第六章毛细管柱气相色谱法 第一节毛细管气相色谱仪 现代的实验室用的气相色谱仪大都既可用作填充柱气相色谱又可用作毛细管色谱仪。毛细管色谱仪应用范围广，可用于分析复杂有机物，如石油成分，天然产物，环境污染，农药残留等。图6-1是毛细管气相色谱仪示意图，与填充柱色谱仪比，毛细管色谱仪在柱前多一个分流-不分流进样器，柱后加一个尾吹气路。由于毛细管柱体积很小，柱容量很小，出峰快，所以死体积一定要小，要求瞬间注入极小量样品，因此柱前要分流。对进样技术要求高，对操作条件要求严。尾吹的目的是减小死体积和柱末端效应。毛细管柱对固定液的要求不苛刻，一般2-3根不同极性的柱子可解决大部分的分析问题。毛细管柱一般配有响应快，灵敏度高的质量型检测器。 高分辨率毛细管气相色谱仪的三要素是：要选择好的毛细管柱及最佳分析条件；按样品选择合适的毛细管进样系统；选择高性能的毛细管气相色谱仪。 图6-1 毛细管气相色谱仪示意图 第二节毛细管色谱柱 1957年，美国科学家Golay提出毛细管柱的气相色谱法。Golay称毛细管色谱柱为开管柱。因这种色谱柱中心是空的。毛细管柱是内径为Φ0.1-0.5mm左右、长度为10-300m的毛细柱，虽然每米理论板数约为2000-5000，与填充柱相当，但由于柱子很长，总柱效可高达106。 一、毛细管色谱柱组成 通常来说，一根毛细管色谱柱由管身和固定相两部分组成。管身采用熔融二氧化硅（熔融石英)，通常在其表面涂上一层聚酰亚胺保护层。涂层后的熔融石英毛细管呈褐色：但是涂层后的毛细管之间
的颜色却不尽相同。色谱柱的颜色对于其色谱性能没有什么影响。经过持续的较高温度处理后．聚酰亚胺涂层管的的温度会变得比以前更深：标准的聚酰亚胺涂层管熔融石英管的温度上限为360℃，高温聚酰亚胺涂层管的温度上限为400℃。固定相种类很多，大部分的固定相是热稳定性好的聚合物，常用的有聚硅氧烷和聚乙二醇。另外还有一类是小的多孔粒子组成的聚合物或沸石(例如氧化铝、分子筛等)。 熔融石英管的内表面会用一些化学方法进行处理，尽量的减小样品和管壁之间可能存在的相互作用。所用的试剂和处理方法一般是依据将要涂在内壁上的固定相种类来确定的。硅烷化处理则是最为常用的处理方式，使用硅烷类的试剂和管壁内表面上的硅基醇基团进行反应，使其变为甲基硅烷基或苯甲基甲基硅烷基。 当实验要求更高的使用温度时，我们可以来用不锈钢毛细柱来代替熔融石英毛细柱。不锈钢毛细柱在使用温度(耐高温）及日常维护（不易折断等)的性能和指标上都优于熔融石英毛细柱。但是不锈钢材质的惰性没有熔融石英好，它可以和许多的化合物相互作用，产生反应。所以通常可以用化学方法对其进行处理，或者是在它的内壁再涂上薄薄的一层熔融石英，以增加不锈钢管的隋性：经过适当处理后，不锈钢毛细柱的惰性与熔融石英毛细柱的不相上下。 二、毛细管色谱柱固定相 （一）气-液色谱固定相 1．聚硅氧烷 聚硅氧烷有优良的稳定性, 用途广，是目前最为常用的固定相。标准的聚硅氧烷是由许多单个的硅氧烷重复联接构成,每个硅原子与两个功能基团相连，功能基团的类型和数量决定了固定相总体类型和性质,常见的四种功能基团为甲基、氰丙基、三氟丙基和苯基。最基本的聚硅氧烷是由100%甲基取代的。当有其他种类的取代基出现时，该基团的数量将由一个百分数来表示。例如：5％二苯基—95％二甲基聚硅氧烷表示其包含有5％的苯基基团和95％的甲基基团。“二”是表示每个硅原子包含有两个特定基团，但当两个特定基团完全相同时，我们有时也会省略这种叫法。如果甲基的百分数没有表征，则表示它的含量可能是100％(如50％苯基—甲基聚硅氧烷表示甲基的含量为50％)。有时我们可能对氰丙基苯基的百分含量产生错误的理解，如14％氰丙基苯基—二甲基聚硅氧烷表示的是其含有7％氰丙基和7％苯基(另有86％的甲基)，因为一个氰丙基和一个苯基连接于同一个硅原子上，所以14％是一种加和的表征方式。 我们有时会用低流失来表征一类固定相。这一类固定相是在硅氧烷聚合物中链接一定数量的苯基或苯基类的基团，通常我们称之为“亚芳基”。由于它们的加入，聚合物的链接变得更加坚固稳定，保证了在较高温度时，固定相不会产生降解。也就是说，进一步降低了色谱柱的柱流失，提高了色谱柱的使用温度。与原始的非亚芳基类型的固定相相比，亚芳基固定相不仅拥有相同的分离指数，而且在色谱柱的维护等方面也有许多的调整（例如SE-52和SE-54）。尽管同类普通型和低流失型固定相的分离性能相同或极为相似，但是在某些方面还有微小的区别。另外，我们也使用一些独特低流失固定相。 2．聚乙二醇 聚乙二醇是另外一类广泛应用的固定相。有时我们称之为“WAX”或“FFAP”。聚乙二醇不像聚硅氧烷那样有多种取代基团，它是100%固定基质的聚合物。相对于聚硅氧烷，聚乙二醇固定相色谱柱的寿命较短，而且容易受温度和环境（有氧环境等）的影响。另外，聚乙二醇固定相在相应的GC实验条件下需保持液态。但由于其独特的分离性能，聚乙二醇仍是我们常用的固定相之一。
