分子生物学基础知识
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素材
聚合酶链式反应 PCR（生物学的聚合酶链反应）一般指聚合酶链式反应
是一种用于放大扩增特定的DNA片段的，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR 的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR(聚合酶链式反应）是利用在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按互补配对的原则结合，再调至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
真核生物的启动子
由于真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：
（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白，（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；
（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNApol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。
(一)Ⅱ类基因的启动子和调控区
Ⅱ类基因的启动子由核心元件和上游元件组成。核心元件包括TATA框和转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr）。
亚克隆（英语：subcloning）是一种。
亚克隆：(subclone) 分为细胞克隆和。该技术旨在将目的基因导入目标载体中，以进行进一步研究。值得注意的是，亚克隆和（molecular cloning）不是同一概念。
在细胞克隆中，对培养的细胞来说，从原有的克隆中，再筛选出具有某种特性的细胞进行培养，就是亚克隆。
在分子克隆中，从大片段的克隆中选取特定小片段再克隆。
亚克隆就是初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，将目的基因所对应的一小段DNA找出来。
对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：
(1)目的DNA片段和载体的制备；
(2)目的DNA片段和载体的连接；
(3)连接产物的转化；
(4)重组子筛选。
亚克隆技术：限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。
首先，使用限制酶将目的基因切下。切下来的目的基因需经过纯化（常用手法是凝胶分离法）。之后，可以通过PCR来制造一定数量的该目的基因的拷贝。
同时，需要用切割目的基因的那种限制酶切割载体，以让载体产生与目的基因互补的黏性末端，以使得它们能在后续步骤中被DNA连接酶连接。磷酸酯酶（通常是小牛肠道碱性磷酸酶（CIAP））在该过程中也必不可少，因为它能防止载体的自身黏合。之后，再对目标载体进行分离/纯化。
接下来，将目的基因与载体混合，并添加DNA连接酶。通常，目的基因和载体的分子数之比设定为5比1或10比1[1]（也有文献认为应为3比1[2]）。目的基因与载体的数量过量都会造成不利影响。另外，目的基因也不应过长。超过10kb（千碱基对）的话，目的基因将难以和载体有效结合。一般操作人员会把反应容器放在冰上，让反应进行一整晚
促卵泡激素
糖蛋白激素，α多肽
识别
其他数据
基因座11 p13
促卵泡激素（英语：follicle-stimulating hormone, FSH，亦称为卵泡刺激素）是一种由脑垂体合成并分泌的激素，属于糖基化蛋白质激素，因最早发现其对女性卵泡成熟的刺激作用而得名。后来的研究表明，促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控着发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程。促卵泡激素和黄体化激素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。
结构
促卵泡激素是一种糖蛋白，活性形式是糖基化的异源二聚体，由α和β两条多肽组成。黄体化激素，甲状腺激素，人绒毛膜促性腺激素等糖蛋白激素采用了与促卵泡激素相似的结构。它们共享同样的α亚基（含92位氨基酸残基），而β亚基则随激素的不同而不同。促卵泡激素的β亚基含有118位氨基酸残基，负责与促卵泡激素受体的相互作用。促卵泡激素表面的糖基化涉及海藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、以及硅铝酸。其中，硅铝酸与促卵泡激素的生物半衰期紧密相关。促卵泡激素的半衰期为3至4小时。促卵泡激素的分子量约为30000Da。
基因
促卵泡激素α亚基的基因位于染色体，在多种不同细胞中有表达；β亚基的基因位于染色体11p13，在脑垂体细胞中表达，受促性腺激素释放激素的控制，被抑制素所抑制，被激活素所增强。
活性
促卵泡激素调控人体的发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程，特别是刺激生殖细胞的成熟。
在女性体内
在卵巢中，促卵泡激素刺激尚未成熟的卵泡的生长，直至成熟为格拉夫卵泡。卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断促卵泡激素的进一步合成。这一机制保证了排卵的选择性。在黄体化阶段的末尾，促卵泡激素水平也有小幅度提升，可能与下一个排卵周期的开始有关。
在男性体内[编辑]
在睾丸中，促卵泡激素提高塞尔托利氏细胞合成男性激素结合蛋白的水平，诱发塞尔托利细胞的紧密结合，同时分泌抑制素，在成精子过程中起到至关重要的作用。
作用机理[编辑]
促卵泡激素的目标细胞表面表达有促卵泡激素受体，属于G蛋白偶联受体家族。促卵泡激素与其受体蛋白的结合将导致后者的构象变化。作为跨细胞膜的膜蛋白，促卵泡激素受体胞外的变构将引发胞内的变构，改变其与G蛋白的结合状态，并通过其它蛋白的参
与，进一步诱发环磷酸腺苷等第二信使的生成，将信号传至细胞核内，实现对蛋白表达和细胞发育进程的调节。
相关疾病[编辑]
促卵泡激素水平在儿童期较低，而在女性的更年期之后则很高。
高促卵泡激素水平[编辑]
促卵泡激素的高水平预示着性腺引发的限制性反馈(负反馈)缺失，导致脑垂体不断合成促卵泡激素。这在女性接近或处于更年期时属于正常现象，但对于处于生育年龄的女性则是不正常的，可能是以下疾病的信号：
过早绝经也称为卵巢早衰
性腺障碍或Turner综合征
阉割
斯外尔综合征
先天肾上腺增生的某些病例
睾丸失效
低促卵泡激素水平[编辑]
促卵泡激素分泌水平的降低将导致性腺功能的缺失。在男性精子数量不足的病症中尤为典型。在女性中表现为生育周期的停止，具体相关的疾病有:
多卵囊巢综合征，可能的体征有肥胖，多毛，不育等等；
考曼综合征
下丘脑抑制症
垂体机能减退症泌乳激素过多症
性腺功能低下症
正在接受性腺抑制治疗
使用促性腺激素释放激素结抗剂
使用促性腺激素释放激素促进剂（负调节）
医疗应用[编辑]
促卵泡激素可在绝经期女性的尿液中提取得到，也可以通过基因工程的方法重组表达得到。临床用于对不育症患者的治疗，用以刺激卵泡的发育成熟，同时也用于体外人工受精和体内人工受精的相关治疗中。
