分子克隆实验指南
分子克隆是现代生物学领域的一项核心技术，也是基因研究、药物研发和农业开发过程中必不可少的手段之一。在这篇指南中，我将会简要介绍如何进行分子克隆实验，以帮助初学者更好地理解、掌握这项技术。同时，我也建议实验者在进行实验前，详细阅读当地的安全操作规程，并在合适的实验室环境中进行操作。
一、材料准备
在进行分子克隆实验前，我们需要准备以下材料和试剂：
1. DNA的扩增产物和载体DNA
2. 限制性内切酶
3. T4 DNA连接酶
4. 细菌菌种
5. 热激酶
6. 磷酸缓冲液
7. 离心管、PCR管、琼脂糖凝胶和电泳槽等相关实验器材。
二、实验步骤
1. PCR扩增
将目标DNA扩增出来，制备扩增产物。同时，也需要提纯产物，将其溶于蒸馏水中，以备后续操作。
2. DNA限制性内切酶切割
选择两种限制酶，将目标DNA和载体DNA分别切割。切割产品应该能够被T4 DNA连接酶形成连接。在T4 DNA连接酶
形成连接的基础上，我们需要将其转化到大肠杆菌等细菌中进行培养。
3. DNA连接
将切割后的DNA和载体DNA混合，加入T4DNA连接酶，
进行DNA连接。连接成功后，进行质粒的转化操作。
4. 质粒转化
将DNA与转化者（例如大肠杆菌）一起培养几个小时，
使其在培养基中繁殖生长。之后，分离转化菌落，进行鉴定。
5. 鉴定正式的及相关标签元素
为了确保成功的分子克隆，在选取符合需要的转化菌落后，除了进行相关的鉴定，还需要使用相关的标签元素。这些标签元素可以用于识别有效的重组表达载体，并进行大规模的表达。
三、实验注意事项
1. 选取嵌合体目标和载体的选择应按照相关配对的要求
进行。在酶切反应中，应注意酶的用量。同时，也需要注意处理过程中不要将酶污染。
2. 进行DNA限制性内切酶切割时，应注意温度和反应时间。
3. 在进行DNA连接后，将混合物放置于水浴中，沸腾数
分钟，以便DNA连接的更加稳定。在连接DNAs之前，应该对
酶进行热灭活。
4. 质粒转化后，为了鉴定高效的表达，需要进行多次筛
选和鉴定。同时，也需要进行合适的报告。
总之，分子克隆是生物学领域中极为重要的技术手段。
初学者在进行实验操作前，需要仔细阅读有关的实验操作规程，
并在实验室环境中进行实验。在实验过程中，还需要谨慎、细心和耐心，以确保实验的成功和安全。
外源性DNA残留量测定法 第一法 DNA探针杂交法 供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。 试剂（1）DNA标记和检测试剂盒 （2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。 （3）2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。 （4）3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。 （5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用盐酸调pH值至8.0。（6）5.0mol/L氯化钠溶液 （7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至8.0。 （8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液用盐酸调pH至7.2。 （9）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5 ml，加灭菌水至10ml。 （10）TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。 （11）1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。 （12）DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。 用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。 将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml含107个细胞，如果为细菌，则将其 浓度调整为每1ml含108 1ml，离心，在沉淀中加裂解液400μl混匀， 37℃作用12～24小时后，加入饱和酚溶液450μl，剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450μl重复抽提一次；转移上层液体，加入三氯甲烷450μl，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入pH 5.2的3mol/L 醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加入-20℃以下的无水乙醇1ml，充分混合，-20℃以下作用 1