使用注意事项： 色谱柱在使用过程中主要应该注意的是： 1、每根色谱柱都有一定的压力范围（说明书有说明），一般要在合适的压力下进行分析使用。 2、色谱柱在制作过程中是在一定的压力下按一定的方向添装的，因此要求在使用时要按照规定的方向进行连接。如果不小心装反了也不用着急，一般没有超压使用应该影响不是很大。但如果一直使用了很长时间如半年或1-2年，建议你就一直这样使用下去。 3、分析样品和流动相一定要过滤干净，不要让对柱有害的物质通过色谱柱。 4、增加一根保护柱或柱前保护对分析柱是有好处的。 5、色谱柱能不能反冲，在第2中提到了一点，一般咨询厂家时都会告诉你不能反冲，主要是担心反冲会使柱中的填料松散，那样整根柱子就报废了。这一点应该很好理解，就是在一定压力一定方向将填料填充压紧，如果反向冲操作不当很容易就会使原来压紧的填料松散开，这是无法弥补的损坏。但在具体使用中，就我所知可以在压力低一些，也就是流量小一些的条件下进行反冲，只要没有影响到柱内的填料，将堵塞的物质冲出可以有效降低系统压力，改善柱效。 应用： 凝胶色谱柱主要进行大分子样品分子量与分子量分布的检测，如果样品分子量差异较大，应该也可以进行分离。这类样品可以作为宽标的标准样品进行标准曲线的建立。 另外，凝胶色谱柱检测的样品有油性的高分子物质，如树脂类等，还有水溶性的高分子物质如糖类等。 对于不同厂家的色谱柱要说好坏之分，我认为和以上很多内容都有关系，样品是否干净，流动相是否干净，人员有没有误操作，有没有保护柱，每天工作量大小等很多影响因素。总体来说应该差不多。 凝胶色谱柱（水性）的保养与保存： 凝胶色谱柱需要注意防止微生物的生长，被微生物污染后的色谱柱将无法重现原来的分离效果与柱效，严重会使凝胶色谱柱报废。 为了抑制微生物的生长，可以使用低温保存。值得注意的是温度不能过低，以免冻结，为了不冻结可以提高保存时介质的离子强度。 常用的保存抑菌剂有：0.02%叠氮钠、0.002%洗必泰（hibitane，双氯苯双胍己烷）、0.01% -0.02%三氯丁醇、0.1mol/l氢氧化钠。 也可以用一定量有机溶剂来保存，如20%乙醇。 值得注意的是，无论何种保护方式，都必须根据色谱柱的特点来进行。 液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 一、液相色谱柱的安装： 1、液相色谱柱的结构： a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)
手性色谱柱知识介绍 手性色谱柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。。在手性拆分中，温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力，但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。迄今为止，尚没有一种类似十八烷基键合硅胶（ODS）柱的普遍适用的手性柱。不同化学性质的异构体不得不采用不同类型的手性柱，而市售的手性色谱柱通常价格昂贵，因此如何根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。 根据手性固定相和溶剂的相互作用机制，Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系： 第1类：通过氢键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。 第2类：既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。 第3类：基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。这类手性色谱柱中最典型的是由Armstrong 教授开发的环糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色谱柱也属于此类。 第4类：基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankov开发的手性分离技术，也称为手性配位交换色谱（CLEC）。 第5类：蛋白质型手性色谱柱。手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用实现。 