《生物化学》课程实验指导书2007-2009级食品科学与工程专业使用
杨明编
佛山科学技术学院
2010 年 9 月
目录
实验一可溶性糖含量测定（蒽酮比色法） (3)
实验二还原糖和总糖的测定（3,5—二硝基水杨酸法） (5)
实验三微量蛋白质含量测定(考马斯亮蓝法) (7)
实验四过氧化氢酶活性测定（氧量测定法） (9)
实验五酶促反应中的竞争性抑制 (10)
实验六氨基酸的薄层层析 (11)
实验记录和实验报告
一、实验记录
实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本上。
实验中观察到的现象、结果和数据，应该及时地直接记在记录本上，绝对不可以用单片纸做记录或草稿。原始记录必须准确、简练、详尽、清楚。从实验课开始就应养成这种良好的习惯。
记录时，应做到正确记录实验结果、切忌夹杂主观因素，这是十分重要的。在实验条件下观察到的现象，应如实仔细地记录下来。在定量实验中观测的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光电比色计或分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为0.050不应写成0.05。每一个结果最少要重复观测两次以上，当符合实验要求并确知仪器工作正常后再写在记录本上。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次实验的测量结果，所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来。数据的计算也应该写在记录本的另一页上，一般写在正式记录左边的一页。总之，实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。
实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。
如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验。因为，将不可靠的结果当作正确的记录，在实际工作中可能造成难于估计的损失。所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。
二、实验报告
实验结束后，应及时整理总结实验结果，写出实验报告。实验报告的书写应使用黑色或蓝色钢笔或圆珠笔，可使用铅笔作图或用Excel电脑打印制作标准曲线。
通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操
作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括：思考题；实验的正常结果和异常现象；关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题；对于实验设计的认识、体会和建议；对实验课的改进意见等（要针对实验操作方面内容，对于应付写缺少仪器设备的不给分）。
学校规定的实验报告规范格式：
一、实验目的：5分
二、实验原理: 15分
三、实验步骤: 20分
四、实验结果: 20分
五、讨论分析: 30分
六、改进实验建议: 10分
主要参考书
●北京大学生物系生物化学教研室编：生物化学实验指导，人民教育出版社，1979
年
●山东农学院、西北农学院编：植物生理学实验指导，山东科学技术出版社，1980
年
●西北农学院汇编：基础生物化学实验指导，1984年
●复旦大学编：生物化学实验，上海科学技术出版社，1981年
●蔡武城等编：生物化学实验技术教程，复旦大学出版社，1983年
●张龙翔，张庭芳，李令媛主编：生化实验方法和技术，高等教育出版社，1985
年
●《生物化学》编审小组编：生物化学实验指导，人民卫生出版社，1987年
●黄涛主编：有机化学实验，高等教育出版社，1988年
●赵永芳编：生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1994年
《生物化学》课程实验指导书
适用专业：食品科学与工程
修订：杨明
E-mail: lxhym@https://www.doczj.com/doc/ba10385084.html,
字数：9.7千字
出版：佛山科学技术学院印刷厂 2010年9月第1版
实验一 可溶性糖含量测定（蒽酮比色法）
一、实验原理
在浓硫酸的脱水作用下，蒽酮能与糖类（包括多糖在内）作用生成绿色的糠醛衍生物，其绿色深浅与糖的含量一致。
己糖??→?-
O H 23 羟甲基糠醛+蒽酮??→?-O
H 2糠醛衍生物（绿色）
二、仪器和试剂
1、主要仪器：分光光度计，天平，水浴锅，吸管等。
2、蒽酮—醋酸乙酯试剂：1g 蒽酮溶解于50ml 醋酸乙酯中，为促进溶解可用温水浴微微加热，该试剂不可久贮，最好用前临时配置。
3、10mg/ml 蔗糖标准液：取分析纯蔗糖1.00g ，在小烧杯中加少量水溶解，移入100ml 容量瓶中，加0.5ml 浓硫酸，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为含蔗糖10mg/ml 的标准液（由于硫酸的作用，实际上成为含葡萄糖与果糖各一半的转化糖溶液），该溶液可以长期保存。
4、0.1mg/ml 蔗糖标准液：精确吸取10mg/ml 蔗糖标准液1ml ，移入100ml 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即为0.1mg/ml 标准液，该溶液应现用现配。