论文撰写要求 1．题名 准确、精炼、清晰，充分反映论文的基本内涵与特色。中英文题名内容应一致，英文题名通常以名词短语为主要形式，整个题名只有第1个词的首字母大写，其余均小(专有名词除外)；避免使用非公知公用的符号、缩写词、外来语、代号和商品名。 2．作者姓名及单位 中英文作者姓名顺序应一致，通讯作者请用“*”标识，作者英文名为汉语拼音，姓在前，名在后，姓全大写，双名之间有连字符只首字母大写，如，WANG Da-wei。作者单位请准确写出全称，不能简写。 3．摘要 内容包括目的、方法、结果、结论。句首不要简单重复文章题名中的信息；简短、精炼，要有信息量，读者从摘要即能了解论文的主要研究内容。英文摘要应与中文摘要一致，可直译或意译；多采用过去时和一般现在时。 4．关键词 尽量选用主题词，如果自由选词，选词的关键在于要精选能代表文章主要内容的词或词组；每篇论文可列出3～8个关键词；中英文关键词既要意思一致又要顺序一致。 5．中图分类号
从《中国图书馆分类法》(第四版)中查找，自查。 6．引言 内容包括研究意义、研究背景、提出问题即本研究与已有研究的不同之处及研究目的。开门见山，直切主题，言简意赅，突出重点和创新之处。对已有的研究不要罗列文献，如，“×××用什么方法研究了什么，结果怎么样等”应自己组织语言阐述研究现状，标引出文献即可。 7．篇首页地脚注释 包括收稿日期、基金项目、作者简介 8．正文 包括：材料、方法、结果、结论或讨论。 (1)材料：应交代材料名称(必要的给出英文或拉丁文)、来源，取材方法、处理方法。使用的仪器、设备及其型号、测量范围、精度等。(取材要有一定的数量和代表性，以便获得充足的数据进行定性、定量分析) (2)方法：测定的方法及过程，以及出现问题所采取的措施等。若引用前人的方法只需标注文献，如进行了改进应写出改进之处。自己建立的方法需作详细说明。试验设计和分组要合理，最大限度减小误差，必须有对照和重复，要写出统计分析方法。 (3)结果与分析：对研究结果进行分析，文字应精炼。图表的题目及图表中的内容、图表注均需中英文对照。图表应具有自明性(只看图表，不阅读正文就可以理解图表的内容)，数据要进行数理统计和误差分析。表
连接经验分享来源：https://www.doczj.com/doc/c219040667.html,作者：基因时代时间：08-07-13 点击： 做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。 关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。 有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。 1，PCR引物的设计。通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG 位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。 2，PCR产物。两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种，连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。 3，提质粒。有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。 4，酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点： ①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。 ②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。 ③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。 ④酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。 5，回收。回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，
《质粒作为DNA参考物质的制备和质量控制规范》 征求意见稿 编制说明 一、工作简况 （一）任务来源 根据国家标准委下达的《关于下达2013年第二批国家标准制修订计划的通知》（国标委综合[2013]90号）要求，由中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局和连云港出入境检验检疫局联合承担了该标准的编制工作。主管部门为农业部，归口单位为全国水产标准化技术委员会。本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》中的要求进行编写的，本标准编号：20131315-T-424，完成时间为2016年。 （二）修订的必要性 在国内外的病原分子生物学检测标准中，DNA阳性对照都是必须设立的重要参考物质。相对于活病原，重组质粒具有生物安全性强、易于大量制备等优点，因此作为DNA参考物质得到了越来越广泛的应用。为满足病原分子生物学检测的要求，质粒DNA参考物质应具备以下特征：包含特定的病原DNA，可以根据相关检测标准检测到目的基因；稳定性强，不易降解，不易丢失病原DNA；纯度高，空质粒DNA、基因组DNA等杂质DNA含量低，含有病原DNA的重组质粒的测量值与实际值偏差不大，可用于病原的定量检测；易于大量制备。 目前我国还没有相应的国家标准规范质粒DNA参考物质的质量控制方法。针对这一情况，本项目计划建立一套技术标准，包括重组质粒的制备方法、质量评价方法和保存条件。通过该标准可以为病原分子生物学检测提供能定性检测和定量检测的DNA参考物质。该标准的建立将有助于提高我国病原分子生物学检测结果的可靠性。 (三)主要工作过程 1、准备阶段：本标准完成过程中所使用的质粒为中国检科院动检所自己制备和保存的质粒载体。大肠杆菌包涵体来自商业采购，由动检所保存。同时召集有相关水生动物病毒病诊断经验的科研人员组成工作小组，进行DNA参考物质制备方法的改进、验证和征求意见稿的起草工作。 2、实验阶段：2014年全年，由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所牵头，北京出入境检验检疫局和连云港出入境检验检疫局联合实施该标准的实验工作。 3、起草征求意见稿：2014年12月，根据实验数据，形成《质粒作为DNA参考物质的制备和质量控制规范》征求意见稿。 4、征求意见阶段：
