油镜的使用和维护 目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯 原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。 步骤：显微镜油镜的使用和维护 1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。 2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。 3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。 4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。 5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸
擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。 6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。 革兰染色 目的：掌握革兰染色的原理及操作。 材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h 培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液 原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。 步骤： 1. 细菌标本的制作 （1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。 （2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。 （3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是
第四章 微生物反应器操作 1．请用简图分别给出分批操作、流加操作和连续操作中反应器内培养液体积随时间的变化曲线。 2．用简图给出分批培养中初始基质浓度与最大菌体浓度之间的相互关系。 3．请给出分批培养、反复分批培养、流加培养、反复流加培养和连续培养中产物生成速率，并进行比较。 4. 何为连续培养的稳定状态？当0][][===dt P d dt S d dt dX 时，一定是稳定状态吗？ 5. 在微生物分批培养的诱导期中，细胞接种量X 0 ，生成的细胞量为X A 0 ，此间死亡细胞量为X DO ，已知A A f X X =00X 。生成的细胞在接种t l 时间后开始指数型繁殖， t l 以后的细胞量为X，请推导出的关系式。f A 分别等于0，0.2，0.4，0.6，0.8，并作图表示出。 )(l t f X =6.一定的培养体系中细胞以一定的比生长速率进行生长繁殖，如果计划流加新鲜培养基，同时保证细胞的生长速率不变，请问如何确定新鲜培养基的流加速度。 7. 试比较微生物分批培养与连续培养两种操作中的细胞生长速率。微生物的生长可采用Monod方程表达。 8. 面包酵母连续培养中，菌体浓度为10kg/m 3，菌体生成速度为10kg/h，求流加培养基中基质（乙醇）浓度及培养液的量。稀释率1.0=D h-1,Y X/S =0.5kg/kg （以细胞/基质计），可采用Monod 方程，已知μ max = 0.15h -1,K S = 0.05kg /m 3。 9．恒化器进行具有抑制作用的连续培养，比生长速率可由式S i i S C K C K S ++=)1(max μμ 给出，其中g g Y L g C L g K S X i S /1.0,/05.0,/0.1===（ 以细胞/ 基质计）， L g X L g C S /05.0,/0.100==,，求菌体的最大生产速率与相应的稀释率D max ，并与没有抑制时相比较。 10. 一种细菌连续（恒化器）培养中获得如下数据。μ 为比生长速率，S 为限制性基质浓 度，若反应适用Monod 方程，求 和 。 11. 以碳源为限制基质的连续发酵过程中，有一位研究者在研究温度对细胞得率的影响时，发现当温度高于最适生长温度时，细胞得率下降。对此现象一般的解释是因为细胞内为维持细胞活力所消耗的能量增加的缘故。但是，有些研究者研究提出细胞得率在稳态下下降是因为细胞本身活力降低。这一解释也有道理，因为细胞的死亡率是温度的函数。（1）请你利用关于连续培养理论，解释上述温度对细胞得率影响的两种理由。（2）如何设计一些实验来证明在（1）中所导出的方程式的真实性？实验设计应包括实验步骤、所需的分析方法及
微生物的接种技术 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 实验说明 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。 3 实验器材 3.1 器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2 菌种和培养基 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4 实验流程 斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法。 5 操作步骤 5.1 斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～0度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。