5、浓硫酸（化学纯）比重1.84。
三、实验步骤
1、标准曲线制作：
取0.1mg/ml 蔗糖标准液配制成0（空白）、10 ug /ml 、20 ug /ml 、30 ug /ml 、40 ug /ml 、50 ug /ml 的标准液各10ml ，分别吸取2ml 放入大试管中，每管中加入蒽酮～醋酸乙酯试剂0.5ml ；然后沿每管管壁缓缓加入5ml 浓硫酸，先将试管轻摇一下，待醋酸乙酯水解后，再猛摇试管数次（注意勿将硫酸溅出）使液体充分混匀，立即放入沸水浴中保温1min ，取出置试管架上，冷却后倒入比色杯，以空白做参照在波长620nm 下比色，读取光密度。以蔗糖浓度为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。
2、样品提取：
取干样品粉末100mg或剪碎混匀的新鲜样品1g，放入大试管中，加蒸馏水10ml，置沸水浴中加热提取20min，冷却后过滤入100ml容量瓶中，冲洗残渣1~2次，定容至刻度。
3、测定：
取大试管数支，按样品号码编号，用0.1ml移液管吸取提取液0.1ml移入大试管底部，再加1.9ml蒸馏水，0.5ml蒽酮～醋酸乙酯试剂，然后沿管壁缓缓加入5ml 浓硫酸，按制作标准曲线同样操作方法显色，冷却后，在波长620nm下比色，读取光密度（注意每批测定设一空白校正透光度至100）。
四、实验结果
在Excel绘制蔗糖标准曲线，并求出标准线性方程。
1、以表格形式列出实验数据，由标准线性方程求出提取液中糖的量，按下式计算待测样品的糖含量。
可溶性糖（mg?g-1）=
提取液的糖量（ug ）×提取液总体积（ml）测定用提取液体积（ml）×组织重量（g）×1000
可溶性糖（mg?g-1）= 提取液的糖量（mg ）×提取液总体积（ml）测定用提取液体积（ml）×组织重量（g）
五、讨论分析
1、要做好这个实验应注意哪几个环节？
2、试述蒽酮比色法的适用范围。
3、对得出的可溶性糖实验结果与仪器实际测定加以比较，误差多大？
Excel
葡萄糖含量(mg/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 对应OD值0 0.1068 0.2269 0.3570 0.5020 0.6530 0.8310
实验二还原糖和总糖的测定（3,5～二硝基水杨酸法）
一、实验原理
本实验是利用3，5～二硝基水杨酸溶液（DNS法）与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。
二、仪器和试剂
1、主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管，移液管等。
2、3,5-二硝基水杨酸试剂：
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml 10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温放置7-10天后使用。
3、6 mol?L-1盐酸
4、10%氢氧化钠溶液
5、酚酞指示剂
6、碘～碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
三、实验步骤
1、葡萄糖标准曲线的制定
葡萄糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。
将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品中总糖和还原糖含量的测定
（1）样品中还原糖的提取：准确称取10g新鲜材料（或2g材料干样粉末），放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20min，过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，再定容至100ml。
（2）样品中总糖的水解提取：准确称取10g新鲜材料（或1g材料干样粉末），
放在锥形瓶中，加入10ml 6 mol ?L -1 盐酸，15ml 水，在沸水浴中加热30min ，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100ml 。再精确吸取上述溶液10ml 于100ml 容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。
（3）样品中糖含量的测定：
加完试剂后，与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。
四、实验结果
1、在Excel 绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。
2、以表格形式列出实验数据，取样品的OD 520平均值用标准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。
还原糖（mg ?g -1
）= 还原糖毫克数×提取液总体积（ml ）×稀释倍数 测定用提取液体积（ml ）×样品重量（g ）
五、讨论分析
1、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖包括哪些？