分子克隆实验指南 分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。 分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤： 1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。 2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。 3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。 4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。 5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。 下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考： 1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。 2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。 3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。 5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。 6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。 7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。 8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。 9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。 总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
DNA的琼脂糖凝胶电泳 自1937年瑞典的Tiselius创造纸电泳以来，人们又创造了许多新的支持电泳的介质，其中较为常见的是琼脂糖及聚丙烯酰胺。普通琼脂糖凝胶制胶容易，能分离的核酸片段长度范围广（0.2-50kb）,可以区分相差约100bp的DNA片段；聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率（5bp）要高于琼脂糖，但它能分离的核酸分子通常<1kb，且制胶等的操作远比制备琼脂糖凝胶来得麻烦。当DNA分子相当大，其双螺旋的半径超出凝胶的孔径时，如果还用普通琼脂糖凝胶电泳进行分离，则DNA可能跑不出胶孔。在这种情况下，应选用脉冲凝胶电泳。脉冲凝胶电泳可以区分相差几百kb的DNA片段。 在本节中，我们主要介绍DNA的琼脂糖凝胶电泳。用于分离RNA的琼脂糖凝胶电泳，在胶的制备及所使用的缓冲液等方面与DNA有所不同，请参见相关的章节。 琼脂糖是从海藻中提取的线状多聚物。加热到90oC左右，琼脂糖即可熔化形成清亮透明的液体，浇在模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为40-45oC。琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离DNA混合物的目的。DNA 分子在碱性条件下（pH8.0-8.3），碱基几乎不解离，而链上的磷酸基团解离，所以整个DNA分子带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子迁移速度取决于分子本身的大小和构型，DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在碱性条件下，单链DNA与等长的双链 DNA的泳动率大致相同。 电泳装置 琼脂糖凝胶电泳现大多使用水平电泳槽。较之早先的垂直电泳槽，水平电泳槽在凝胶的制备上比较灵活，且可使用低浓度的凝胶。由于水平电泳槽的两极是相通的，这样正负极的缓冲液也不会因为电泳时间久了而产生太大的差异。 电泳缓冲液 在电泳的过程中，H O被解离，在阳极产生H+,而在阴极产生OH-，即阴极逐渐变碱 2 而阳极逐渐变酸。因此，当带电荷的分子通过支持物介质时，需要使用缓冲液以维持电泳所需的pH值。核酸电泳最常采用的缓冲液有TAE（T ris，A cetic acid and E DTA）、TBE(T ris,B oric acid and E DTA)两种。由于这些缓冲液的pH是碱性的，这就使得整条DNA链上的磷酸骨架的净电荷为负，从而在电泳时能向正极泳动。