右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 5．2 液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图4-5）。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 5.3 固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为： 用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
微生物检验操作步骤 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
样品制备： 取样品 10 g/ml加入至 90 ml灭菌生理盐水中，混匀，制成 1 ︰ 10 的稀释液； 菌落总数：（结果报告：XXX cfu /g(ml)） 取上述 1 ︰ 10 的稀释液 1 ml加入至 9 ml灭菌生理盐水中，充分混匀， 制成 1 ︰100 的稀释液； 取上述两个稀释级的稀释液分别加入2块平皿中，每块平皿中加 20 ml，然后往平皿中倒入约45℃的卵磷脂吐温80琼脂培养基，待培养基凝固，倒置放于36+/-1 ℃培养箱中培养 48 h，点计菌落数。 霉菌和酵母菌： 操作同菌落总数，加入的培养基为虎红培养基，待培养基凝固，倒置放于℃培养箱中培养 72 h，分别点计霉菌和酵母菌数。 粪大肠菌群：（结果报告（未）检出/ ） 取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 10 ml 双倍乳糖胆盐培养基中，摇匀，置 44 ℃培养箱中培养 48 h； 如果培养物产酸产气（现象为培养基呈黄色，小倒管内有气泡），则应取培养物分别接种至伊红美蓝琼脂平板于 37 ℃培养 18-24 h和蛋白胨水培养基中于 44 ℃培养 24 h。 在上述平板上，粪大肠菌群呈深紫黑色、圆形突起的菌落，并有金属 光泽。 挑取分离的单个菌落，进行革兰氏染色和镜检，在显微镜下应观察到 红色短杆状的菌。挑取菌落时，应使灭菌的接种环冷却后再行操作。
上述蛋白胨水培养基的培养物还需做靛基质试验，阳性现象为培养物表层出现玫瑰红色。 铜绿假单胞菌：（结果报告（未）检出/ ） 取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 90 ml SCDLP 培养基中，摇匀，置 37 ℃培养箱中培养 18-24 h； 挑取上述培养物，接种至十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板于 37 ℃培养 18-24 h；在该平板上，铜绿假单胞菌应为灰白色色、圆形湿润的菌落，周围培养基溶有水溶性色的色素； 挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到红色杆状的菌。 如果平板上只分离到1个可疑菌落，不够做生化试验，则应挑取该菌落于SCDLP增菌培养。 取分离的菌落分别做氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验和 42℃生长试验。 金黄色葡萄球菌： 增菌培养同铜绿假单胞菌项下， 挑取上述增菌液的培养物，接种至 B-P 平板于 37 ℃培养 24-48 h；在该平板上，金黄色葡萄球菌应为灰黑色、圆形的菌落，菌落周围有混浊带和透明环 挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到紫色球状的菌。 取分离的菌落分别接种至甘露醇发酵培养基和肉汤培养基中，于 37 ℃培养24 h；取上述肉汤培养物，做血浆凝固酶试验。
1．厌氧生物处理的基本原理是什么？ 答：废水厌氧生物处理是指在无分子氧条件下通过厌氧微生物 (包括兼氧微生物）的作用，将废水中的各种复杂有机物分解转化成甲烷和二氧化碳等物质的过程，也称为厌氧消化。厌氧生物处理是一个复杂的微生物化学过程，依靠三大主要类群的细菌，即水解产酸细菌、产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌的联合作用完成。 2、厌氧发酵分为哪个阶段？为什么厌氧生物处理有中温消化和高温消化之分？污水的厌氧生物处理有什么优势，又有哪些不足之处？ 答：通常厌氧发酵分为三个阶段： 第一阶段为水解发酵阶段：复杂的有机物在厌氧菌胞外酶的作用下，首先被分解为简单的有机物。继而简单的有机物在产酸菌的作用下经过厌氧发酵和氧化转化成乙酸、丙酸、丁酸等脂肪酸和醇类等。第二阶段为产氢产乙酸阶段：产氢产乙酸菌把第一阶段中产生的中间产物转化为乙酸和氢，并有二氧化碳生成。第三阶段为产甲烷阶段：产甲烷菌把第一阶段和第二阶阶段产生的乙酸、氢气和二氧化碳等转化为甲烷。 厌氧生物处理可以在中温（35℃一38℃）进行（称中温消化），也可在高温（52℃一55℃）进行（称高温消化）。因为在厌氧生物处理过程中需考虑到各项因素对产甲烷菌的影响，因为产甲烷菌在两个温度段（即35℃一38℃和52℃一55℃）时，活性最高，处理的效果最好。 