但由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多，此分类系统有时很难将一些手性柱归纳进去。因此参考Irving Wainer的分类方法，根据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种： 刷（Brush）型或称为Prikle型 纤维素（Cellulose）型 环糊精（Cyclodextrin）型 大环抗生素（Macrocyclic antibiotics）型 蛋白质（Protein）型 配位交换（|Ligand exchange）型 冠醚（Crown ethers）型 刷型： 刷型手性色谱柱的出现和发展源于Bill Prikle及其同事的卓越工作。六十年代，Bill Prikle将手性核磁共振中的成果运用到手性HPLC固定相研究中，通过不断实践，发明了应
毛细管柱的老化 检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等。检查气体过滤器和进样垫，保证载气和检测器的通气畅通，如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。 将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端小心切平，切面要平滑整齐。将色谱柱连接于进样口上。 老化中应注意载气的流速不易过大，否则会破坏均匀的液膜。 一般非极性柱在250℃以下老化使用，可用普通氮气，在250℃以上高温使用时，必须使用高纯氮气或普通氮气经脱氧后使用，以延长柱子的使用寿命。对极性柱，尤其是PEG类（聚乙二醇）、FFAP、含氰基的固定液（OV225、?OV275），一定要用高纯氮气（最好高纯氮气经过脱氧，）99.99%否则，固定液很快被氧化，以致不能使用。 色谱柱在进样口中插入的深度应根据所使用的GC仪器不同而定，正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，即处于进样针穿过隔垫完全插入进样口后针尖与色谱柱入口相距1～2cm 如果仪器已经较长时间没使用，在开机前要通载气30~40分钟，使系统中可能有的空气全部被排除后才能开机升温。 老化柱子时接上进样口端，断开检测器端，初温50度，保持通载气30分钟，然后以5度/分钟升到老化温度，保持4-8小时就可以。 （老化温度为比该柱子的最高使用温度低10-30度，但是一定不能超过色谱柱的温度上限否则极易损坏色谱柱；比作样分析温度高10-30度的温度） 各种固定液因其性质和生产厂家不同而最高使用温度有所不同，所以要注意毛细管柱的说明，生产毛细管柱的厂家应注明最高使用温度。 请参考产品附带的说明书，或者和我们联系！！！ 如果你接的是MS检测器，最好先不要使柱子出口进入质谱。 当达到老化温度后，记录并观察基线，初始阶段基线应持续上升，在达到老化温度后5～10min开始下降，并且会持续分钟，当达到一个固定的值后就会稳定下来。 --------------------------------------------------- 如果柱子受到污染, 可在推荐的最高色谱柱温度低20 度的条件下，老化柱子。
毛细管气相色谱柱的选择方法 【关闭本页】【返回首页】【发布时间2004-1-14】 一、固定相的选择 1．如果不知道使用何种固定相，可以从非极性柱或弱极性柱如SPB-1或SPB-5开始试用，如效果不好，再按极性渐强的顺序选用中等极性直至高极性柱逐一尝试，直到有较令人满意的分析结果即可确定适用的柱极性。 2．低流失（“ms”）色谱柱通常更为惰性，有更高的温度上限,适用于MS检测器。3．使用能够提供满意的分离度和分析时间的极性最小的固定相，非极性固定相比极性固定相具有更长的寿命。 4．要使用和被分析物极性相近的固定相，使用这一选择方法常常是有效的，但是使用这一方法并不总是能找到最好的固定相。 5．如果被分离混合物具有不同的偶极或氢键力，改变使用具有不同偶极或氢键力（不一定要更大）的固定相后，会出现其他共流出物，所以新的固定相不一定提供更好的总分离度。 6．如果可能，要避免使用含有能使选择性检测器产生高响应值功能团的固定相，例如含有氰丙基的固定相，用NPD会产生不成比例地增大基线高度（由于柱流失）的现象。7．SPB-1或SPB-5，SPB-50，SPB-1701，和SUPELCOWAX 10以最少数量的色谱柱能覆盖最大范围的选择性。 8．PLOT柱用于在高于室温的柱温下来分析气体样品。 二、色谱柱直径的选择 1. 