分子克隆实验指南 分子克隆是现代生物学领域的一项核心技术，也是基因研究、药物研发和农业开发过程中必不可少的手段之一。在这篇指南中，我将会简要介绍如何进行分子克隆实验，以帮助初学者更好地理解、掌握这项技术。同时，我也建议实验者在进行实验前，详细阅读当地的安全操作规程，并在合适的实验室环境中进行操作。 一、材料准备 在进行分子克隆实验前，我们需要准备以下材料和试剂： 1. DNA的扩增产物和载体DNA 2. 限制性内切酶 3. T4 DNA连接酶 4. 细菌菌种 5. 热激酶 6. 磷酸缓冲液 7. 离心管、PCR管、琼脂糖凝胶和电泳槽等相关实验器材。 二、实验步骤 1. PCR扩增 将目标DNA扩增出来，制备扩增产物。同时，也需要提纯产物，将其溶于蒸馏水中，以备后续操作。 2. DNA限制性内切酶切割 选择两种限制酶，将目标DNA和载体DNA分别切割。切割产品应该能够被T4 DNA连接酶形成连接。在T4 DNA连接酶
形成连接的基础上，我们需要将其转化到大肠杆菌等细菌中进行培养。 3. DNA连接 将切割后的DNA和载体DNA混合，加入T4DNA连接酶， 进行DNA连接。连接成功后，进行质粒的转化操作。 4. 质粒转化 将DNA与转化者（例如大肠杆菌）一起培养几个小时， 使其在培养基中繁殖生长。之后，分离转化菌落，进行鉴定。 5. 鉴定正式的及相关标签元素 为了确保成功的分子克隆，在选取符合需要的转化菌落后，除了进行相关的鉴定，还需要使用相关的标签元素。这些标签元素可以用于识别有效的重组表达载体，并进行大规模的表达。 三、实验注意事项 1. 选取嵌合体目标和载体的选择应按照相关配对的要求 进行。在酶切反应中，应注意酶的用量。同时，也需要注意处理过程中不要将酶污染。 2. 进行DNA限制性内切酶切割时，应注意温度和反应时间。 3. 在进行DNA连接后，将混合物放置于水浴中，沸腾数 分钟，以便DNA连接的更加稳定。在连接DNAs之前，应该对 酶进行热灭活。 4. 质粒转化后，为了鉴定高效的表达，需要进行多次筛 选和鉴定。同时，也需要进行合适的报告。 总之，分子克隆是生物学领域中极为重要的技术手段。 初学者在进行实验操作前，需要仔细阅读有关的实验操作规程，
cDNA文库构建 cDNA文库 [原理]： cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA 链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
250 mmol/L MgCl 2μl 2 dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 O至 48μl 加H 2 2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。 3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。 4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。 5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。 6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）： [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 [阶段2：cDNA第二链的合成] 1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中： 10 mmol/L MgCl 70μl 2 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl
应用PCR技术扩增SRY基因检测性别 作者：吴晓东张博文王博楠等 来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2013年第14期 吴晓东，张博文，王博楠，李争芳，史莉莉，史铁伟，白春英 （赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000） 摘要：本文介绍了一种从基因水平快速、简捷地鉴定性别的方法及该方法的实际应用价值.PCR（polymerase chain reaction）技术是目前最常用的体外扩增DNA片段的技术，SRY （sex determining region of the Y）基因是男性特有的基因，位于Y染色体上.在SRY基因 区域设计特异的引物，利用PCR技术,以管家基因GAPDH为内参照，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.该法可对一滴血、一根毛发、多年的尸块、胎儿、有争议的性别进行性别鉴定.广泛应用于法医鉴定、无创孕期胎儿性别鉴定以预防X连锁隐性遗传病患儿的出生以及对有性别争议的运动员体检等.目前赤峰市的各大医院还未开展此技术，值得推广. 关键词：PCR技术；SRY基因；性别鉴定 中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2013）07-0138-04 1 引言性别鉴定一直是医学领域的一个很有意义的话题，随着技术的不断革新，性别鉴定的方法也由过去传统单一的方法，逐渐向分子生物学多手段结合的方法过渡.