厌氧生物处理优势在于：应用范围广，能耗低，负荷高，剩余污泥量少，其浓缩性、脱水性良好，处理及处置简单。另外，氮、磷营养需要量较少，污泥可以长期贮存，厌氧反应器可间歇性或季节性运转。其不足之处：厌氧设备启动和处理所需时间比好氧设备长；出水达不到要求，需进一步进行处理；处理系统操作控制因素较复杂；过程中产生的异味与气体对空气有一定影响。 3、影响厌氧生物处理的主要因素有哪些？提高厌氧处理的效能主要从哪些方面考虑？ 答：影响厌氧生物处理的主要因素有如下：pH、温度、生物固体停留时间、搅拌和混合、营养与C/N比、氧化还原电位、有机负荷、厌氧活性污泥、有毒物质等。 提高厌氧生物处理的效能可考虑：1 .pH维持在~之间, 2.温度可以维持在中温（35℃一38℃），也可以是高温（52℃一55℃） 3.保持较长的生物固体停留时间 4.系统内避免进行连续的剧烈搅拌 5.碳:氮:磷控制为200-300:5:1为宜。 6.需控制有毒物质的浓度，以防止有毒物质影响微生物的生存而使效果降低。
微生物试验操作步骤 1.前期准备工作（红色字体需要购买） 10ml离心管（80管）、培养皿（预实验36板，正式试验648板，共计684板）、EP管（预实验36管，正式试验108管，144管）、枪头（5ml、1ml、200ul）、生理盐水现配现用（0.85）2.，灭菌处理 将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液 预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化，将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中，按1：10比例加入生理盐水，制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管，按1：10比例加入生理盐水，制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中，按1：1010-3比例加入生理盐水，制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养：按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基，大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱，37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内，37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定：采用常规微生物平板菌落计数法，选择长有30-300个菌落的平板较为合适，用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验 按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基 总需氧菌营养琼脂（NA）34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋 大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345
实验室技术操作规范 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
教学基本内容： 讲授微生物反应器的操作方式，包括分批式操作、连续式操作、流加式操作。连续式操作的定义、数学模型，连续稳态操作条件，连续操作的优缺点，在生产上和科研中的应用；流加式操作的定义、数学模型，定流量流加、指数流加的概念，流加式操作的控制优化问题。分批式操作下微生物生长曲线。 5.1 微生物反应器操作基础 5.2连续式操作 5.3 流加式操作 5.4 分批式操作 授课重点： 1. 三种基本操作方式的比较。 2. 单级连续式操作的数学模型，连续稳态操作条件，冲出现象。 3. 连续操作的优缺点及在生产上和科研领域的应用。 4 流加式操作的数学模型，指数流加和定流量流加的概念。 5. 流加操作的控制与优化。 6. 分批式操作下微生物的生长曲线。 难点： 1. 连续式操作的数学模型。 2. 多级连续培养的数学模型。 3. 流加式操作的数学模型。 本章主要教学要求： 1. 理解微生物反应器操作方式的概念。注意连续式操作、流加式操作和分批式操作的区别。 2. 理解和掌握连续式操作的数学模型及连续稳态操作条件。 3. 理解指数流加和定流量流加的区别。 4. 了解连续式操作的优缺点和应用。 5. 了解流加式操作的优化和控制。
5.1微生物反应器操作基础 5.1.1 微生物反应器操作方式 分批式操作：是指基质一次性加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。 连续式操作：是指分批操作进行到一定阶段，一方面将基质连续不断地加入反应器内，另一方面又把反应物料连续不断的取出，使反应条件不随时间变 化的操作方式。 流加式操作：是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按照一定要求 加入到反应器内，以控制限制性基质浓度保持一定，当反应终止时取 出反应物料的操作方式。 V V V 图5－3连续式操作