促卵泡激素受体
FSHR 基因位于人的2号染色体上p21区，长约2080个核苷酸
调控序列（英语：Regulatory sequence，又译调节序列）是DNA中一段包含启动子、增强子，以及其他可与调节蛋白，如转录因子结合的位置。这些序列调控了基因的表现，进而影响蛋白质的生产。
除此之外，mRNA也有调控序列，可与RNA结合蛋白或其他RNA结合
DNase I，即Deoxyribonuclease I，脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。
DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。
特点：不含RNase(RNase free)，可以用于各种RNA样品的处理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。
用途：制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板； DNase I footprinting研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移(nick translatioin)；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。
来源：从牛胰腺纯化得到。
分子量：约32kDa(单体)。
活性定义：37℃10分钟内，将能够完全降解1μg pBR322质粒DNA所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：40mM Tris-HCl，10mM MgSO4，1mM CaCl2，1μg of pBR322 DNA。
纯度：不含其它DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：50mM Tris-acetate，10mM CaCl2，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：100mM Tris-HCl at 25℃)，25mM MgCl2，1mM CaCl2。
失活或抑制：加入EDTA至终浓度为后，65℃加热10分钟可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金属离子螯合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM以上盐浓度均对DNase I有显着抑制作用。
塞尔托利氏细胞会分泌以下的物质：
（AMH）——于生命的早期就开始分泌。
及——于后分泌，配合调节（FSH）的分泌。
——促进及成熟。
（GDNF）——证实是助长，以确保在产期时的自我更新。
Ets相关分子——滋养在成人精原细胞内的精细胞。
结构[]
塞尔托利氏细胞之间的连接形成了，血睾屏障是一个结构分隔空隙区及内的向管腔区。塞尔托利氏细胞控制养份、及其他进出睾丸的细管，且令向管腔区成为高度免疫的位点。
它亦负责确立及维持的利基，以确保精子的更新及精原细胞在的过程中逐步分裂为成熟的生殖细胞，而最终为放出。
其他
在的成熟阶段，塞尔托利氏细胞会消耗没有用的部分。
一旦塞尔托利氏细胞完全分裂，就不能再增生。所以，一旦启动，就不会创造更多的塞尔托利氏细胞。一些最近发现在身体以外仍能培育这些细胞。这提供了治疗男性不育缺憾的可能性。
塞尔托利氏细胞是由发现这种的生理学家塞尔托利（Enrico Sertoli），他是在意大利研究医药时发现的。
他是于1862年在研究医药时用发现这种细胞。他于1865年发表这种细胞的描述，并以“像树的细胞”或“黏性细胞”来形容它。于1888年，其他以他的名字来称呼这些细胞。
组织学
标准的染色法，是很容易将塞尔托利氏细胞与其他生殖上皮混淆。而它最大的分别就是它那深色的。
细管的横切面
是属于的
精子发生
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与成熟（）
精子发生（英语：spermatogenesis）是的雄性动物的中，从一直发育到成熟的的过程。
一个成熟的人类精子
目的
繁殖跟动植物一样。
位置
精子发生过程的位置是的数个结构。最开始的阶段发生在睾丸，一直到结束。附睾是发展中的精子成熟和储存直到的地方。睾丸的是整个过程的起点，在那里邻近内管壁的干细胞朝着中心分裂—从管壁开始，进行到最内层的部分，即内腔—来生产未成熟的精子。精子成熟过程发生在。
阶段
精母细胞发生
精母细胞发生示意图
主条目：
精细胞生成
主条目：
精细胞生成（）是从生成（）的过程。此过程前已生成的次级精母细胞迅速进入II 期，产生精细胞。
精子形成
主条目：
在精子形成（）阶段中，精细胞开始长出一条尾部。
塞尔托利氏细胞的角色
睾丸中的塞尔托利氏细胞（红色）和精母细胞（蓝色）。附着于细胞的腔顶点尚未经历spermination的精细胞
主条目：
影响因素
激素控制
精子发生的激素控制随物种而不同。人类精子发生的激素控制机制尚未被完全理解。
参考文献
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Whitmore WF, Kars L, Gittes RF: The role of germinal epithelium and spermatogenesis in the privileged survival of
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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
摘要: 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8 0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
Westernblot法即是一种将电泳与KIJSA结合起来的技术，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定方法。[1]
类型将电泳与KIJSA结合起来的技术分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段用途分析样本组分的免疫学测定方法，是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克发明的，Western Blot法的名字就由发明者Southern与印迹的对象DNA相结合得出的Southern blot。后
来又出现了两个过程相似但对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个针对蛋白质，这两种技术分别被称为Northern和Western，Western Blot法的叫法最终被确定下来。
生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化纸上。
1979年，Towbin等人利用电洗脱装置作为印迹动力，首先把Westernblot法用于抗原捡出，并称之为免疫印迹法(immunoblotting)。对应于Southern(DNA分子杂交)、NoHhern(RNA分子杂交)。