当需要有高柱效的色谱柱时应使用0.18-0.25mm的色谱柱。0.18mm的色谱柱很适合于泵容量低的GC/MS系统。小内径柱的容量最小而且需要最高的柱头压力。 2. 当需要样品容量大时就要使用0.32mm内径的色谱柱。与0.25mm内径柱相比， 0.32mm内径柱对不分流进样或大体积（>2μL）进样时早流出的色谱峰有较高的分离度。 3. 只有配备大口径直接进样口时，才使用0.53mm内径的色谱柱，它特别适合于高载气流速的应用，例如吹扫捕集，顶空进样。0.53mm内径色谱柱在恒定的液膜情况下具有最高的样品容量。 三、色谱柱柱长的选择 1. 当不知道最佳柱长时，尝试使用25-30m长的色谱柱。 2. 10-15m长的色谱柱适合于分离含有很容易分离的溶质混合物，或者分离为数不多的溶质混合物，较短的柱长用于直径很小的色谱柱，以便降低柱头压力。 3. 当使用其他方法（小内径柱，不同的固定液，改变柱温）不能达到分离度时，就使用50-60m长的色谱柱。它最适合于分离含有多组分的复杂混合物，长柱需要的分离时间长，费用也高。 四、色谱柱膜厚的选择 1. 0.18-0.32mm内径的色谱柱，其平均或标准膜厚在0.18-0.25μm，用于绝大多数的分析。 2. 0.45-0.53 mm内径的色谱柱，其平均或标准膜厚在0.18-1.5μm，用于绝大多数的分析。 3. 厚液膜色谱柱用于保留和分离挥发性物质（如轻溶剂，气体）。厚液膜色谱柱有更高的惰性，其柱容量也高；但厚液膜色谱柱具有较高流失性，使用温度上限也有所下降。 4. 薄液膜色谱柱用于降低高沸点物质和高分子量物质（如甾体，三甘油酸酯）的保留时间，并具有低流失性的特点；但薄液膜色谱柱的惰性较差，且柱容量较低。
手性色谱柱是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。 要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。 对于新的实验室要开展手性方面的研究，但不知怎么配置手性柱才能最好的，最大范围的对目标化合物取得较好的分析结果，下面我们来给您一些建议吧。 （加个表情或者箭头） 我把常用手性柱分成了五类，具体情况如下，建议每一类选择其中一种。
第一类：AD-H和IG，两个型号分离范围都比较广，区别是AD-H是涂敷型的，只能用于正相体系，IG是键合型的，正反相体系都适用。相对而言，AD-H这个型号是所有手性柱中的明星柱，所以建议选择AD-H型号。 AD-H IG 第二类：OD-H和IC,同理，OD-H是涂敷型的，只能用于正相体系，IC是键合型的，正反相体系都适用。其中IC对于含有羧基的酸性手性化合物分离性能更优异一些，并且第一类选择了涂敷型，所以这个建议选择键合型IC型号。 OD-H IC 第三类：IBN-5和AS-H，AS-H是四大金刚柱之一，比较经典，IBN-5是最近两年上市的，他跟其他型号互补性较强，当然这样也造成其应用范围比较窄的缺点，比如：有100种消旋体，AS-H或者AD-H能分离其中的85种，但对于剩下的15种分离效果不是很好，IBN-5可能对剩下的15种分离效果不错。所以这一类如果整体考虑，可以选择IBN-5，如果单独考
特别注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！！柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望对大家能有所帮助。 1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 3、关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。这个我分离的次数很少，一般都是通过紫外灯查看的。 4、关于湿法、干法上样 湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用2.5 L的塑料桶装的。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，当然比较忙的时候我是不回收的，太费事了。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越
