动物种质资源体细胞采集、培养、保存规程(讨论稿)
本规程适用于动物种质资源体细胞采集、培养、保存及其相关操作。由于细胞培养技术内容非常丰富，本规程仅对其中最主要的部分做了基本的规范。在实际操作过程中，在此规程的基础上，一些实验技术的细节，还需参照相关的权威性的参考书，并根据本实验室的具体情况加以灵活运用。
培养室内的无菌操作
细胞培养实验所需的物品、器材应进行严格的灭菌或购买无菌的一次性物品。玻璃瓶可拧松瓶盖灭菌（指高压蒸汽灭菌，以下同）或用铝箔纸包住瓶口，和瓶盖分别灭菌。其它玻璃和金属器材用铝箔纸包裹进行灭菌。玻璃吸管应塞上棉花球灭菌，然后置于烘箱中烘干。不适于进行高压灭菌的瓶塞等其它物品，可浸泡在70%酒精中进行灭菌，然后在超净工作台上吹干。细胞培养液和其它不适于高压灭菌的溶液，应通过过滤（采用0.22μm的孔径的滤膜）灭菌。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖地面一次，并用紫外线照射灭菌30分钟。超净工作台每次使用前用70%酒精擦拭，然后紫外线照射30分钟。
进入无菌操作室要求穿着无菌工作服、工作帽、口罩。开始工作前用70%酒精对手、前臂及乳胶手套进行消毒。细胞培养等操作应在超净工作台或有空气过滤器的空间内进行。操作前点燃酒精灯，细胞培养的所有操作，如打开或关上试管或培养瓶盖等，都要靠近酒精灯并经过短时间的灼烧。烧过的实验器械，冷却后才能使用。已吸过培养液或其它有机液体的吸管不得再用火焰烧灼。不同液体分别用不同的吸管吸取，不能混用。开盖后的培养瓶尽量避免垂直放置，同时瓶盖应扣放在超净工作台上，以减少落入细菌的机会。细胞培养物在处理和使用前，不要过早暴露于空气中。在进行转移液体操作时，移液器不能触及瓶口以避免细菌污染或交叉污染。放置吸管时管口向下倾斜，以防止液体倒流引起污染。培养细胞的废弃用品，应放入可封装的容器内。
细胞培养样品的采集
器材与试剂：1.眼科剪，弯镊子、手术刀；2.装有无血清培养液或PBS
（KCl,2.7mM;KH2PO4,1.5mM;NaCl 136.9mM;Na2HPO4, 8.1mM）的小瓶； 3.10ml、
50ml小烧杯；4. 培养皿。
操作步骤：
1.采样时应严格无菌操作。采样时应用已灭菌的器械、无菌包装的器皿和经过滤灭菌的缓
冲溶液和培养液。采样过程中尽量避免紫外线照射和接触对细胞有毒害作用的化学试剂。在有污染因素存在的区域采样时，应将样品在含有500-1000U/ml的青、链霉素的PBS中漂洗3次，每次1-2分钟。
2.在条件允许的情况下，宜采细胞易存活、增殖速度快的胚胎组织。
3.采样时应用锋利的器械切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
4.采样时应切除采样组织外的其它成份，如附着在采样组织上的血液、脂肪、神经组织、
结缔组织和坏死组织。修剪和切碎过程中，应将样品浸泡于少量培养液中，以避免组织干燥。
5.采取的样品应尽快培养。因故不能立即培养时，应将样品切成1cm3以下的小块，浸泡
于培养液内，置于冰浴或4℃冰箱中。时间不能超过2小时。
6.采样的同时要留好组织学标本和电镜标本，以便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞
体外培养后与原组织的差异性。对样品的来源、供体的一般情况（包括性别、年龄、健康状况等）要做详细的记录以备查询（见附表1）。
细胞的原代培养
器材与试剂：1.离心机，眼科剪，牙科探针;2.培养瓶（皿），吸管，小烧杯；3.PBS缓冲液，细胞培养液。
操作步骤：
1．对于样品量较少的组织，采用组织块培养法。
即将组织剪成小块后接种于培养瓶（皿）。具体操作规程如下：
1.1将样品切成1mm3左右的小块。在剪切过程中，向样品滴加少量培养液，以保持样品湿
润。
1.2将剪切好的组织小块，用眼科镊子送入培养瓶（皿）内，用牙科探针或弯头镊子将组织
块在瓶壁上均匀摆置，小块间距0.5cm左右。轻轻将培养瓶翻转，让放置样品的瓶壁朝上，向瓶内注入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置入二氧化碳培养箱中。
1.3放置3小时后，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，拧松瓶盖，静置培养。原
代培养第4天时换液一次。
2 对大量样品的培养，宜采用组织分离的方法培养。
2.1组织的分离
2.1.2 培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，采用离心法分离。用小型台式离心机1000 rpm（约110-120G的离心力）离心5分钟（以下离心条件同），去除上清液。
2.1.3 对一些纤维成份很少的组织（如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织）进行分离处理时，在细胞培养液内用剪刀剪切后用吸管反复吹打分散细胞；或将样品挤压通过不锈钢网(孔径在80目以上)的方法进行分离。离心过滤液，收集细胞。去除上清液。
2.1.4 对于不适于上述两种方法分离的样品，采用消化分离方法，即将剪切成较小体积的组织块通过胰蛋白酶或胶原酶消化进行进一步的分散。对细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织宜使用胰蛋白酶。在进行消化时，用0.25%的胰蛋白酶，pH8的条件下在37℃消化20分钟。对胰蛋白酶耐受性差的样品，消化期间应通过显微镜随时观察消化情况，采用分次消化，及时把已消化分离下来的细胞与组织分开，放入含有血清的培养液中，更换消化液后再继续消化。对于纤维性组织、上皮及癌组织宜使用胶原酶进行消化分离。消化时采用0.2μg/ml的胶原酶溶液37℃条件下消化4-48小时，可根据细胞分散的程度而定。在消化分离法中，随时吸取少量消化液在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化。通过孔径适当的筛网，滤掉未消化的样品块。已过滤的消化液1000 rpm 离心5分钟，去除上清，加含10%血清的培养液，轻轻吹打形成细胞悬浮液，再次离心，去除上清液。
2.2 加入含20%血清的细胞培养液，轻轻吸打离心后收集到的细胞，使之分散均匀。进行细胞计数，然后接种到含20%血清的细胞培养液的培养瓶（皿）中，松松盖上瓶盖，放入二氧化碳培养箱内培养。
2.3原代培养第4天时换液一次。
2.4对细胞原代培养所用试剂和主要参数进行记录（见附表1）
传代培养