1981年Burnette把免疫印迹法称为Western blotting即蛋白质印迹法-Westernblot法。[2]
分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法。是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
蛋白质分析W estern杂交法
DNA分析Southern杂交法
均是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，并均以针对特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern杂交法)序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。
蛋白质的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
Westernblot法的主要优点在于，它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上通过电转移到一张合适的印迹膜上，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有用。
由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题全都无需加以考虑。
启动子是DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位（基因编码链上第一个核苷酸） 5'侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：真核生物的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需启动子外，还需某些外加序列。
启动子在遗传学中是指一段能使基因进行转录的去氧核糖核酸（DNA）序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
完全的启动子称为规范序列。
3 启动子元件
启动子代表一些重要的元件可以与其他调节区域（如增强子、沉默子、边界元件或绝缘子）合作一致，以主导基因转录的水平。由于启动子一般都是在基因的上游，启动子所在的位置或是转录起始点会由+1开始编号。上游的位置所以都是由+1逆数的负数，例如-100就是位置100的上游碱基对。以下是各种启动子：
核心启动子是引发转录的必要部份及转录起始点，位置约为-35。且是RNA聚合酶的结合位点及一般转录因子结合位点。近端启动子是基因的近端序列上游，包括一些基本的调控元件，位置约为-250，且是特定转录因子结合位点。远处启动子是基因的远处序列上游，包括一些额外的调控元件，影响力较近端启动子弱。它是在上游更远的位置（但不是位置性的增强子或调控区域），是特定转录因子结合位点。
启动子规范序列的用途一般都是有问题的，且可引致对启动子序列的误解。在规范序列中，转录因子结合位点在特定细胞情况下有一个单独的序列会与蛋白质牢固地结合。但是自然选择会偏向较低能量的结合，作为一种调节转录输出。这种最普遍的序列称为野生型序列。这纵然不是最有利的序列，最近证据显示多种基因（包括原癌基因）都有G四股结构作为潜在调控信号。
医学分子生物学 疾病和基因关系始终是医学领域关注的重大问题。在孟德尔遗传规律被重新认识的初期，就发现许多疾病受到遗传因素的控制，遵守孟德尔遗传因子的传递规律。遗传连锁定律的提出，现代经典遗传学理论体系的完善，极大地促进了对遗传性疾病的认识。上世纪40年代，L Pauling提出了”分子病”的概念，1956年，V Ingram发现血红蛋白β链第六位氨基酸从谷氨酸突变为缬氨酸是导致镰刀状贫血的原因。几乎同时，J.Lejeune发现Down综合症是由于21号染色体三陪体异常所致，系列染色体疾病病因。1976年，H Vanmus 和M Bishop在对肿瘤病毒学的研究中，发现了病毒癌基因，继而又无确定细胞癌基因的存在，此后抑癌基因也相继被发现，建立了肿瘤发生的基因理论，肿瘤被认为是体细胞的遗传病得到了普遍的认可。1983年，将亨廷顿病基因定位于第四号染色体上，1986年，克隆了慢性肉芽肿病的致病基因，同年杜氏肌营养不良和视网膜母细胞瘤的基因，也被定位克隆成功，掀起了单基因遗传病致病基因鉴定和克隆的热潮。世纪之交，人类基因组计划的完成，新的DNA标记的发现，为研究常见病的遗传因素成为了可能，2005年，首次用全基因组关联分析（GWAS），解析了视网膜黄斑变性病的相关基因，揭开了复杂性疾病易感基因确定的序幕，此后，一系列的常见多发疾病基因的GWAS研究，极大地丰富了人们对疾病发病机制的认识，加深了对疾病发生发展机制的认知。今天，疾病和基因关系仍是很长一段时间的重点工作，解析疾病基因,不但可以确定疾病的遗传易感性，有目的的开展预防、诊治，更
重要的是了解疾病新的致病机制，为分子诊断、分子靶向干预提供分子靶点。另一方面，药物作用靶点分子基因在人群的多态性，对药物作用的疗效影响；参与药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性（admet）的基因多态性，也会影响药物的疗效，即药物基因组方面的研究，必将成为后基因组时代的重要研究内容。以疾病基因组学和药物基因组学为代表的组学研究进展，将为个体化医疗、精准医学提供理论和实践基础。
分子生物学 1.ORF 答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。 2.结构基因 答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。 3.断裂基因 答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。 4.选择性剪接 答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。 5.C值 答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。 6.生物大分子 答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 7.酚抽提法 答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 8.凝胶过滤层析 答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 9.多重PCR 答：多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。 10.荧光域值 答：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。 11.退火 答：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢
医学分子生物学习题集 （参考答案） 第二章基因与基因组 一、名词解释 1.基因(gene)：是核酸中储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息 所必需的全部核苷酸序列。 2.断裂基因(split gene)：真核生物基因在编码区内含有非编码的插入序列，结构基因 不连续，称为断裂基因。 3.结构基因(structural gene)：基因中用于编码RNA或蛋白质的DNA序列为结构基因。 4.非结构基因(non-structural gene)：结构基因两侧一段不编码的DNA片段，含有基 因调控序列。 5.内含子(intron)：真核生物结构基因内非编码的插入序列。 6.外显子(exon)：真核生物基因内的编码序列。 7. 基因间DNA (intergenic DNA)：基因之间不具有编码功能及调控作用的序列。 8. GT-AG 法则 (GT-AG law)：真核生物基因的内含子5′端大多数是以GT开始，3′ 端大多数是以 AG 结束，构成 RNA 剪接的识别信号。 9.启动子(promoter)：RNA聚合酶特异识别结合和启动转录的DNA序列。 10.上游启动子元件(upstream promoter element )：TATA合上游的一些特定的DNA序 列，反式作用因子，可与这些元件结合，调控基因转录的效率。 11.反应元件(response element)：与被激活的信息分子受体结合，并能调控基因表达的 特异DNA序列。 12.poly(A)加尾信号 (poly(A) signal) ：结构基因末端保守的 AATAAA 顺序及下游 GT 或T富含区，被多聚腺苷酸化特异因子识别，在mRNA 3′端加约200个A。 13.基因组(genome)：细胞或生物体一套完整单倍体的遗传物质的总称。 14.操纵子(operon)：多个功能相关的结构基因成簇串联排列，与上游共同的调控区和下 游转录终止信号组成的基因表达单位。 15.单顺反子(monocistron)：一个结构基因转录生成一个mRNA分子。 16.多顺反子(polycistron)：原核生物的一个mRNA分子带有几个结构基因的遗传信息，
Northern blot：是DNA/RNA的杂交，它是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，凝胶分离后的RNA 通过southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。它是研究基因表达的有效手段。与Southern blot 相比，它的条件更严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。实验步骤：1.用具的准备2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染3．制胶4. RNA样品的制备5.电泳6.转膜7.探针的制备8.探针的纯化及比活性测定9．预杂交10．探针变性11．杂交12．洗膜13．曝光14．去除膜上的探针15．杂交结果 半定量PCR要求比普通PCR更严格一些，另外往往通过转膜后的同位素杂交检测或凝胶成像后的灰度测定比较样品间的差异。 半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如β-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个β-actin的内参照对照。 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1．实时荧光定量PCR无需内标 2．内标对实时荧光定量PCR的影响 Sybr green（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针法） 检测两种蛋白质相互作用方法 1共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析 2蛋白质亲和色谱基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。 3免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高4 Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 1.酵母双杂交 2.GSTpull-down实验 3.免疫共沉淀 4.蛋白质细胞内定位 RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法 1.此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有 利用价值的信息 2.节约了实验所花费的经费和时间。 3.只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长 基因特异性引物（GSPs）应该是： 23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 注意事项 1.cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高
2012浙江大学医学分子生物学（乙）回忆版： 一．名词解释（3分*5） 1.The Central Dogma 2.Telomere 3.nuclear localization signal, NLS 4.Protein Motif 5.Splicesome 二．简答题：（5分*9） 1.一个基因有哪些结构组成？ 2.基因、染色体、基因组的关系？ 3.表观遗传机制改变染色质结果的机制？ 4.内含子的生物学意义？ 5.什么是蛋白质泛素化？其生物学意义是什么？ 6.蛋白质纯化的方法？ 7.MicroRNA是什么？它如何发挥作用？ 8.什么是全基因组关联研究（Genome Wide Association Studies,GWAS）？其研究目的是什么？ 9.分子生物学研究为什么需要模式生物？ 三．问答题：（10分*4） 1.人体不同部位的细胞其基因组相同，为什么表达蛋白质的种类和数量不同？ 2.用分子生物学知识，谈谈疾病发生机制？ 3.有一块肿瘤组织及癌旁组织，设计一个实验证明细胞内蛋白质在肿瘤发生发展中的作用？ 4.目前，基因靶点研究已成为新药开发的用药部分，结合目前药物靶点在新药开发中的应用，谈谈你的建议和观点？
2011浙江大学博士入学考试医学分子生物学试题回忆 一、英文名解 1、冈崎片段： 2、反式作用因子： 3、多克隆位点： 4、micro RNA： 5、分子伴侣： 二、简答 1、蛋白质四级结构。 2、真核转录调控点。 3、表观遗传学调控染色质。 4、真核RNA聚合酶类型及作用。 5、基因突变。 6、组学概念及举例。 7、简述兔源多克隆抗体的制备。
【期末复习总结】基础分子生物学 基础分子生物学 第一章 1. DNA的发现 Avery的肺炎双球菌转化实验 Hershey和Chase的噬菌体侵染细菌试验 2. 基因工程操作的工具 限制性内切酶。DNA连接酶。运载体。 3. 原核生物的基因组和染色体结构都比较简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。 真核生物转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。其基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA 剪辑3个方面。 弟一早 1. 原核细胞染色体： 一般只有一条大染色体且大都带有单拷贝基因，除少数基因外（如rRNA基因）。整个染色体DNA儿乎全部由功能基因和调控序列所 组成。 几乎每个基因序列都与它所编码蛋白质序列呈线性对应关系。