毛细管气相色谱法条件及定量分析 指导老师：李建国 实验人：王壮 同组实验：陆潇、戈畅 实验时间：2016.4.18 一、实验目的 1.熟悉色谱分析的原理及色谱工作站的使用方法； 2、掌握气相色谱仪操作方法与氢火焰离子化检测器的原理； 3.用保留时间定性；用归一化法定量；用分离度对实验数据进行评价。 二、实验原理 不同组分在同一分离色谱柱上，在相同实验条件下有不同的保留行为，其保留时间的差异可以用来定性分析，每一组分的质量与相应色谱峰的积分面积成正比，因此可以公式计算，用归一化方法测定每一组分的质量百分含量。 1122100A is i i A A A s s ns n f A w f A f A f A =?++???+％ 本实验是用气相色谱测定乙酸乙酯、乙酸丁酯及其混合试样，检测器用FID 。用色谱软件进行谱图处理和定量计算，让学生掌握用已知物对照定性、用归一化法测定混合物组分定量的实验。 混和试样的成功分离是气相色谱法定量分析的前提和基础，衡量一对色谱峰分 离的程度可用分离度：12121()2 R R t t R W W -=?+，式中1R t 、2R t 和1W 、2W 分别指两组分的保留时间和峰底宽度，R=1.5时两组分完全分离，实际中R=1.0(分离度98%)即可满足要求。 三、仪器与试剂 仪器：GC7890F 型气相色谱仪、氢火焰离子化检测器（FID ）、氮气钢瓶、空气钢瓶、氢气发生器，微量注射器、3mm x 200cm 的10% SE-54不锈钢分离柱。GC5400型气相色谱仪、空气发生器、氮气发生器、氢气发生器，微量注射器、15m 毛细管分离柱。 试剂：乙酸乙酯、乙酸丁酯标准试样及其未知混合试样。 四、实验内容 1．按操作说明书使色谱仪正常运行，并调节至如下条件： 柱温：110C ? 检测器温度：120C ? 气化温度：120C ? 载气、氢气和空气流量分别为30、50和200mL/min 。 2．分别改变柱温至80、90、100、110、120C ?。每改变一次柱温，注入0.5L μ混合酯试样，记下保留时间，观察其出峰顺序和分离情况。
优化手性化合物的分离方法时，如何增加分离选择性？ 正相手性色谱柱上增加分离度的方法有：降低流动相中醇的含量、降低柱温、更换流动相中醇的种类、更换手性柱。 建立手性化合物的分离方法时，选定了正相手性柱之后，如何选择流动相？ 流动相首选正己烷和异丙醇的混合溶液，根据样品的酸碱性决定是否添加酸碱性添加剂。如果是中性样品则不需要添加添加剂，如果是酸性样品需要添加三氟乙酸或乙酸，如果是碱性样品需要添加二乙胺，添加剂的量一般为0.1 %。流动相中醇的含量一开始可以使用30%，根据样品出峰的快慢和分离度再调整醇的含量。流动相中醇的种类一般使用异丙醇，也可以使用乙醇。 建立手性化合物的分离方法时，如何选择手性柱？ 根据文献或者参考大赛璐公司的《应用指南》中结构类似物的分离方法，选择手性柱；另外可以寄少量消旋品，大赛璐公司能免费为您选择分离最佳的手性柱。 手性柱使用完了之后如何清洗保存？ 正相手性色谱柱如果使用正己烷和醇类的混合流动相之后，只需要用正己烷/异丙醇=90/10(v/v)的保存溶液冲洗30 min即可。反相手性色谱柱如果使用了水溶液和乙腈的混合流动相之后，只需要用水/乙腈=70/30(v/v)的保存溶液冲洗30 min即可。 CROWNPAK? CR(+)柱流动相中甲醇含量有要求吗？ CROWNPAK? CR(+)柱流动相中甲醇含量为0％-15%，甲醇的含量一旦超过15%，CROWNPAK? CR(+)柱会被损害。 正相手性柱进了水后，柱子会不会损坏？ 正相手性色谱柱（例如AD-H、AS-H、OD-H、OJ-H）一旦进了水，柱压会升高，但是只要柱压不超过柱压上限，柱子就不会损坏。只需用无水乙醇低流速(0.1-0.2 ml/min)将水全部充分置换出来，再用正相流动相低流速(0.1-0.2 ml/min)将乙醇全部置换出来就能继续使用该正相手性色谱柱。 样品的保留时间漂移，可能是哪些原因，如何解决？ 1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定。 2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等。 3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。该情况在MA（+）柱上出现较多。 4、酸碱性的样品，有时在中性条件下能分开，峰形尚可，但保留时间会漂移；加入相应的酸碱添加剂即可。 5、流动相污染。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。需清洗色谱柱，流动相和样品溶液尽量现用现配。 （小极性样品的溶解）正相方法分析布洛芬时，有时峰形难看甚至达不到基线分离，什么原因？如何解决？ 该方法为Hexane/IPA=99/1，极性很小；若样品不是溶解在流动相中，则结果很可能达不到基线