器材与试剂：1.离心机、滴管、离心管、培养瓶（培养皿）、计数板;2.0.05% ～ 0.25% 胰蛋白酶消化液(溶液中含0.05% ～0.25%的胰蛋白酶,其它成份与PBS同)，细胞培养液*，PBS 缓冲液。
* 根据细胞种类不同选择适当的细胞培养液。各主要类型的细胞培基（液）都已商品化，可在国内外生物制剂公司买到。有时需在商品化的细胞培基（液）中加入一些其它营养物质或生长因子以满足一些特殊细胞种类的生长需要。
操作步骤：
1．贴壁生长的细胞的传代培养
1.1 当原代培养后的细胞增殖至整个瓶（皿）壁被细胞覆盖时（贴壁生长的细胞），弃
去旧培养液。加入适量PBS缓冲液（5ml培养瓶加入2ml缓冲液），轻轻摇动培养
瓶（皿），使缓冲液流过所有细胞表面。倒掉缓冲液，加入适量0.25%胰蛋白酶溶
液（5ml培养瓶加入2ml胰蛋白酶溶液）。
1.2在37℃条件下消化3-5分钟，随时观察消化情况。当细胞质回缩、细胞间隙增大或
有细胞悬浮时，加入含10%血清的培养液，终止消化。
1.3用弯头吸管吸取瓶（皿）内的培养液，反复轻柔吹打瓶（皿）壁，使细胞脱离瓶（皿）
壁后悬浮于培养液中。
1.4离心，弃上清液，用含10%血清的培养液重新悬浮细胞。
1.5计数，分别接种在新的含10%血清的培养液的培养瓶（皿）内。
1.6当培养液的颜色呈黄色时（pH值下降），需要更换新的培养液。
1.7当细胞增殖至整个瓶（皿）壁时，需再次传代培养。
2. 悬浮生长的细胞的传代培养
2.1 将细胞同培养液一起转移到离心管内，离心。
2.2 弃上清液，加入新的培养液，用吸管吹打使之形成细胞悬浮液。
2.3 对细胞进行计数和重新接种, 细胞的接种数量可从5×104～8×105个/ml。
2.4当培养液的颜色呈黄色时（pH值下降），需要进行换液。
2.5 当细胞增殖至覆盖培养液表面时，需再次传代培养。
3. 对得到的细胞系进行鉴定和命名。通过对所培养细胞的核型、同功酶、细胞表面抗原、细胞骨架、DNA的分析，以对细胞的物种、组织来源以及细胞是否发生转化、有无交叉污染、有无遗传不稳定倾向等进行鉴定。细胞系的命名宜采用4级命名法，即中文名由采样的物种、品种、采样组织、细胞系编号（用阿拉伯数字表示）组成；其缩写名则由物种英文名称的头两个字首、品种、采样组织的英文的字首及细胞系编号组成。如从丝毛乌骨鸡胚胎组织采样所建立的成纤维细胞系1，其中文名为“丝毛乌骨鸡胚胎成纤维细胞系1”，缩写名为“ChSE1”。
4．多种细胞同时分别传代培养时，操作时应小心仔细。为防止不同细胞系间的交叉污染，超净工作台中一次只进行一种细胞系的操作
5．培养箱中的细胞应经常置于显微镜下观察，每周至少两次，以检查细胞是否生长正常和有无污染出现。
6．细胞传代或更换培养液需要做记录（见附表2和附表3）。记录的内容包括组织的来源，生物学特性，培养液类型，传代、换液的时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态等。
细胞的保存（冻存）
器材与试剂：1.0.25%胰蛋白酶;2.含10% ～ 20% 的血清培养液；3.细胞冻存液（10% DMSO 或经高压（15磅）灭菌的甘油，20%血清，70%细胞培养液）；4.吸管、离心
管、冻存管。
操作步骤：
1.选择培养至对数生长期的细胞（生长旺盛但尚未形成致密的单层细胞、长满培养瓶
（皿）以前）进行冻存。在冻存前一天换一次培养液。
2.按照传代的方法用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，计数，离心收集细胞。
3.弃去上清液，加入配制好的细胞冻存液，冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml。
用吸管轻轻将细胞吹打均匀，然后装入冻存试管中，每管冻存1-1.5ml。在冻存试
管上注明细胞系名称、冻存日期和培养基的名称。
4.标准的冻存程序为，初期降温速率为-1～-2℃每分钟；当温度达-25℃以下时，可增
至-5～ -10℃每分钟；至-100℃时，则可迅速浸入液氮中。装入冻存试管的细胞可
置于细胞冻存器中，在-80℃过夜后迅速放入液氮容器内冻存。如无此设备，可以
用下两种方法：一种是将冻存试管放入泡沫塑料盒或小纸盒中（用脱脂棉将其固定
好）。放入-80℃冰箱中过夜，然后迅速放入液氮中；另一种是，将冻存试管缓缓放
入液氮容器，按1℃每分钟的降温速度，在30-40分钟内使其达到液氮表面，再停
30分钟后投入液氮内。低温冷冻操作时应戴厚手套，以防冻伤。
5.用布袋盛放冻存试管冻存时，用结实的线绳一端扎住袋口，与布袋一起沉入液氮中，
线另一端系一个标签，其上标明细胞系名称、冻存日期和培养基的名称，垂于液氮
容器外；当用铁架盛放冻存试管冻存时，铁架和铁架伸出液氮容器外的手柄上贴上
标明细胞系名称、冻存日期和培养基的名称的标签。
6.对首次冻存的细胞系，需在冻存后两周后复苏一次，观察细胞对冻存的适应性。对
已建系的细胞每6个月复苏培养一次，检查其生长状况和是否存在污染，然后再继
续冻存。
7.细胞冻存应做记录（见附表4）
细胞的复苏
器材与试剂：1.水浴箱；2. 小型离心机；3. 吸管； 4.镊子；5.细胞培养瓶（皿）；6.细胞培养液。
操作规程：
1.从液氮容器内取出细胞冻存试管，用镊子夹住在40℃水浴中不断摇动，使其快速融化。
操作时应戴厚手套，以防冻伤。
2.当冻存试管内的液体完全融化后，立即从40℃水浴中取出冻存试管，用70%酒精消毒，
吸出细胞悬浮液，放入离心管中，并加入10倍体积以上的细胞培养液，混合后离心，弃去上清液，再用细胞培养悬浮，离心后用细胞培养液重新悬浮并计数。
3.对复苏后的细胞进行接种，接种密度以5×105/ml为宜。然后放入二氧化碳培养箱中培
养。
4.冷冻细胞的复苏应做记录（见附表5）
细胞的运输
器材与试剂：1.液氮或干冰;2. 冻存试管或培养瓶；3.细胞培养液。
操作规程：
1．短时间的运输可将细胞放入冻存试管冻存在液氮或干冰中运输。
2．长时间的运输（达4～5天）可用以下方法：
2.1 选择生长至中或晚对数期的细胞，弃去培养液，加入新培养液至瓶颈部，保留微量
空气，拧紧瓶盖，用防水胶带牢固地封好瓶盖和瓶颈的结合部，并用泡沫塑料包裹。
2.2 到达目的地后，弃去多余的培养液，只保留维持细胞培养的液培养液量，放入二氧
化碳培养箱进行培养，次日传代。
附表1 采样和原代培养的记录
附表2 换液记录
附表3 细胞系传代的记录
附表４细胞冻存记录
附表５细胞的复苏记录
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实训二MS培养基的配制与灭菌（3学时）