2. 真核生物 真核生物染色体中相对分子质量一般大大超过原核生物，并结合有大 量的蛋白质DNA具体组成成分为：组蛋白、非组蛋白、DNAo 其蛋白质与相应DNA的质量之比约为2:lo 5. 组蛋白 组蛋白是染色体的结构蛋白，其与DNA组成核小体。根据其凝胶电泳 性质可将其分为HL H2A、H2B、H3及H4。 6. 组蛋白的特性： 进化上极端保守性。其中H3、H4最保守，H1较不保守。 无组织特异性. 肽链上氨基酸分布的不对称性. 组蛋白的修饰作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 富含赖氨酸的组蛋白H5. 7. 非组蛋白 色体上除了存在大约与DNA等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白。 组蛋白的量大约是组蛋白的60%?70%,非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 组蛋白包括酶类、骨架蛋白、核孔复合物蛋白以及肌动蛋白、肌球蛋白等。它们也可能是染色质的组成成分。 类常见的非组蛋白： HMC蛋白。一般认为可能与DNA的超螺旋结构有关。
名词解释： 基因是核酸中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 基因组（gencme）：细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和（包括一种生物所需的全套基因及间隔序列）称为基因组。基因组的功能是贮存和表达遗传信息。 SD序列(Shine-Dalgarno sequence,SD sequence) 是mRNA能在细菌核糖体上产生有效结合和转译所需要的序列。SD序列与16S rRNA的3’末端碱基(AUUCCUCCAC-UAG-5’)互补，以控制转译的起始 分子克隆：克隆（clone）：是指单细胞纯系无性繁殖，现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去，在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。 动物克隆(Animal cloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法. 基因诊断：就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构 （DNA水平）及其表达水平（RNA水平）是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。 基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的目的基因导入靶细胞后有的可与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。 转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内，使之发育成具有表达目的基因的胚胎动物，并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。 探针：在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类专门切割DNA 的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列并切割dsDNA。 载体：要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 限制性片段长度多肽性分析(RFLP):DNA片段长度多态性分析（restriction fragment length polymer-phism,RFLP）基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在。 简答题： 1.蛋白质的生物合成过程中的成分参与，参与因子，作用？ mRNA是合成蛋白质的“蓝图（或模板）” tRNA是原料氨基酸的“搬运工” rRNA与多种蛋白质结合成核糖体作为合成多肽链的装配机（操作台） tRNA mRNA是合成蛋白质的蓝图，核糖体是合成蛋白质的工厂，但是，合成蛋白质的原料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，需要转运RNA把氨基酸搬运到核糖体中的mRNA上 rRNA 核糖体RNA（rRNA）和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体，核糖体是蛋白质合成的场所。
分子生物学 1．DNA的一级结构：指DNA分子中核苷酸的排列顺序。 2．DNA的二级结构：指两条DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构以及四股螺旋结构。3．DNA的三级结构：双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。 4．DNA的甲基化：DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化。甲基化修饰在原核生物DNA中多为对一些酶切位点的修饰，其作用是对自身DNA产生保护作用。真核生物中的DNA甲基化则在基因表达调控中有重要作用。真核生物DNA中，几乎所有的甲基化都发生于二核苷酸序列5’-CG-3’的C上，即5’-mCG-3’. 5．CG岛：基因组DNA中大部分CG二核苷酸是高度甲基化的,但有些成簇的、稳定的非甲基化的CG小片段,称为CG岛,存在于整个基因组中。“CG”岛特点是G+C含量高以及大部分CG二核苷酸缺乏甲基化。 6．DNA双螺旋结构模型要点： （1）DNA是反向平行的互补双链结构。 （2）DNA双链是右手螺旋结构。螺旋每旋转一周包含了10对碱基，螺距为3.4nm. DNA 双链说形成的螺旋直径为2 nm。每个碱基旋转角度为36度。DNA双螺旋分子表面 存在一个大沟和一个小沟，目前认为这些沟状结构与蛋白质和DNA间的识别有关。（3）疏水力和氢键维系DNA双螺旋结构的稳定。DNA双链结构的稳定横向依靠两条链互补碱基间的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持。 7．核小体的组成： 染色质的基本组成单位被称为核小体，由DNA和5种组蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4共同构成。各两分子的H2A,H2B,H3和H4共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA双螺旋缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠样结构。 8．顺反子（Cistron）：由结构基因转录生成的RNA序列亦称为顺反子。 9．单顺反子（monocistron）：真核生物的一个结构基因与相应的调控区组成一个完整的基因，即一个表达单位，转录物为一个单顺反子。从一条mRNA只能翻译出一条多肽链。10．多顺反子(polycistron): 原核生物具有操纵子结构，几个结构基因转录在一条mRNA 链上，因而转录物为多顺反子。每个顺反子分别翻译出各自的蛋白质。 11．原核生物mRNA结构的特点: (1) 原核生物mRNA往往是多顺反子的，即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息。 （2）mRNA 5‘端无帽子结构，3‘端无多聚A尾。 （3）mRNA一般没有修饰碱基。 12．真核生物mRNA结构的特点： （1）5‘端有帽子结构。即7－甲基鸟嘌呤－三磷酸鸟苷m7GpppN。 （2）3‘端大多数带有多聚腺苷酸尾巴。 （3）分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化。 （4）分子中有编码区和非编码区。 14．tRNA的结构特点 （1）tRNA是单链小分子。 （2）tRNA含有很多稀有碱基。 （3）tRNA的5‘端总是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG. （4）tRNA的3‘端是CCA－OH序列。是氨基酸的结合部位。 （5）tRNA的二级结构形状类似于三叶草，含二氢尿嘧啶环（D环）、T环和反密码子环。