手性化合物色谱分析方法开发(一) 1、概述 首先，这里所说的手性化合物是指含有一个或多个不对称碳手性中心的对映或者非对映异构体，而不包含氮磷等含有孤电子对的手性中心化合物。不对称性碳原子，需要具有四个不同的取代基，空间上形成不对称四面体，对映异构体之间形成镜面对称，就像人的左右手一样，不能够完全重合，如下图1所示。 Fig.1Diagram for enantiomers 对映异构体具有不同的使偏振光旋转的能力，据此对映异构体可以分为左旋与右旋。在非手性环境下，对映异构体具有相同的化学性质(化学反应特性)，相同的物理性质(如溶解度、熔点、沸点、熵焓等)以及同样的色谱保留行为等。但在手性环境中对映异构体之间的某些性质则表现出不同，这也是手性化合物进行拆分的基础。 对映异构体需要对内消旋体与外消旋体进行区分，如下图2所示。左右两个示意化合物结构的相同点在于均具有两个手性中心，不同点则在于左图的两个手性碳原子之间不存在对称平面或轴，而右图则存在对称平面。因此在左图中，1S,2R与1R,2S为外消旋体；右图中1S,2R与1R,2S为内消旋体。
Fig.2Name and distinguish between mesomer and racemate 对于手性化合物的拆分，规模比较大的时候，可使用其他手性试剂(如酒石酸钠)与待拆分的化合物形成非对映异构体，然后根据非对映异构体之间具有不同的物理化学性质，进行相应的分离单元操作。而在分析实验室中，一般是采用色谱法进行拆分，其中包括使用手性固定相法以及在流动相中添加手性流动相形成手性拆分环境的方式。其中手性固定相拆分法包括气相色谱以及液相色谱。 对于气相色谱拆分手性化合物，其拆分选择性主要取决于所使用的手性固定相的种类以及色谱分离的温度。一般气相用于低沸点的手性化合物的拆分，对于有机酸碱等极性手性化合物的拆分，一般需要先进行柱前衍生化处理，使之形成相应的酯或者酰胺。用于气相手性拆分的手性固定相均为环糊精衍生物类，包括β以及γ环糊精，α环糊精比较少；其最高耐受温度不会超过220℃，而且分离温度超过120℃的时候，固定相的手性选择性开始降低；超过200℃的时候，固定相的手性选择性几近与无。 对于液相色谱而言，起主要拆分选择性作用的既包括手性固定相也包括流动相的选择，而且液相色谱可以使用正相洗脱模式，反相洗脱模式，也可以使用极性洗脱以及极性离子洗脱模式；可以等度也可以梯度。最重要的是，色谱柱的类型要比气相色谱手性固定相多的多，其中就包括多糖类衍生物类手性固定相、环糊精及其衍生物类手性固定相、糖蛋白类手性固定相以及大环内酯抗生素类以及冠醚类手性固定相等。此外，液相色谱拆分法可以对样品进行回收而且也可以用于对映异构体的制备，气相色谱法则不能方便的对对映异构体进行制备。
毛细管气相色谱柱的使用及常见故障分析 王波 （安徽省淮北市农业环境监测保护站淮北235000） 摘要根据多种毛细管气相色谱柱在国内外多种品牌的气相色谱系统的实际应用情 况，结合与其相关的文献资料，对毛细管气相色谱柱的使用及常见故障进行专业、细致 的分析与研究。 关键词气相色谱毛细管柱常见故障 现在的气相色谱系统中，毛细管色谱柱已被广泛的应用。大部分的检测工作可能只需几根柱子（OV-1、PEG-20M、OV-210）即可很好的完成，特别是大口径（0.53mm）柱的使用已逐步替代填充柱。掌握毛细管气相色谱柱的正确使用的方法，以及在其使用过程中故障处理的方法是非常必要的。 1 毛细管色谱柱的安装 在整个毛细管气相色谱中，柱子的安装尤为重要，柱子安装的好坏直接影响到检测结果。 1.1 毛细管柱与进样器的连接 对于分流进样，毛细管柱的入口端一定要伸过分流进样器的分流出口（见图1a），就是使毛细管柱的入口处于载气的高流速区域。如果毛细管柱的入口在分流进样器的分流出口以下（见图1b），处于载气的低流速区域，得到的色谱图就不理想，所以必须将毛细管的入口伸过分流进样器的分流出口，这样才会得到尖锐的峰形。对于分流/ 不分流进样，毛细管的入口应接到进样器的底部（见图1c），这样可以使汽化管中的样品完全进入柱子，也不会出现气流清洗不到的“死区”。 对于有些有特殊要求的气相色谱，毛细管气相色谱柱与进样器的连接，可以按仪器使用说明书的要求进行安装。 1.2 毛细管色谱柱与检测器的连接 在毛细管气相色谱柱连接到检测器之前，先接通载气，看一下柱子的出口是否有载气通过，（将柱子的出口浸入乙醇中看是否有气泡出现）如果没有载气从柱子出来，说明柱前的系统中有的地方漏气或柱子堵塞，应找出原因加以解决。然后将柱子的未端尽可能的伸到检测器（FID）的喷嘴以下的1~2mm 处，并使柱子的出口处于气流的最高流速区域（即氢气引入口以上），如果柱子不能直接伸到检测器的喷嘴下1~2mm 处，但必须伸到尾吹气入口的上部使柱子的末端处于气流的高速区域。