微生物学实验试题 一、选择题 1.革兰氏染色的关键操作步骤是： A.结晶紫染色 B.碘液固定 C.酒精脱色 D.复染 答:(C) 2.放线菌印片染色的关键操作是： A.印片时不能移动 B.染色 C.染色后不能吸干 D.A和C 答:(D) 3.高氏培养基用来培养： A.细菌 B.真菌 C.放线菌 答:(C) 111821.肉汤培养基用来培养: A.酵母菌 B.霉菌 C.细菌 答:(C) 111822.无氮培养基用来培养: A.自生固氮菌。 B.硅酸盐细菌 C.根瘤菌 D.A、B均可培养 E.A、B、C均可培养 答:(D) 111823.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加: A.二甲苯 B.水 C.香柏油 答:(C) 111824.常用的消毒酒精浓度为: A.75% B.50% C.90% 答:(A) 111825.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是: A.20ml/M3 B.6ml/M3
111826.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是: A.121℃/30min B.115℃/30min C.130℃/30min 答:(A) 111827.巴氏消毒的工艺条件是: A.62-63℃/30min B.71-72℃/15min C.A.B.均可 答:(C) 111828.半固体培养基的主要用途是: A.检查细菌的运动性 B.检查细菌的好氧性 C.A.B.两项 答：(C) 111829.半固体培养基的琼脂加入量通常是: A.1% B.0.5% C.0.1% 答:(B)。 111830.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是: A.排冷气彻底 B.保温时间适当 C.灭菌完后排气不能太快 D.A-C 答:(A)。 111831.目镜头上的“K”字母表示: A.广视野目镜 B.惠更斯目镜 C.补偿目镜 答:() 111832.目镜头上的“P”字母表示: A.平场目镜 B.广视野目镜 C.平场补偿目镜 答:() 111833.物镜头上的“PL”字母表示: A.正低相差物镜 B.正高相差物镜 C.负高相差物镜 答:() 111834.物镜头上的“UVFL”字母表示。 A.无荧光物镜 B.照相物镜
第四章微生物反应器操作习题答案 4．答：连续培养的稳定状态，是指菌体的生长与反应液的排放、基质的流加与反应消耗及 反应液排放、产物的生成与反应液排放达到了动态平衡，因此菌体浓度、基质浓度、产物浓 度保持恒定，即，并不一定是稳定状态。如菌体因生长环境不利出现了死亡时，也满足，但不能 说是稳定状态，此时是一种静止状态，而不是动态平衡。 5．解：诱导期结束时的菌体量： X = X0 + X AO □ X DO = X0 + f A X0 □ X DO = (1+ f A )X0-X DO 菌体在t l 时间后开始指数型繁殖，因此 边界条件： t = t l , X = (1+ f A )X0 □ X DO 积分，得 X = [(1+ f A )X0 □ X DO ]exp[μ (t □ t l )]，如图所示。 当f A = 0, X = (X0 □ X DO ) exp[μ (t □ t l )] ； 当f A = 0.2, X = (1.2X0 □ X DO ) exp[μ (t □ t l )] 当f A = 0.4, X = (1.4X0 □ X DO ) exp[μ (t □ t l )] 当f A = 0.6, X = (1.6X0 □ X DO ) exp[μ (t □ t l )] 当f A = 0.8, X = (1.8X0 □ X DO ) exp[μ (t □ t l )]
6．答：设菌体生长比速为μ，菌体浓度为X，则菌体生长速率为μX。为保证菌体生长速率 不变，应采取指数流加方式，控制稀释率D = μ ，此时流加操作可达到拟稳态， 菌体生长速率DX = uX 。 7．答：微生物的生长可用莫诺方程表达，即 分批培养中菌体生长速率 连续培养中菌体生长速率：
实验十二微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作 一、目的要求 学习灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点。掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。 二、知识介绍 灭菌技术sterilization 为什么要灭菌？（杂菌污染的后果） 1.营养基质或产物被消耗损失； 2.抑制生产菌的生长； 3.抑制产物的生物合成； 4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。 灭菌原理与方法 灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或工艺过程。灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。 （一）、化学物质灭菌 通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。 1.无机酸、碱及盐类 酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。 盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。 （腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌） 2.重金属盐
杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。 比如升汞。 服食牛奶、 鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。 3.氧化剂 高锰酸钾 4.有机化合物 乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。 (二)、辐射灭菌 1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。 2.X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。 （三）、过滤介质除菌 工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。 （四）、干热灭菌 1.火焰灼烧法 2.干热空气灭菌法：140~160℃维持2~3h。 （五）、湿热灭菌 湿热灭菌条件为121℃维持20~30min。 巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法，主要应用于生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种： 1.一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。 第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌 的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
第十五章污水的厌氧生物处理 1．厌氧生物处理的基本原理是什么？ 答：废水厌氧生物处理是指在无分子氧条件下通过厌氧微生物(包括兼氧微生物）的作用，将废水中的各种复杂有机物分解转化成甲烷和二氧化碳等物质的过程，也称为厌氧消化。厌氧生物处理是一个复杂的微生物化学过程，依靠三大主要类群的细菌，即水解产酸细菌、产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌的联合作用完成。 2、厌氧发酵分为哪个阶段？为什么厌氧生物处理有中温消化和高温消化之分？污水的厌氧生物处理有什么优势，又有哪些不足之处？ 答：通常厌氧发酵分为三个阶段： 第一阶段为水解发酵阶段：复杂的有机物在厌氧菌胞外酶的作用下，首先被分解为简单的有机物。继而简单的有机物在产酸菌的作用下经过厌氧发酵和氧化转化成乙酸、丙酸、丁酸等脂肪酸和醇类等。第二阶段为产氢产乙酸阶段：产氢产乙酸菌把第一阶段中产生的中间产物转化为乙酸和氢，并有二氧化碳生成。第三阶段为产甲烷阶段：产甲烷菌把第一阶段和第二阶阶段产生的乙酸、氢气和二氧化碳等转化为甲烷。 厌氧生物处理可以在中温（35℃一38℃）进行（称中温消化），也可在高温（52℃一55℃）进行（称高温消化）。因为在厌氧生物处理过程中需考虑到各项因素对产甲烷菌的影响，因为产甲烷菌在两个温度段（即35℃一38℃和52℃一55℃）时，活性最高，处理的效果最好。 厌氧生物处理优势在于：应用范围广，能耗低，负荷高，剩余污泥量少，其浓缩性、脱水性良好，处理及处置简单。另外，氮、磷营养需要量较少，污泥可以长期贮存，厌氧反应器可间歇性或季节性运转。其不足之处：厌氧设备启动和处理所需时间比好氧设备长；出水达不到要求，需进一步进行处理；处理系统操作控制因素较复杂；过程中产生的异味与气体对空气有一定影响。 3、影响厌氧生物处理的主要因素有哪些？提高厌氧处理的效能主要从哪些方面考虑？ 答：影响厌氧生物处理的主要因素有如下：pH、温度、生物固体停留时间、搅拌和混合、营养与C/N比、氧化还原电位、有机负荷、厌氧活性污泥、有毒物质等。 提高厌氧生物处理的效能可考虑：1 .pH维持在6.8~7.2之间, 2.温度可以维持在中温（35℃一38℃），也可以是高温（52℃一55℃） 3.保持较长的生物固体停留时间 4.系统内避免
微生物检验的基本操作技术 一、无菌操作技术 1、定义 是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法； 无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。 2、内容 无菌操作技术主要包括两方面： 1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等； 2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。 3、无菌操作原则 1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净； 2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等； 3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边； 4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒； 5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处； 6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。 二、无菌操作的环境要求 1、无菌室 （1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；