传统方法，如通过性染色质鉴定性别，存在着准确率低的缺点[1].羊膜腔穿刺结合染色体核型分析方法，虽然准 确率高，但检测所需时间较长（约23天左右），且容易损伤胚胎，对于单胞胎来说，胎儿死亡率为0.6%，还有引发孕妇并发症的可能性.B超鉴定性别要求孕妇妊娠5个月以上，虽然安全性较高，但是受操作者的业务熟练程度等因素影响较大.相对传统方法来说，分子生物学方法最具优势[2].我们采用的是分子生物学的PCR扩增法，以男女都有的管家基因GAPDH为内参照，扩 增男性特有的SRY基因，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性. 性别决定基因（sex determinationg region of the Y，SRY）指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段，是启动睾丸形成的主要基因.人的SRY基因位于Y染色体短臂Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质.SRY基 因在男性的减数分裂过程中，按父系遗传，涉及性别决定至少1亿3千万年了[3,4]. 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA的技术[5].本 研究中利用PCR技术扩增SRY基因和内参照基因（GAPDH），可以在短时间内（3个小时左右） 获得大量的目的基因，然后通过电泳检测结果，根据是否可以扩增出SRY基因来进行性别的鉴定.从采样到出结果只需5到7个小时，该方法的优点是简单、快速、高效、敏感度高，样品可以取自带毛囊的毛发，血液，多年的尸块等. 所以，利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉 眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域具有重要 的现实意义. 2 材料和方法 2.1 材料 2.1.1 材料及来源
绵羊DECR1基因exon 5部分序列多态性分析 刘冬;刘桂林 【摘要】试验根据GenBank登录的牛2,4-双烯-CoA还原酶1(2,4-dienoyl-CoA reductasel,DECR1)基因序列(NP_001068891)设计引物,应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基因的exon 5部分序列进行克隆测序;利用PCR-SSCP技术检测了3个绵羊群体exon 5单链构象多态性(SNP),所获序列与GenBank中其他物种exon 5序列进行了同源性比较,并构建了亲缘关系聚类分析图.结果表明,绵羊DECR1基因exon 5长为137 bp,3个绵羊群体中exon 5均不存在SNPs,各种动物之间DECR1基因exon 5的同源性较高,在 81.02%(鸡)～97.08%(牛)之间,其中绵羊和牛同源性最高,达到97.08%;与鸡的同源性最低,为81.02%;聚类分析结果显示,绵羊首先与牛聚为一类,再分别与兔子、狗聚为一类,最后分别与人、猪聚为一类,绵羊与牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远,与传统分类相一致,说明DECR1基因exon 5在动物进化过程中高度保守. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2010(037)011 【总页数】4页(P132-135) 【关键词】绵羊;DECR1基因;exon 5;序列;SNP 【作者】刘冬;刘桂林 【作者单位】山西农业大学文理学院,太谷,030801;山西农业大学动物科技学院,太谷,030801
【正文语种】中文 【中图分类】Q753 2，4－双烯－Co A 还原酶1（2，4－dienoyl－Co A reductase1，DECR1）是 多不饱和脂肪酸氧化分解途径中的关键限速酶，在多不饱和脂酰基Co A（PUFA）β－氧化过程中起重要作用。DECR1基因所编码的线粒体2，4－dienoyl－Co A 还原酶参与多不饱和脂酰基Co A 的β－氧化，其催化的反应为：trans－2，cis ／trans－4－dienoyl－CoA＋NADPH＋H＋→Trans－3－enoyl－Co A＋NADP＋。在该反应中，若不饱和脂肪酸以底物的形式参与β－氧化，该酶不仅可形成2，4－双烯酰Co A复合物，而且可降低NADPH／NADP＋比值。缺乏DECR1患者的症状主要表现为低纤维蛋白和高赖氨酸血症，尿液和血液中存在2 －trans－4－cis－decadienoylcamitine，此代谢物的存在是亚油酸的不完全氧 化所致。Helander等（1997）、Clop等（2003）对DECR1基因的功能和分子 结构进行了研究，其中人、黑猩猩、小鼠、大鼠、牛、兔子和狗等动物的DECR1 基因全序列已经被确定。Amills等（2003）扩增出了猪DECR1基因的几乎全部 的编码序列（c DNA），包含exon 2～10的937 bp片段，这个c DNA序列（Gen Bank登录号：AY233130）与人、鼠定向进化同源序列有89%、83%的 同源性，同时发现exon 2在编码序列第181 bp处发生G→C的突变，存在单核 苷酸多态性（SNP）。Cl op等（2003）研究在猪exon 5编码序列第458 bp处发现了第2个G→C突变的多态性，exon 2和exon 5多态性与在DECR1蛋白第61和153氨基酸残基处发生Val→Leu和Ser（C）→Thr（G）保守氨基酸替换 相关。本试验根据Gen Bank登录的牛（NP＿001068891）DECR1基因序列设 计引物，应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基