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3
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一、目的要求
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通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。
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二、仪器与用具
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1、仪器：酸度计或pH试纸、电磁搅拌器、电炉
2、用具：高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标8
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签
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3、试剂：配制MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1 N 、0.5N NaOH，11
0.1 N 、0.5N HCl
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三、方法步骤
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（一）MS固体培养基的配制
1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，
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避免使用已失效的母液。
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2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。
注意：配500ml培养基用1000ml烧杯。
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3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。
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如配制1000ml培养基：
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需：MS大量元素母液100ml
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MS微量元素母液10ml
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MS铁盐母液10ml
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MS有机物母液10ml
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4、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。
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5、加入蔗糖（30g/L），溶解。
6、定容：用容量瓶。
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7、调pH值：一般pH=5.8。
用0.1 N 和0.5N 的NaOH和HCl 将pH调至所需的数值。
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注意：①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2—0.8，故调整后的pH值应高于目30
标pH值0.5个单位。
②pH值的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬；低1
2
于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。
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③如果pH值与所需的数值相差很大，可先用0.5N的NaOH或HCl调节，至接近时，4
再用0.1N的酸、碱调节。以免加入过量的水溶液，导致溶液体积增大，培养基不5
能很好地凝固（因加入的琼脂量一定）。
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8、分装到大三角瓶中（500ml、1000ml）。
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9、加琼脂（6-10g/L）。常用6.6--7 g/L
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10、封口：用棉塞或锡箔纸、牛皮纸。注明培养基名称、配制时间。
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或者：5、加入蔗糖。
6、加琼脂，煮沸1-2分钟（熔化琼脂）。
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7、定容，pH值。
8、分注到培养瓶中。100-150ml培养瓶每瓶装入20-35ml左右的培养基。
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（二）MS固体培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）
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1、洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或15