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
学习指南 分子生物学是在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。因此，分子生物学已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，也是整个生物学的基础课程之一。 医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。作为一门课程，医学分子生物学涵盖了医学各专业学生必须学习的分子生物学基础知识，以及分子生物学在医学领域中形成的专门研究领域及相关知识。这些基础知识为医学各学科专业知识的学习、为了解各学科领域的研究进展奠定坚实的基础。因此，分子生物学是广大医学生和临床医学、生物学研究者学习、从事转化医学研究的一个重要桥梁课程。 医学分子生物学课程的教学目标是培养学生掌握分子生物学的基础知识、基本理论、基本技能，了解分子生物学的最新进展及其在医学领域的应用，具有解决实际问题的能力，培养学生的创新精神与创新能力。课程系统地介绍了分子生物学的基础理论知识和技术理论知识，介绍了分子生物学在医学各相关领域的应用和相关研究进展。理论包括3大部分的内容：第一部分为分子生物学基本原理，包括绪论、基因与基因组、基因表达的调控、DNA损伤与修复等章节。第二部分为医学分子生物学基本技术，主要包括基因结构与表达分析的基本策略、基因工程与基因体外表达、蛋白质组学的研究方法和进展等章节。第三部分介绍疾病的分子诊断、预防和治疗，主要有疾病产生的分子基础、基因诊断、基因治疗原理与研究进展。实验部分主要让学生学习分子生物学的基本研究技术。学生学习本课程需要理论联系实践，并加强各种课外的科研实训。 该课程通过提供课程的全程录像、教案、课件和教学大纲，为学生、教师和社会群体的网络学习提供了便捷的资源，辐射对象量大面广，切实为从基础研究到临床应用的转化医学推广过程服务。
基础分子生物学 三、选择题 1、RNA 合成的底物是------ ---------。 A dATP, dTTP , dGTP , d CTP BATP, TTP , GTP , CTP C ATP ,GTP, CTP,UTP D 、GTP, CTP,UTP，TTP 2．模板DNA的碱基序列是3′—TGCAGT—5′，其转录出RNA碱基序列是：A．5′—AGGUCA—3′ B．5′—ACGUCA—3′ C．5′—UCGUCU—3′ D．5′—ACGTCA—3′ E．5′—ACGUGT—3′ 3、转录终止必需。 A、终止子 B、ρ因子 C、DNA和RNA的弱相互作用 D上述三种 4、在转录的终止过程中，有时依赖于蛋白辅因子才能实现终止作用，这种蛋白辅因子称为---- -----。 A σ因子 B ρ因子 C θ因子 D IF因子 5．识别RNA转转录终止的因子是： A．α因子 B．β因子 C．σ因子 D．ρ因子 E．γ因子 6．DNA复制和转录过程有许多异同点,下列DNA复制和转录的描述中错误的是： A．在体内以一条DNA链为模板转录，而以两条DNA链为模板复制 B．在这两个过程中合成方向都为5′→3′ C．复制的产物通常情况下大于转录的产物 D．两过程均需RNA引物 E．DNA聚合酶和RNA聚合酶都需要Mg2+ 7、核基因mRNA 的内元拼接点序列为。 A、AG……GU B、GA……UG C、GU……AG D、UG……GA 8、真核生物mRNA分子转录后必须经过加工，切除---------，将分隔开的编码序列连接在一起，使其成为蛋白质翻译的模板，这个过程叫做RNA的拼接。 A 外显子 B 启动子 C 起始因子 D 内含子 9、在真核生物RNA polⅡ的羧基端含有一段7个氨基酸的序列，这个7肽序列为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser ,被称作。 A C末端结构域 B 帽子结构 C Poly(A)尾巴 D 终止子 10．真核生物RNA的拼接需要多种snRNP的协助，其中能识别左端（5’）拼接点共有序列的snRNP 是： A．U1 snRNP B．U2 snRNP C．U5 snRNP E．U2 snRNP+ U5 snRNP 四、是非题 1、所有的启动子都位于转录起始位点的上游。（ X ） 2、RNA分子也能像蛋白酶一样，以其分子的空间构型产生链的断裂和和合成所必须的微环境。（对） 3、真核生物的mRNA中的poly A 尾巴是由DNA编码，经过转录形成的。（ X ） 4、在大肠杆菌RNA聚合酶中，β亚基的主要功能是识别启动子。（ X ） 5、所有起催化作用的酶都是蛋白质。（ X ） 五、问答题
医学分子生物学 名词解释： 结构基因(structural genes)： 可被转录形成 mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。 ORF 开放阅读框架（ open reading frame，ORF ）： 是指DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码。 C值(C-value)： 一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。 C值矛盾/ C值悖论： C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。 基因组（genome）： 是指生物体全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域 重叠基因 是指同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。 SNP单核苷酸多态性（singl e nucleotid e polymorphism） 是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变 蛋白质组(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律. 质谱技术mass spectrometry,MS 样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量 开放阅读框=ORF 基因工程