黑线仓鼠CRH基因的编码序列及系统进化分析 张琪;薛慧良;徐金会;陈蕾;徐来祥 【摘要】为探究黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)繁殖功能与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因结构的关系,参考近缘种的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR 法克隆得到了黑线仓鼠CRH基因的部分序列,克隆得到长度为1 112bp,为外显子1和外显子2的部分序列,包括全部编码区序列564 bp；编码区共编码187个氨基酸,GenBank登录号为JQ416143.利用编码区序列构建系统进化树,结果显示,黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系最近,与其他哺乳动物亲缘关系较近,而与原鸡亲缘关系最远,此结果与物种的进化关系相一致.同时对其编码的蛋白质进行一级结构分析及二级、三级结构预测,得到了CRH的信号肽序列和41个氨基酸组成.本研究首次报道了黑线仓鼠的CRH基因序列,为进一步探究CRH基因奠定基础,对系统分析CRH的功能具有重要的参考价值,同时该cDNA序列可作为物种亲缘关系或遗传距离研究的理想标记. 【期刊名称】《生物技术通报》 【年(卷),期】2012(000)010 【总页数】7页(P88-94) 【关键词】黑线仓鼠;CRH编码序列;序列分析;系统进化 【作者】张琪;薛慧良;徐金会;陈蕾;徐来祥 【作者单位】曲阜师范大学生命科学学院,曲阜273165;曲阜师范大学生命科学学院,曲阜273165;曲阜师范大学生命科学学院,曲阜273165;曲阜师范大学生命科学学院,曲阜273165;曲阜师范大学生命科学学院,曲阜273165
【正文语种】中文 促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH）是调节下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）活动、控制机体应激功能的下丘脑调节肽[1]。1981年，Wglie Vale首次从羊分离纯化得到CRH，并确定其化学本质是41肽，它是促肾上腺皮质激素（ACTH）、β-内啡肽及其他POMC样肽合成和释放的调节物[2]。分泌CRH的神经元主要分布在下丘脑室旁核（PVN），其mRNA在皮肤、胎盘、胸腺、胃肠道、腺垂体、肾上腺、海马复合体、杏仁核、小脑、大脑及下丘脑的室旁核及炎症细胞中都有较高的表达[3]。研究表明，CRH不仅是启动下丘脑-垂体-肾上腺轴的关键物质，同时也参与调节生殖功能[4]。在应激条件下，CRH可通过抑制下丘脑GnRH神经元的释放活动、抑或通过垂体-肾上腺-皮质轴分泌的与应激有关的各种激素而降低垂体促性腺细胞对GnRH的反应性，或直接抑制性腺类固醇激素的合成与分泌[5]，从而在3个水平上抑制下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的活动。因此，CRH对繁殖功能的影响是复杂而多样的，阐明CRH 基因的结构，可为从基因水平上探究动物繁殖的分子调控机制提供借鉴。 目前，已克隆出小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）、猕猴（Macaca mulatta）、牛（Bos taurus）、猪（Sus scrofa）、家兔（Oryctolagus curiculus）、原鸡（Gallus gallus）等多个物种的CRH cDNA 序列。小鼠的CRH基因定位于第三条染色体上，有两个外显子和一个内含子构成，mRNA全长为1 320 bp，编码区全长为564 bp；人类CRH基因也由两个外显子组成，第一个外显子编码信使核苷酸中大部分的5'非翻译区，而第二个外显子包含前激素序列和3'未翻译区[6]。 黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）属于啮齿目（Rodentia）仓鼠科（Cricetidae）仓鼠属（Cricetulus），以小麦、玉米、豆类等作物的种子为主要食料，杂草籽次之，还取食少量昆虫和植物茎、叶、根等[7]，是我国北方农田主