烘箱干燥。
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2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
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3、装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！）
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4、装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好19
的玻璃器皿和金属器械等。
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5、灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关21
闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。
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当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的23
目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌24
锅自然冷却。
注意：①先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！）
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②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储
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藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。
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③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同
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培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。
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1
细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取 1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM 含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。
细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 （6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 （7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 （1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 （1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 （2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 （3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 （4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 （1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 （2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 （1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 （2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 注意事项： 1.严格的无菌操作。 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清
相关疾病： 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? 早走早脱身，从此专注黑生物 1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。 2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。 3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。 4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。 5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。 6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。 非科班出身经验分享 1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。 2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。 3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。 4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。 5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。 6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。 大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。 最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
相关疾病: 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心,那真就是捧在手里怕碎了,含在嘴里怕化了,瞧在眼里怕丢了,培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? ?早走早脱身,从此专注黑生物??１。严格无菌操作,多喷喷酒精,要就是对灭菌得东西不放心,自己包自己送自己烘干。 ?２.不要与别人共用试剂耗材,自己准备一套。 ?３、有可能得话在拿到新细胞得时候做好支原体衣原体检测。??4。水浴锅很脏,生化培养箱要就是得手动加湿得话盘里得水也会很脏,勤换(灭菌水加进去)。 5、晚上离开得时候最好给细胞房照紫外,超净台就是用完就开、?? 6、最好得就是同一时间就您一个人在用细胞房在养细胞。? 非科班出身经验分享 1、别怕浪费。枪头什么得只要有可能污染就换,如果用酒精灯就什么都稍微烤一下,别直接放到火上,离一段距离、? 2、动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆得气泡,动作太轻就吹不下来.。、刚开始得时候吹细胞太痛苦了,稍微一下就起泡。后来就就是吹得时候枪里得培养基不要一次全都压出来,留一点,枪得最头部尽量深得在液面以下。??3。离开过操作台得东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍,包括一切实验耗材、仪器、以及您带着手套得手。??４。实验结束后对实验台得消毒、紫外什么得,用前用后都照个3０分钟、? 5。身体得各个部分尽量得少接触不需要接触得地方得地方、比如实验台,又比如培养箱内部。 ?6、细胞得密度根据细胞得性质、传代得时间以及自己得心情来定。培养基得话最多最多不要超过２天就要换一次。细胞可以不传代,但就是培养基就是一定要换得。 大概就就是,不该碰得地方不碰,有影响得地方少碰; 该使劲得时候绝对不含糊,不该使劲得地方一定忍住、如果就是比较简陋得操作台就一定要摆个酒精灯,所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果就是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物得实验,心疼钱就还就是不要做了。 最后一点点绝对非科班得经验。癌细胞真就是坚挺。有一次实在就是不想传了,放了5天吧,感觉都长了几层出来,培养基都黄了。抱着试一试得心情传了一次,又坚强得活过来了。当然,状态肯定也差得很了。? 换种心情,好好生活! 养了三年细胞,各种肿瘤细胞,说一点自己得瞧法: ?１。培养细胞前,可以瞧瞧细胞特点说明书,包括细胞正常生长得状态图、传代、培养 2. 不同细胞生长周期不同,有得生长很快,比如说MＤA-MB—2３1,传代基得类型等。?? 得时候取离心悬液得十分之一就已经足够了,有得又就是特别慢,等得人心焦,BT474就就是,传代就是一分二,复苏起始得时候两周多才能长满,所以就要在培养细胞得过程中多多摸索了。? 3、对于娇弱得细胞,就得细心呵护了,胰酶消化不能过久,吹得时候要轻柔,离心时候也要注意转速与时间,每天都要去瞧一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。?
大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
细胞培养热点常识 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1
2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备 0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。 2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解 细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。 由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。
另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细 胞ATP是否有影响。 所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我 们感觉还是最好的方法。 细胞培养方法 哺乳动物细胞培养规则： 1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。 2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。 3，在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。 4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用最多12代（约2个月）。 5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。 6，具体参照https://www.doczj.com/doc/cd17688506.html,中细胞培养要求。 细胞传代方法 1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2，加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。 4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 5，细胞培养液参照https://www.doczj.com/doc/cd17688506.html,，一般含有10%胎牛或小牛血清。