手性色谱柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。 这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。 在手性拆分中，温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力，但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。 迄今为止，尚没有一种类似十八烷基键合硅胶（ODS）柱的普遍适用的手性柱。不同化学性质的异构体不得不采用不同类型的手性柱，而市售的手性色谱柱通常价格昂贵，因此如何根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。 根据手性固定相和溶剂的相互作用机制，Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系： 第1类：通过氢键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。 第2类：既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。 第3类：基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。这类手性色谱柱中最典型的是由Armstrong教授开发的环糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色谱柱也属于此类。 第4类：基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankov开发的手性分离技术，也称为手性配位交换色谱（CLEC）。
手性分析经验谈 关于手性化合物、手性分析、手性填料和手性柱，现在的理论很多，讲的也比较复杂，我看了很多也不是特别明白，做分析三年多，分过的手性化合物最少也有几千种，拿到手里的消旋体几乎没有分不开的，没用到什么理论，主要都是经验，这里还是拣最实用的来讲。 手性分析可以使用普通的色谱柱，需要流动相中添加手性分离试剂，也可以直接用固定相为手性填料的手性色谱柱，前者使用较少，大家更多的是使用商品化的手性色谱柱。 手性分析包括气相和液相两种，这个主要和样品的物理性质有关系，现在的手性化合物绝大多数都不能做气相，所以气相手性色谱柱无论从数量还是质量上来讲都不能与液相手性色谱柱相提并论。 一、手性柱 手性分离最重要的是选择一根好的手性柱，说到手性柱就不得不提大赛璐，做手性分析的都知道，大赛璐的手性柱目前市场占有率最高，大家最熟悉的可能是OD- H，很多文献中都有报道。大赛璐公司最初有四种填料，结构类似，对应的色谱柱分别是OD、AD、OJ和AS，粒径10um，后来填料粒径变为5um，就是卖的最多、使用范围最广的柱子，号称四大金刚，分别是OD-H、AD-H、OJ-H和AS-H，在柱子名称后边加“-H”，意思应该是高效，这些柱子都只能做正相使用，为了在反相色谱中使用开发的柱子在相应的色谱柱名称中添加了一个“R”，上述色谱柱都属于涂覆型填料，不耐溶剂，使用起来受样品溶解性的限制，最近又开发了键合相手性柱，可以使用几乎所有的常见溶剂做流动相，新的溶剂还提供了新的选择性，进而提升了色谱柱的分离能力，主要是IA、I B和IC，其中IA对应AD-H，IB对应OD-H，IC是新开发的填料。和反相柱的发展趋势一样，大赛璐的手性柱也通过减小粒径来获得更高的柱效，最新的手性柱填料粒径是3um。另外大赛璐还有其它一些手性色谱柱，但是远不及上述几种。 关于大赛璐手性柱的详细资料官方网站上讲的很详细，大家有兴趣可以去看，这里主要讲我的使用经验。最近大赛璐公司的销售和技术曾经来过我们公司做讲座，因为我们先后买了他们三四十只手性柱，一直是自己摸索着使用，理论上的东西懂得很少，非常希望专家的能给我们提供指导，提升我们的技术水平，这个讲座的ppt网上流传的很多，对初学者来讲确实非常不错，但是专家的水平让我们实在不敢恭维。我们买了几十只手性色谱柱，但是型号相对很少，平时几乎只用两只色谱柱：AD-H和IC，但是拿到手里的手性化合物除去溶解性和紫外吸收的原因之外，几乎所有的样品都能用这两只色谱柱分开，我们主要的手段是在流动相上下功夫，通过流动相的调整来达到只用一两只柱子去解决遇到的所有手性分析问题，而大赛璐的专家讲座时给我们提供的思路是流动相变化相对较少，更多的是分不开就换柱子。