2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？
3、测总糖的酸水解液，为什么要用氢氧化钠中和？
4、计算多糖含量：多糖=总糖-还原糖
总糖（mg ?g -1）=
样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml ）×稀释倍数
测定用提取液体积（ml ）×样品重量（g ）
实验三微量蛋白质含量测定(考马斯亮蓝法)
一、实验原理
蛋白质含量可以从它们的物理化学性质（如折射率、比重、紫外吸收等）测定而得知，或用化学方法（如定氮法、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应等）方法来测定。简便快速及灵敏的方法能给实验室工作带来诸多方便。标准Lowry（Folin-酚）法受К+、Mg++、EDTA、Tris、硫试剂及碳水化合物等干扰，较灵敏的双缩脲法测定受Tris、胺及甘油的干扰。
考马斯亮蓝G-250以两种不同颜色状态存在，即红色和蓝色，即其与蛋白质结合后由红色转变为蓝色，最大波长吸收亦从465nm转变为595nm，蛋白质与染料结合迅速，复合物可长时间分散在溶液中（约1小时）且有很高的消光系数，从而增加测定的灵敏度。此法可同时测定大量样品且易于自动化测定。
大量的去污剂，如SDS、Triton X-100及一些家用玻璃去污剂会给此法带来干扰，低量去污剂的干扰可用对照来排除。
二、仪器和试剂
1、主要仪器：100ul微量进样器，分光光度计，离心机，捣碎机
2、蛋白质试剂（考马斯亮蓝）：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%（w/v）磷酸，定容至1L。终溶液中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7%（w/v）乙醇及8.5%（w/v）磷酸。常温下可存放1个月。
3、标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白（BSA）（电泳纯）用0.15 mol?L-1 NaCl配制，配制1mg/ml标准溶液以制作标准曲线。
4、0.15 mol?L-1 NaCl
5、pH7.0磷酸缓冲液
三、实验步骤
1、蛋白质标准曲线的制作：
取BSA标准溶液（1mg/ml）各0、20、40、60、80、100ul于不同试管中（蛋白质含量分别为0、20、40、60、80、100ug），不足100ul的用0.15 mol?L-1NaCl 调至100ul。于以上试管中加入5ml蛋白质试剂，混匀。2min后各取2～3ml于3ml
2、未知样品蛋白质含量测定：
（1）样品中蛋白质的提取：称取绿豆芽（或其他材料）20.0g，加入20ml磷酸缓冲液，用高速组织捣碎机捣成匀浆，在4000r/min离心20min，取上清液，定容50ml。
（2）测定：吸取蛋白质提取液100ul（视蛋白质含量高低作调整，不足100ul 时用0.15 mol?L-1 NaCl调至100ul），加入5ml蛋白质试剂，混匀，2min后测定595nm 的吸收值，同样操作重复三次。
四、实验结果
在Excel绘制BSA蛋白质标准曲线，并求出标准线性方程。
以表格形式列出实验数据，取三次重复测得的OD595值的平均值，由标准线性方程求出提取液中蛋白质量，用下式计算出待测样品中的蛋白质含量。
蛋白质（mg?g-1）= 提取液的蛋白质量（ug ）×提取液总体积（ml）测定用提取液体积（ml）×组织重量（g）×1000
五、讨论分析
1、考马斯亮蓝法有哪些优点？
2、如何使用微量进样器？
实验四过氧化氢酶活性测定（氧量测定法）
一、实验原理
过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧。根据一定时间内放出的氧量来表示该酶活性的大小。
二、仪器与试剂
1、主要仪器：定量测定装置（铁架、量气管、漏斗、
Y形管、三角瓶、（短）指形管、胶管2条）、组织捣碎
机，离心机
2、试剂：3%H2O2，1/15 mol?L-1 Na2HPO4缓冲液。
三、实验步骤
1、提取酶液：
称取200g新鲜菜叶，切碎，放入组织捣碎机，加
入200ml 1/15 mol?L-1 Na2HPO4（pH7.7）捣成匀浆，以
4000 rpm转速离心15min，取上清液。
2、测定过程：
（1）调节测定装置：
向漏斗和量气管加水到相同水平，移动漏斗将
量气管水面调节在零点（或某一刻度），塞紧橡皮塞，
该刻度为记录的始点。检查是否漏气：上下移动漏斗，
如只能在某刻度找出水平位置，表示装置不漏气。
（2）反应：
吸取5ml酶液加入三角瓶中，另吸1ml 3%H2O2加入指形管内，用镊子将指形管放入三角瓶（不让倒下），塞紧瓶塞，三角瓶与量气管连通，摇动三角瓶使指形管倒下，H2O2与酶液接触，反应放出O2，立即记录反应开始时间，并不断摇动三角瓶。由于O2排出，量气管的水平下降，在限定时间读数，每20s进行一次读数，直至量气管的液面不再下降。读数时，移动漏斗使其水面与量气管水面一样平。
四、实验结果
1
2、计算结果
过氧化氢酶活性=
放氧量（ml）×酶液总体积（ml）
测定用酶液体积（ml）×样品重量（g）×反应时间（min）
= O2量（ml/g.min）
注：反应时间指由反应开始至反应终止的时间，放氧量为反应终止时放出的氧气总量。
五、讨论分析
1、实验操作过程中应注意哪些事项？
2、如何选择试材？