大肠杆菌BL21感受态的制备和保存方法研究 焦亮（细胞生物学 2009111107000732） [摘要] 目的：描述一种改良的大肠杆菌感受态制备和保藏及质粒的转化方法．方法：将CaCl2溶液改为TB溶液；其次是将培养基由LB换成NZY，并分别比较了不同冷冻保护剂(7%DMSO，10％甘油)于－20℃、－80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果：以TB溶液制备感受态细胞，冰浴转化10min后直接涂平板筛选转化子，获得与常规转化方法相当的转化效率,而以7％的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持107以上的转化率40d以上。 [关键词] 大肠杆菌；感受态细胞；制备方法；转化率；保存 Study on Preparation and Storage of Competent Escherichia coli BL21 Cells Jiao Liang [Abstract]Objective: An efficient method was described for the E. coli preparation，storage and plasmid transformation. Methods: Normal conditions were changed, from CaCl2 solution to TB solution, LB medium to NZY medium and compared different conditions for storage of competent cells.Results:High transformation efficiency was achieved by preparing the competent cells with TB solution, transforming for 10 minutes, and then following the direct selection on Amp+ LB plate, and Cells stored with dimethylsulfoxide in -80℃could keep consistently high transformation efficiency at least 40d. [Key words] competent cells; Escherichia coli; Preparation; storage 大肠杆菌感受态细胞的制备是实验室分子克隆的重要试验之一，在实际操作中，由于感受态细胞的转化效率受到诸多因素的影响，如离子强度、热击参数、培养条件、保存温度及时间等，转化效率很不稳定。很多实验室采取不同的方法来提高感受态细胞的转化效率，但由于这些方法重复率性差，应用并不普遍。本文总结出一种制备大肠杆菌高效感受态细胞的方法并优化了高效感受态保存的方法。 1材料与方法 1.1 材料 E. coli BL21由湖北大学分子生物实验室保存；质粒pet23a-his-RECQL 为湖北大学分子生物实验室构建。 细菌培养基：LB固体培养基和NZY液体培养基参考文献[1] TB(CaCl 2)溶液：Pipes 3.021g/L,CaCl 2 ·2H 2 O 2.205g/L,KCL 18.637g/L,MnCl 2·4H 2 O 10.885g/L.所有成分除了MnCl 2 外被混合并且KOH将PH 值调至6.7。然后将MnCl 2 溶解，溶液通过0.45μm的过滤器过滤灭菌并于4℃存储；DMSO（二甲基亚砜） 1.2 方法 1.2.1标准质粒制备：常规碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察，将显示为超螺旋DNA带型的凝胶切下．胶回收后电泳确保质粒全部为超螺旋状态．紫外分光光度计测其纯度及浓度，TE稀释为1ng／μl，存于-20℃备用. 1.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备。将大肠杆菌 E. coli BL21划线接种于LB
模块1 绪论 掌握：临床分子诊断学基本概念、研究内容与分析对象。 熟悉：临床分子诊断技术在临床中的应用（感染性疾病分子诊断，遗传性疾病的分子诊断，肿瘤的分子诊断，个体化医疗等）。 了解：分子诊断学的发展简史及展望。 模块2 基因与人类基因组计划 掌握：基因的概念和功能类别，基因组、DNA多态性和SNP的概念 熟悉：人类基因组多样性 了解：基因概念的发展和人类基因组计划 模块3 基因组的结构与功能 掌握：真核生物基因组的结构与功能特点 熟悉：原核生物和病毒基因组的结构与功能特点 模块4 核酸分子杂交技术 掌握：分子杂交、分子杂交技术的概念及基本原理，核酸探针的设计。 熟悉：核酸探针的类型，寡核苷酸探针的特点及设计原则，核酸探针的标记方法（切口平移法（nick translation），随机引物法(random priming)，末端标记法，化学标记法），理想的探针标记物应具备的特性，核酸分子杂交的影响因素，常见的核酸分子杂交技术（Southern印迹杂交，Northern印迹杂交，斑点杂交，荧光原位杂交）。 了解：核酸分子变性、复性等基本概念，核酸分子杂交的基本步骤，核酸探针的纯化（乙醇沉淀法，凝胶过滤层析法）与检测，其他的分子杂交技术（吸附杂交，亲和吸附杂交，磁珠吸附杂交，发光液相杂交，能量传递法，液相夹心杂交）。模块5 分子克隆 掌握：分子克隆、载体的定义，各类工具酶的功能、分类及用途等，载体应具备的特征，分子克隆的基本步骤。 熟悉：Ⅱ型限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶及末端转移酶的作用特点，限制性内切酶的主要用途，常用克隆载体的结构、性质及筛选鉴定方法，质粒载体的特点，目的基因与载体的连接方法（如粘性末端DNA分子的连接，平末端连接法等），感受态细胞的制备，常用重组体的筛选方法（抗生素抗性筛选、B-半乳糖苷酶系统筛选）。
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