细想一下也不难理解，厂家手里最不缺的就是柱子，为了分析一个样品他们可以试用所有型号的手性柱，但是对我们用户来说，一只柱子动辄一两万，相信没有哪个用户能有厂家那样的魄力和实力，一下子拿出那么多型号的手性柱来为一个样品的分离做筛选。 二、样品前处理 说到手性分析，样品的前处理非常重要。首先是消旋体样品的普通液相纯度问题，样品的纯度低了，看到手性柱上分离开的几个峰让人无从判断究竟对映异构体有没有分离开，分离开的几个峰哪个是杂质峰哪个是对映异构体的峰，所以样品的纯度要尽量的高，一般我们的要求是样品的纯度能达到90%以上，纯度低的样品需要做进一步的纯化。关于对映异构体峰的判断，现在比较好的手段是使用旋光检测器，在色谱图上可以直接看到分离开的两峰吸收一正一负，再有就是使用DAD检测器，通过看两峰的紫外吸收是否一致来做判断。 样品前处理的另外一项是稀释问题，这个问题最容易被忽视，处理不好会直接导致实验失败。我们都知道反
第二章气相色谱柱 第一节气相色谱柱的类型 气相色谱法（gas chromatography, 简称GC）亦称气体色谱法，气相层析法。其核心即为色谱柱。 气相色谱柱有多种类型。从不同的角度出发，可按色谱柱的材料、形状、柱内径的大小和长度、固定液的化学性能等进行分类。色谱柱使用的材料通常有玻璃、石英玻璃、不锈钢和聚四氟乙烯等，根据所使用的材质分别称之为玻璃柱、石英玻璃柱、不锈钢柱和聚四氟乙烯管柱等。在毛细管色谱中目前普遍使用的是玻璃和石英玻璃柱，后者应用范围最广。对于填充柱色谱, 大多数情况下使用不锈钢柱，其形状有U型的和螺旋型的，使用U 型柱时柱效较高。按照色谱柱内径的大小和长度，又可分为填充柱和毛细管柱。前者的内径在24mm，长度为110m左右；后者内径在，长度一般在25100m。在满足分离度的情况下，为提高分离速度，现在也有人使用高柱效、薄液膜的10m短柱。 根据固定液的化学性能，色谱柱可分为非极性、极性与手性色谱分离柱等。固定液的种类繁多，极性各不相同。色谱柱对混合样品的分离能力，往往取决于固定液的极性。常用的固定液有烃类、聚硅氧烷类、醇类、醚类、酯类以及腈和腈醚类等。新近发展的手性色谱柱使用的是手性固定液，主要有手性氨基酸衍生物、手性金属配合物、冠醚、杯芳烃和环糊精衍生物等。其中以环糊精及其衍生物为色谱固定液的手性色谱柱，用于分离各种对映体十分有效，是近年来发展极为迅速且应用前景相当广阔的一种手性色谱柱。 在进行气相色谱分析时，色谱柱的选择是至关重要的。不仅要考虑被测组分的性质，实验条件例如柱温、柱压的高低，还应注意和检测器的性能相匹配。有关内容我们将在以后章节中加以详细讨论。 第二节填充气相色谱柱 填充气相色谱柱通常简称填充柱，在实际分析工作中的应用非常普遍。据资料统计，日常色谱分析工作大约有80%是采用填充柱完成的。填充柱在分离效能和分析速度方面比毛细管柱差，但填充柱的制备方法比较简单，定量分析的准确度较高，特别是在某些分析领域（例如气体分析、痕量水分析）具有独特用途。从发展上看，虽然毛细管柱有逐步取代填充柱的趋势（例如已有一些日常分析使用PLOT柱代替过去常用的气固色谱填充柱），但至少在目前一段时期内，填充柱在日常分析中仍是一种十分有价值的分析分离手段。
色谱柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 5、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。 6、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要
拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置或更长时间。 7、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出 1-2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5-30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。 8、新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会
柱层析使用技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf 在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 关于无水无氧柱 适用于对氧，水敏感，易分解的产品，可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，