实验五酶促反应中的竞争性抑制
一、实验原理
抑制剂在化学结构上与底物类似，能与底物竞争酶分子的活性中心，并与之结合，从而抑制酶的活性，抑制程度取决于抑制剂与底物的相对比例。底物浓度不变，则抑制程度随抑制剂浓度增加而增加；反之，若抑制剂浓度不变，则抑制程度随底物浓度增加而减弱。这种由于相互竞争而引起的抑制作用，称竞争性抑制。
琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸，脱下的氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下，还原态的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝，从而引起非常明显的颜色变化反应，接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性越高，甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢，可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙二酸存在时，琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。
由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色，所以本实验用石蜡油封闭反应液，制造无氧的环境。
二、仪器和试剂
1、主要仪器：烧杯，滴管，指形管，离心机，组织捣碎机，恒温水浴锅。
2、材料：新鲜猪心
3、1/15 mol?L-1 Na2HPO4（pH 7.4）
4、1%琥珀酸，5%琥珀酸，1%丙二酸（琥珀酸、丙二酸用NaOH调正至pH7.4）
5、0.02%甲烯蓝，石蜡油
三、实验步骤
1、琥珀酸脱氢酶的提取
取新鲜猪心一个（100g），切碎，加100ml的1/15 mol?L-1Na2HPO4，放入组织捣碎机中捣烂成浆。然后在高速离心机上用3000 rpm离心20min，取上清液即为琥珀酸脱氢酶提取液。（各组共用）
2、竞争性抑制观察
取四支指形管，按下表依次加入各种液体（CK指形管中的酶液要事先煮沸10min），在指形管中加入酶液后，迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀，立即加入石蜡油封闭液体（加入石蜡油封闭液体后千万不可震动），以隔绝空气。于室温下静止观察变色情况。
四、实验结果
五、讨论分析
1、对比1号管与2号管之间、2号管与3号管之间变色时间的差异，并做出合理的解释（底物、抑制剂、浓度等）。
（1）1号管与2号管比较时间长短，解释原因。
（2）2号管与3号管比较时间长短，解释原因。
2、封石蜡后为什么不能震荡?
实验六氨基酸的薄层层析
一、实验原理
利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别使各成分以不同的程度分布在两个相中，其中一个为固定相，一个为流动相。当作为流动相的液体从由液体或固体组成的固定相的间隙中通过时，由于试样中的各组分在固定相和流动相之间分配系数不同，因而随着流动相的流动各组分彼此相互分离开。流动相一般由有机溶剂和待测物组成。固定相是利用某些固定物质（如氧化铝、活性碳等）具有的吸附性能，可将一些物质自溶液中吸附到它的表面。吸附力的强弱与吸附剂能吸附物质的性质有关。薄层层析是根据被分离物质的性质以适应吸附和分配两个原理把物质分开。把吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分离的样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析是在薄层上进行，所以称为薄层层析。
为了使所要分析的样品的各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺由于它们的吸附性能良好，是应用最广泛的吸附剂，硅藻土和纤维素则是分配层析中最常用的支持剂。在吸附剂或支持剂中添加了合适的粘合剂后再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板上。硅胶G就是已经加入石膏的层析用吸附剂，它可以把一些物质自溶液中吸附到它的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用
适当的溶剂系统展层就可以达到使不同物质分离的目的。
薄层层析优点：观察结果、显色方便，如薄层由无机物制成，可用腐蚀性显色剂；层析时间短；微量，0.1至数十微克样品均可分离，比纸层析灵敏度大10～100倍。若薄层铺得厚些，也可进行几百毫克样品的制备。由于这些原因加之操作方便，设备简单，薄层层析广泛应用于有机化学、生物化学、药物化学等各个领域。
二、仪器和试剂
1、主要仪器：离心机，烘箱，吹风机，研钵，层析缸及培养皿，漏斗，玻璃喷雾器，点样毛细管，层析玻板。
2、氨基酸标准溶液：色氨酸、丙氨酸、赖氨酸各0.05 mol?L-1，溶于10%异丙醇中。
3、展开剂：正丁醇：乙酸：水= 4 ：1 ：1（体积比）
4、显色剂：1%水合茚三酮的丙酮溶液
5、吸附剂：硅胶G
三、实验步骤
1、氨基酸的提取
取暗中萌发三天的水稻种子3～5g，放研钵中研碎，加入95%乙醇4ml，继续研磨提取5min，倒入离心管中离心15min（3000转/分），上清液即为氨基酸提取液，用胶头吸管小心吸入干燥的小瓶中待用。