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分
细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应臵于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320
细胞培养的过程及 注意事项
36细胞培养的过程及注意事项 细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块 细胞的培养过程及注意事项 根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。 一、原代培养 （一）过程 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常见的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法
(1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引
第一章：细胞组织培养的三种类型？ 原代外植块培养：是从人或动物体内取出一小块组织，模拟体内生理环境，在保证无菌、适宜温度和营养条件下，使之生存和生长并保持其结构和功能的方法。 器官培养：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基或器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 细胞培养：是以相似的培养方法体外培养单个细胞或单一细胞群，使其在适宜条件下生长并保持细胞特性。 第二章 1.体内体外的环境不一样，细胞之间的粘附是通过什么实现的？ 细胞的黏附是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子结合实现的。 在细胞铺展之前，细胞已分泌了细胞外基质蛋白和蛋白聚糖。细胞外基质先黏着到带电底面上，然后再通过特异的受体附着到基质上。 因此，细胞曾经生长过的玻璃或塑料表面更适合细胞附着，用基质成分，如纤连蛋白、胶原或其衍生物（如明胶）预处理培养器皿，有利于要求复杂培养条件的细胞附着和增殖。 主要有四类跨膜蛋白参与了细胞与细胞、细胞与底物的黏附。 不依赖Ca2+的细胞间黏附分子介导同种或异种细胞与细胞粘附 依赖Ca2+的钙黏着蛋白参与同源细胞间的相互作用 整合蛋白，介导细胞与基质之间的相互作用，是基质分子 跨膜的蛋白聚糖，能和基质成分如其他蛋白聚糖或胶原相互作用，具有稳定、活化和把生长因子转运到高亲和性受体上的作用。2.细胞外基质成分及作用？ 细胞外基质（ECM）由胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖及膜结合生长因子（或细胞因子）等各种成分组成。ECM能提高细胞的生存、增殖和分化能力3.概念，接触抑制：细胞在生长过程中达到相互接触时运动停止，同时细胞质膜褶皱减少，最终细胞分裂停止。 4.诱导细胞分化的条件？ 有助于诱导细胞分化的条件： 细胞密度高 细胞与细胞、细胞与基质之间作用强 培养基中存在各种分化因子 5.细胞信号传递的类型？ 体内细胞的增殖、迁移、分化、凋亡均受细胞间、细胞与基质间相互作用及营养条件和激素等信号分子的调控。 体内细胞信号传递的类型有： 自分泌：由细胞自身合成并通过与自身受体结合作用于细胞自身。 内分泌：信号分子通过体内脉管系统从一种细胞转移到另一种组织细胞中发挥作用的过程 同型（旁）分泌：某些细胞分泌的可溶性信号物质作用于同类型细胞。 异型旁分泌：同一细胞类型分泌的信号物质作用于不同的反应蛋白 旁分泌：不通过血液而直接作用于邻近细胞的方式 体内都存在这些类型的细胞信号传递方式，而在体外，在具有基本培养基的常规条件下，只有自分泌和同型分泌两种方式。 6.细胞传代分为哪三个阶段？ 原代培养期：从体内取出组织，接种培养到第一次传代阶段（初代培养） 1-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈二倍体核型 细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。 传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存（10代内）。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期，即有限细胞系。 衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞很难长满培养空间；
细胞房操作注意事项 1、细胞房实验耗材、仪器、药品等均不可随意带进或带出； 2、严禁无关人员进入细胞房，如无特殊情况，每次进入细胞房不得超过2人，切勿带细胞房外人员进入细胞房； 3、保持细胞房卫生，细胞房每两个星期打扫一次，需要清理的地方有：培养箱、无菌操作台以及一切操作皆有可能碰到的地方，清理时均需要用70%的酒精擦洗；地面也需要用70%的酒精擦洗，另外拖鞋、挂衣钩也需要用酒精擦洗。配打扫用酒精用的大烧杯在细胞房水龙头旁边； 4、每次处理细胞前、后均需要打扫无菌操作台； 5、细胞房的任何药品均需标注详细，如名称、配制时间、配制人、浓度等各项指标，否则一律丢弃； 6、培养基要分瓶使用，各用自己的培养基，以免交叉污染； 7、不得随意使用、移动他人的细胞，如想使用，务必通知细胞持有人； 8、细胞房用的物品进细胞房前均需要灭菌，常用的有：枪头、离心管、水、PBS，灭离心管的时候需要把离心管盖子一个一个的松开，灭水和PBS的时候一定要记得松开瓶口。拿进细胞房之后要先放在细胞房用紫外照射灭菌后方可使用。 9、任何物品（药品、培养瓶等）进无菌操作台里都必须先喷酒精。 贴壁细胞培养方法 细胞培养的一般步骤： 实验 复苏——培养——传代— 冻存 一、细胞复苏方法： 1、先在细胞房准备好应当准备的，如清理好无菌操作台、培养基、一个装有9 ml 培养基的10 ml的离心管和37℃的水浴锅； 2、从-80℃的冰箱里取出细胞，迅速到细胞房，然后打开棉花，然后快速的晃动冻存管，1分钟内必须全部溶化掉； 3、将冻存管喷上酒精放进无菌操作台，手上喷好酒精，将手放进无菌操作台里，用枪将细胞转移至准备好的装有9 ml培养基的离心管里，盖紧盖子，用封口膜封好，放进离心机内离心，设定好转速（不同的细胞不一样，如：MCF-7的转速是800 RPM，所有细胞的转速均不要超过1000 RPM）和时间5分钟；