又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。 逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆转录作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。 粘性末端 被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端（来自360问答） 载体vector 指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。多克隆位点 载体上具有多个限制酶的单一切点（即在载体的其他部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点 报告基因（reporter gene）： 是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。 转化 以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程称为转化（transformation） 感受态细胞 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competent cell)。 碱裂解法 在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。 核酸变性 变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。 核酸复性
分子生物学实验基础 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transforma tion）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（p lasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。
分子生物学知识点Last revision on 21 December 2020
一、名词解释： 1. 基因：基因是位于染色体上的遗传基本单位，是负载特定遗传信息的DNA片段，编码具有生物功能的产物包括RNA和多肽链。 2. 基因表达：即基因负载遗传信息转变生成具有生物学功能产物的过程，包括基因的激活、转录、翻译以及相关的加工修饰等多个步骤或过程。 3.管家基因：在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因，其表达水平变化很小且较少受环境变化的影响。如GAPDH、β-肌动蛋白基因。 4. 启动子：是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其他转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA片段。 5.操纵子：是原核生物基因表达的协调控制单位，包括有结构基因、启动序列、操纵序列等。如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。 6.反式作用因子：指由其他基因表达产生的、能与顺式作用元件直接或间接作用而参与调节靶基因转录的蛋白因子（转录因子）。 7.顺式作用元件：即位于基因附近或内部的能够调节基因自身表达的特定DNA序列。是转录因子的结合位点，通过与转录因子的结合而实现对真核基因转录的精确调控。 8. Ct值：即循环阈值（cycle threshold，Ct），是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。（它与PCR扩增的起始模板量存在线性对数关系，由此可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和（或）相对定量。） 9.核酸分子杂交：是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来源不同但互不配对的核酸单链（包括DNA和DNA，DNA和RNA，RNA和RNA）相互结合形成杂合双链的特
第2章基因、基因组和基因组学 基因(gene)：携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子。基因是合成有功能的蛋白质或RNA所必 需的全部DNA，包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，也包括为保证转录所必需的调控序列。基因的功能：传递遗 传信息，控制个体性状表现。结构基因(structural genes)：可被转录形成mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构 蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。调节基因(regulatory genes) ：某些可调节控制结构基因表达的基因。 其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质(或酶)量的改变。eg. miRNA, siRNA, piRNA 核糖体RNA 基因(ribosomal RNA genes) 与转运RNA 基因(transfer RNA genes)：只转录产生相应的RNA而不翻 译成多肽链。真核生物的RNA聚合酶( 3种)：RNA 聚Array合酶I, II, III. 开放阅读框架(open reading frame，ORF)：在DNA 链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为 止的一个连续编码序列。断裂基(split gene)：真核生物 结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨 基酸组成的完整蛋白质。 基因组(genome)：一个细胞内的全部遗传信息，包括染色体基因组和染色体外基因组。基因组中的DNA包括 编码序列和非编码序列。部分病毒基因组--RNA。 C值(C-value)：一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。通常，进化程度越高的生物其基因组越大，但从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上所处地位的高低无关。存在C-value paradox （C值悖理）。生物复杂性越高，其基因的密度越低。 病毒基因组的大小: 与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小。不同的病毒之间基因组大小相差很大。乙肝病 毒DNA：3kb，编码4种蛋白质；痘病毒的基因组：300kb，编码几百种蛋白质。病毒基因组的大小通常与其对宿主 的依赖程度有关，基因组越大，依赖性越小。RNA 病毒基因组编码序列具有节段性:有些病毒的基因组RNA由 不连续的几条核酸链组成（如流感病毒，轮状病毒等）。分段基因组的病毒一般感染效率较低；分段基因组容易 发生重组，故病毒容易变异。目前未发现DNA病毒有此状况。 病毒基因存在基因重叠:基因重叠：同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。