分装后干燥器保存 (2)基质液配制过程中要振摇，以促使基质溶解。冬天配 制时应适当加温(置于37℃水箱操作)。基质液现配现
酯酶染色---中性非特异性脂酶(α—NAE)染色 [方法学] 酯酶染色的方法很多，根据与pH底物等不同作用，将常用的酯酶染色法分为两大类，即特异性酯酶染色和非特异性酯酶染色。后者又可分为3类： ①中性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酚酯酶、乙酸菜酚酯酶和乙酸菜酚 AS-D酯酶。②酸性非特异性酯酶染色法：α—乙酸菜酯酶和α—丁酸菜酯酶。②碱性非特异性酯酶染色法：α—丁酸菜酯酶。中性非特异性酯酶染色是单核细胞与粒细胞白血病区别的重要方法，一般实验室可选用此法。 [原理] α—乙酸萘酚经酯酶水解产生萘酚，萘酚与重氮盐偶联，生成灰黑或棕黑色沉淀物，定位于胞浆中。 [试剂] 1．α—醋酸萘酯丙酮液：α—醋酸萘酯1g，加丙酮和蒸馏水混合液100m1，溶解后贮于磨口带塞三角瓶内，4℃保存，可使用半年。 2.pH7．4磷酸盐缓冲液：0．07MNa2HPO4(即Na2HPO4) 3．基质液：磷酸盐缓冲液82ml，缓慢滴加α-醋酸萘酯丙酮液1．6ml(滴速约每分钟40滴)，边加边用力振摇。根据5分钟后，加坚牢蓝B80mg，剧 烈振摇10分钟，立即过滤，滤液两杯，各40ml。 4．氟化钠基质液：称取氟化钠(NaF)61mg加入上述其中基质液1杯内，混匀后，标上标记。 [操作] (1)新鲜涂片两张，分别标上NSE和NaF记号，滴加10％甲醛生理盐水，固 定5分钟，用自来水轻轻冲洗，当心血膜脱落，晾干。 (2)两张涂片同时放入各自染色杯内，37℃水浴1小时。 (3)取出后水洗，晾干后镜检。不用复染。 [结果观察] 在胞浆内若有棕黑色或灰黑色弥漫性颗粒沉淀者为阳性，细胞脑浆为黄色者为阴性。 [临床意义] 1．阳性：单核细胞和组织细胞呈强阳性，但可被氟化钠抑制；巨核细胞及血小板呈阳性；早幼粒细胞白血病时早幼粒细胞可阳性，且不受氟 化钠抑制。 编写：谢平制定日期：2011.12.1
1.检验原理 氯醋酸AS-D萘酚能被酯酶水解生成AS-D萘酚，再与稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的红棕色沉淀定位于细胞浆中。阳性反应通常仅出现于粒细胞中，故又称特异性酯酶染色。2.主要组成成分 组成主要成分 2.1、固定剂（A液）甲醛 2.2、偶氮溶液（B液）副品红 2.3、亚硝酸钠溶液（C液）亚硝酸钠 2.4、磷酸盐缓冲溶液（D液）磷酸盐 2.5、氯醋酸AS-D萘酚溶液（E液）氯醋酸AS-D萘酚 2.6、甲基绿溶液（F液）甲基绿 3.储存条件及有效期 有效期：一年（十二个月）。 储存条件：本试剂盒应储存于2～8℃低温环境。 4.样本要求 新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。 5.检验方法 5.1.工作液配制： 5.1.1.浸染工作液配制（一份浸染工作液量为42.8ml,至少可同时放置8-10张涂片）： 5.1.1.1、重氮盐溶液的准备：B液0.4ml与C液0.4ml彻底混匀，静置2分钟； 5.1.1.2、染缸（自备染液缸）内加入D液40ml; 5.1.1.3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀； 5.1.1.4、再加E液2ml入染缸内，轻轻混匀。 5.1.2.滴染工作液配制（一份滴染工作液量为2.14ml）: 使用器材：一次性塑料试管、微量移液器、一次性吸嘴、滴管。 操作：取B液20ul、C液20ul混匀，静置1分钟；再加D液2ml、E液100ul，混匀。注：100Tests中的20mlD液（浓缩缓冲液）用蒸馏水稀释成200ml缓冲液使用。 5.2.染色步骤： 5.2.1、干燥涂片，滴加A液布满涂片固定30秒，蒸馏水冲洗，待干或滤纸吸干。 5.2.2、滴加或浸入工作液室温（如冬天室温低，需用37℃孵育）染色15～20分钟，蒸馏水冲洗，待干。 5.2.3、F液复染1～2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检。 6.临床意义 临床上主要用于急性白血病类型的鉴别急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞NAS－DCE染色多呈（＋）-（＋＋），白血病性早幼粒细胞呈（＋＋）-（＋＋＋）；急性单核细胞白血病原、幼单核细胞多呈阴性反应；急性淋巴细胞白血病原、幼淋巴细胞呈阴性反应。 7.注意事项 7.1．使用前应恢复至室温，用前摇匀。
酸性α醋酸萘酯酶染色法 来源：生物学实验中心发布时间：2010-04-04 查看次数：1597 一、原理 淋巴细胞内含有许多种酶，如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthy l acetate esterase，ANAE)，在弱酸性条件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法可作为鉴别T 淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。 二、材料和方法 (一) 材料 1 25%戊二醛溶液(固定液)在01mol/L pH值74磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。 2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。 3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。 4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。 5 α醋酸萘酯溶液： α醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。 6 0067(1/15)mol/L pH值76磷酸盐缓冲液： 甲液KH2PO4 908g加蒸馏水至1，000ml