2、薄层板的制备
称取2g硅胶G，放入研钵中，加蒸馏水5ml，研
磨2～4min，拌成稀糊状后，迅速均匀地倒在已备好
的干燥、洁净的玻板上（1min内完成），手持玻板在
桌上轻轻振动，使糊状硅胶G铺匀，然后置桌面上，
于室温下干燥过夜，上述2g硅胶G可制5×20cm薄
层板一块。制薄板时，研磨时间及加水比例是影响所
制薄板质量的关键。研磨时间太短（或加水过多）硅
胶G吸水膨胀不够，薄层易裂，不易铺匀；研磨时间
太长（或加水过少）硅胶G倒玻板上后，很快凝固，
也不易铺匀。
3、点样
距玻板一端2cm处为点样线，样点之间距离2cm。
用毛细管吸取提取液分次点于B点上，必须在第一滴样品干后再滴第二滴，样点扩散后的直径不超过2～3mm，滴加次数视氨基酸浓度而言。
以同样操作，将氨基酸标准溶液分别在A点上（3～4滴）。
在操作过程中，手必须干净，只能接触玻板非点样端边缘，不要对着薄板说话，以防唾液掉在板上。
样品滴加完后，将薄板置室温下风干，以备展层。为避免薄层层析时的“边缘效应”，可预先用刀片将薄层板上的薄层的左右两边各刮掉0.5cm。
4、展层
取干净的层析缸一只，皿中注入约0.5cm深度的展开剂，放入点了样的薄板后，密封层析缸，展开方式为上行法。
5、显色
待展开剂上升到距玻板前沿1cm处，将薄板取出，标好溶液前沿距离位置，用电吹风吹干，用玻璃喷雾器将显色剂均匀地喷在薄板上，注意要喷的细而均匀，不能有液滴。
待干后将薄板置60～80℃烘箱中显色5～15min，即可显出各种氨基酸的层析斑点，然后标出各色斑中心点。
四、实验结果
各种溶质因为分配系数不同，在两相分配的数量也不同，分配系数大的溶质在静止相中分配的数量大且多，随着有机溶剂向前移动的速度缓慢，而分配系数小的溶质在流动相中分配的数量较多，移动的速度也快，所以各种溶质在层析中由于移动的速度不同可以彼此分开。
移动速度一般用移动速率Rf表示。一定条件下，特定的物质有特定的Rf值（测量距离以原点或色斑的中心为界限）。
用尺量出原点（点样点）到溶剂前沿距离，量出原点到各色斑中心点的距离，并计算各色斑的Rf值。根据标准氨基酸的Rf值，判断待测液中的氨基酸种类。
Rf =
溶质移动距离
原点到溶剂前沿的距离
计算Rf值：
原点到溶剂前沿的距离：cm
标准氨基酸溶液中各溶质移动距离和Rf值
色氨酸：cm Rf值：
丙氨酸：cm Rf值：
赖氨酸：cm Rf值：
样品提取液：cm Rf值：
得出未知样品是何物？要求画出薄板图（做成功或失败的都要画出来）
五、讨论分析
1、制作硅胶板应注意哪些问题？如何制作一块合格的硅胶板？
2、显色过程中应注意哪些问题？
3、为什么点样时不要对着薄板说话？
4你做的板是否成功？能否准确计算Rf值？不成功的请分析失败的原因？
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时
二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题： （1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？ 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需采用间歇式方式进行操作？ 为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？ 防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！ 动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败） 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。 单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。 检测器：将单色器分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。 测量装置：通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光：200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定：其应用波长范围为200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定：用波长为400～850nm的可见光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
生物化学实验方法手册 Markus R Wenk National University of Singapore, Singapore Aaron Zefrin Fernandis National University of Singapore, Singapore A Manual For Biochemistry Protocols 2007,127pp. Paperback ISBN 978-981-270-066-7 Markus R Wenk等编 该书是生物医学研究手册丛书的第三卷，其前两卷分别是《初级哺乳动物细胞培养手册》和《生物医学研究中的显微镜技术》，后续还将推出《生物材料及骨架编织技术手册》和《知识产权管理手册》，这五卷均由世界科学出版社出版。 本手册共分为6章，各章内容分别是：1.蛋白纯化；2.蛋白分析；3.脂肪分析；4.哺乳动物细胞培养；5.显微镜学； 6.分析与鉴定。作者希望这本手册不仅仅是将各种生物化学实验方法的简单罗列，更希望读者能够通过这本手册掌握生