这种现象在 其它的生物细胞中仅见于线粒体和质粒DNA。此结构意义在于使较小的基因组能够携带较多的遗传信息。基因重 叠的方式:1）一个基因完全在另一个基因里面。2）几个基因部分重叠。3）两个基因之间只有一个碱基重叠。重 叠基因的DNA序列可能大部分相同，但由于翻译时的读码框架不同、或起始部位不同而产生不同的蛋白质。有些 真核病毒的部分序列，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因而言却是外显子。病毒基因组的大部分序列 具有编码功能：病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部份没有编码翻译功能。ΦX174基因 组中不编码的序列只占217/5375。乳头瘤病毒基因组约8.0Kb，其中不编码的部分约为1.0kb。少数真核生物病毒 的基因组也存在内含子结构。 病毒基因组的转录单元是多顺反子:多顺反子mRNA (polycistronie mRNA) ：病毒基因组DNA序列中功能上相关 的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。它们 可被一起转录成含有多个mRNA 的分子。 病毒基因组都是单倍体：除了逆转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。 逆转录病毒带有逆转录酶，能使RNA反向转录生成DNA，因此其基因组可拥有两个拷贝。噬菌体基因具有连续性： 噬菌体的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子。 原核生物基因组通常比较简单，其基因组大小在106bp～107bp之间，所包含的基因数目几百个到数千个之间。原 核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个
浙江大学医学博士考试分子生物学（乙）2005-2015年真题2015年分子生物学（乙） 1.什么是基因转录？什么是基因表达？两者区别？（10分） 2.染色质状态改变的机制，基因选择性开关的可能临床应用。（10分） 3.什么是RNA剪接？什么是RNA编辑？什么是选择性剪接？（10分） 4.如果组织中某种蛋白表达量很低，如何获得高浓度的这种蛋白？（10分） 5.什么是非编码RNA？有哪些？长链非编码RNA的功能。（10分） 6.什么是遗传？什么是表观遗传？表观遗传的分子机制。（10分） 7.核酸测序的发展史，当代最主流的测序技术在分子生物学中的应用。（10分） 8.如何确定P53蛋白和蛋白X有相互作用。（10分） 9.什么是超分辨率荧光显微镜（2014年诺贝尔化学奖）？在分子生物学中的应用？你想拥有怎样的显微镜？（10分） 10.从分子水平上设计试验证明镉对血管有损伤作用。（10分） 2014年分子生物学（乙） 1.图示基因表达过程并指出调控关键点。10分 2.蛋白质现实中以三级以上结构存在，为什么教科书中从蛋白质一、二级结构写起？10分 3.什么是siRNA、miRNA，其作用的异同点？10分 4.什么是γH2AX，为什么可用于DNA损伤的检测？8分 5.解释细胞自噬过程。7分 6.DNA、RNA、蛋白质相互作用的方式及涉及的分子生物学现象。10分 7.设计试验使得人源性基因在大肠杆菌中高表达。10分 8.什么是PM2.5？设计试验从细胞水平研究其特点及作用机制。10分 9.曹操家族基因研究发现，曹操非汉相曹参后代，同时推翻了曹操为夏侯氏抱养而来的说法。 请你写一篇科普小论文介绍其中的一些分子生物学知识并证明你的结论。10分10.2013诺贝尔奖，囊泡运输的知识。15分 2013年分子生物学（乙） 浙大考博分子生物学 名词解释（全中文，9题，36分）： 细胞骨架、细胞增殖、干细胞、细胞分化、 细胞膜的跨膜转运、信号肽、自噬小体、蛋白激酶、呼吸链。 1.细胞连接的概念，分类及特点。 2.线粒体在细胞死亡中的作用：
分子生物学知识点总结 1.蛋白质组(proteome)：proteins expressed by a genome, 即基因组表达的 全套蛋白质。蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。（相互作用网络PPI） 2.表达蛋白质组学研究的基本流程：蛋白样品的制备及定量-总蛋白的双向凝 胶电泳（染色）-凝胶分析软件分析-胶内酶解（胰肽酶）-质谱分析（肽质量指纹图谱）-数据库搜索鉴定蛋白性质 3.双向凝胶电泳：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分 子量，先经等电聚焦电泳(isoelectric focusing， IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。 4.比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织） 之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或者发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。 5.软电离：所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会 形成碎片离子。 6.肿瘤血清蛋白质分析方法（tumor serologic proteome analysis， SERPA）： 是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法。 SERPA其实验过程如下： ①双向电泳分离肿瘤组织（细胞）总蛋白质； ②转膜； ③建立western blotting蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）； ④软件分析确定差异反应的蛋白质斑点； ⑤质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶(replica gel)中相应的差异蛋白 质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物； ⑥用ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分 析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用。 7.蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面， 形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。 8.功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA间的相互作用的研究。 以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。研究方法主要有： ●蛋白质芯片技术 目前常用蛋白质芯片有： 1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 2. 抗体芯片 3. 靶蛋白质芯片 4. 液相蛋白质芯片 ●噬菌体展示技术 ●酵母双杂交系统 ●免疫共沉淀