微生物实验室的工作流 程 GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-
微生物实验室的工作流程 为了防止交叉污染，保护工作人员健康，微生物实验室划分成4个区：污染区、半污染区、无菌区、清洁区，以下为各个区的工作制度。?一、污染区? (一)?实验室工作人员进入操作区应穿好工作服并配戴好口罩、帽子、手套及鞋套，严格按照操作规程进行。?(二)?每天早上工作前，每天工作后，用紫外线照射60?min?，对整个操作区进行消毒；? (三)?本区只能进行：临床标本的接收，保存，标本接种、培养、及其菌株检验前处理、菌悬液制备、染色标本检查、非上机鉴定与药敏试验操作等危险操作，其它操作不得在此区进行。（注：标本的接种和涂片必须在生物安全柜中进行，直接涂片、革兰染色和抗酸染色的片子必须通过生物安全柜紫外线照射30?min才可拿出进行染色观察。）?(四)?污染物处理：操作区备有消毒缸，以处理沾有细菌的玻片等污染物品。检验剩余的标本及使用过的带菌平板等集中地点安全放置，经消毒灭菌处理后再洗涤或丢弃。?(五)?工作结束后必须立即对操作区进行清洁或消毒。操作区地面用专用拖把每天拖1?次，每周用消毒剂擦洗1?次。下午工作结束后用消毒液消毒工作台面，以保证工作环境的安全清洁。? (六)?非本实验室工作人员未经允许不得进入。?二、半污染区? (一)?实验室工作人员在此区穿好专用工作服并配戴好口罩、帽子、手套及鞋套，严格按照操作规程进行。?(二)?每天早上工作前，每天工作后，用紫外线照射60?min?，对整个操作区进行消毒；?
微生物学实验报告 （格式标准参考） (生命科学专业，生物技术专业) 教师：黎勇
目录索引 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 (3) 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 (4) 实验三常用培养基的配制 (6) 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 (7) 实验五、微生物大小的测定与显微计数 (9) 实验六环境中微生物的检测和分离纯化 (10) 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应 (12) 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 (13) 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科
实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1.N·A=n·sinα 2.D=λ/2N.A 3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制） 菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌 放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5） 特殊结构：无特殊结构：无 视野观察下微生物的形态 2、油镜使用时为什么必须干燥装片？
食品卫生微生物检验实验室操作要求 核心提示：食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 一、无菌操作要求 1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。
培养基制备 培养基概念： 是指以液体、半固体或固体形式，包括天然或合成成分，用于增进微生物繁殖或保持其活力物质构成。由于各类微生物对营养规定不同，培养目和检测需要不同，因而培养基种类诸多。咱们可依照某种原则，将种类繁多培养基划分为若干类型。 培养基分类： 按功能分类：基本培养基、营养培养基、鉴别培养基、选取培养基、特殊培养基。 按物理性状分类：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。 液体培养基：所配制培养基是液态，这种培养基被用来微生物增菌和生长状态观测。 固体培养基和半固体培养基：在液体培养基中加入适量凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基。惯用作凝固剂物质有琼脂。固体培养基琼脂用量1.5-2%，半固体培养基琼脂用量在0.5～1%之间。固体培养基用作微生物分离、鉴定、计数、保藏等。半固体培养基被用来观测微生物动力和保藏菌种。 今天给人们展示一下各种培养基制备。 培养基制备基本过程： 调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查和保存 所需物品：试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。