物化学实验技巧进而理解这些方法背后的原理。这本手册将给广大读者带来一个全景式的生物化学，尤其对于那些初次踏入生物化学领域的读者，选择这本手册会是一个不错的开始。 这本手册的编者都是科研一线人员，所编著的方法实用且前沿，并且详尽地介绍了生物化学中可能会使用的实验方法。 本手册适合从事生物化学、分子生物学的相关人员，在实验中它是一本不错的参考工具。 程恩隽，博士生 (国家纳米科学中心） Chengenjun, DoctoralCandidate (National Center for Nanoscience and Nanotechnology ,China)
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室
内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)
实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
参考资料 推荐教材： 王镜岩、朱圣、徐长法主编，《生物化学》（第三版）（上、下册），高等教育出版社 参考书目： 1、郭蔼光，《基础生物化学》，高等教育出版社 2、罗纪盛、张丽萍等合编，《生物化学简明教程》（第三版），高等教育出版社，1999 3、郑集，《生物化学》，高等教育出版社 5、赖炳森主编，《生物化学》，中国医药科技出版社 6、张洪渊主编，《生物化学教程》（第三版），四川大学出版社，2002 7、张楚富，《生物化学原理》，高等教育出版社 8、[澳]P.W.库彻等，《生物化学》（第二版），科学出版社 9、古练权，《生物化学》，高等教育出版社 10、[美]D.沃伊特等，《基础生物化学》（上、下册）
11、Lehningger AL，Nelson DL，and Cox MM. Principles of Biochemistry(2nd ed). Worth，Publishers. Inc. 1998 12、Stryer L. Biochemistry(Third Edition). W. H. Freerman and Company/New York, 1988 13、Watson J D, Hopkins N H, Roberts J W et al. Molecular Biology of Gene (fourth edition). The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987. 10. 徐晓利、马涧泉主编，医学生物化学，人民卫生出版社，1998 11. 周爱儒、查锡良，生物化学（第五版），人民卫生出版社，2001 12. 张龙翔、张庭芳、李令媛主编，生物化学实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997 13. 李建武等，生物化学原理和方法，北京大学出版社，2000 14、于自然、黄泰熙，现代生物化学，化学工业出版社，2001
生物化学实验 一、糖的颜色反应及还原作用 实验一：糖的颜色反应 实验1.1 莫氏实验 一、目的 掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。 二、原理 糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应”，其反应如下图： 利用这一性质可以鉴定糖。 三、实验器材 1、棉花或滤纸。 2、吸管1.0ml(*4)、2.0ml(*1)。 3、试管1.5*15cm(*4)。 四、实验试剂 1、莫氏试剂：称取α-萘酚5g，溶于95%乙醇并稀释至100ml。此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。 2、1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml. 4、1%淀粉溶液：讲1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。最后以沸蒸馏水稀释至100ml。 五、操作 于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少1，摇匀，讲试管2滴1ml水中）。然后各加莫氏试剂许纤维素（棉花或滤纸浸在倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。 六、注意事项 1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫酸加入的方式应保持一致。 2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。 3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。 思考题： 1、解释α-苯酚反应的原理。 2、用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？ 试验1.2 塞氏试验