（1）调配成分： 在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml，1％蛋白胨，0.5％NaCL，0.3％牛肉膏（g/v），精确称取各种成分，使其充分混合。[注意事项] 培养基调配溶解： 先在锥形瓶底加入少量蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅，搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁和铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过0.14mg/L时抑制细菌毒素产生，含铜量超过0.3mg/L时抑制细菌生长）。培养基中若需加入染料，胆盐，批示剂等，应在校正pH后加入。 （2）溶解： 将配制好混合物微波炉加热8min，使其完全溶解，补足失水。（3）校正PH： 不同细菌需要在含不同pH培养基上生长，普通将培养基pH调至7.2～7.6。商品化试剂配制后可省略该环节，无需校正PH。依照所需培养基用途不同分别加入不同含量琼脂，制成半固体培养基和固体培养基。 （4）分装：（液体培养基、半固体培养基和某些固体培养基分装可在灭菌钱也可在灭菌后） ①基本培养基：普通分装于容量为500ml锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；
宽城疾控检验科微生物实验室标准操作程序--------SOP文件 ●细菌室工作守则（微生物室SOP之一） ●细菌室消毒隔离措施（微生物室SOP之二） ●微生物实验室安全与防护（微生物室SOP之三） ●细菌室内质控制度（微生物室SOP之四） ●细菌室操作技术规范（微生物室SOP之五） ●无菌间规章制度（微生物室SOP之六） ●菌（毒种）管理办法（微生物室SOP之七） ●细菌室仪器维护保养及质控措施（微生物室SOP之八）●标准菌株保存及使用（微生物室SOP之九） ●细菌室内务管理规定（微生物室SOP之十） ●标本采集及保存要求（微生物室SOP之十一） ●酶标仪（微生物室SOP之十二） ●细菌鉴定室内质控处理程序（微生物室SOP之十三）●标本拒收标准（微生物室SOP之十四） ●温度失控处理措施（微生物室SOP之十五） ●超净工作台（微生物室SOP之十六） ●标本的接种和移种法（微生物室SOP之十七）
细菌室工作守则 （微生物室SOP之一） 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量 减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操 作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标 本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰 灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液 中5----10分钟，再用肥皂洗手并冲洗干净； 8.如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧 水漱口，根据实际情况服用有关药物。 9.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上 半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。10.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极 灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。
目录 1、EGSB反应器介绍 (1) 2、EGSB厌氧工艺原理 (1) 3、EGSB反应器特点 (1) 4、EGSB反应器启动运行 (2) 1）菌种驯化 (2) 2）颗粒污泥培养 (2) 3）负荷提高 (2) 3）试运行 (2) 5、EGSB反应器主要参数控制 (2) 1）反应器有机负荷 (2) 2）上流速度 (3) 3）环境因素的控制 (3) 6、影响EGSB反应器的环境因素 (3) 1）温度及温度的波动 (3) 2）PH值范围及PH缓冲能力 (4) 3）营养物与微量元素 (4)
EGSB反应器使用说明书 1、EGSB反应器介绍 EGSB即膨胀颗粒污泥床反应器，系第三代厌氧反应器，反应器中颗粒污泥床处于部分或全部“膨胀化”的状态。为了提高上流速度，EGSB反应器采用较大的高度—直径比和大的回流比。在高的上流速度和产气的搅动下，废水与颗粒污泥间的接触更充分。由于良好的混合传质作用，EGSB反应器内所有的活性的细菌，包括颗粒污泥内部的细菌都能得到来自废水的有机物，也就是说，在EGSB 内更多微生物参与了水处理过程。因此可允许废水在反应器中有很短的水力停留时间。 2、EGSB厌氧工艺原理 厌氧消化过程可划分为四个相对独立但密不可分的步骤：水解阶段、酸化阶段、产氢产乙酸阶段和产甲烷阶段。 第一组微生物，酸化细菌完成厌氧消化过程的前两个步骤，即水解和酸化。它们通过胞外酶将聚合物如蛋白质、脂肪和碳水化合物水解为能进入细胞内部的小分子物质，在细胞内部氧化降解而形成二氧化碳(CO2)、氢(H2)和主要产物－挥发性脂肪酸(VFA)。 第二组微生物，产氢产乙酸菌在酸化过程中把上述产物转化为乙酸盐、氢及二氧化碳。 第三组微生物是产甲烷菌，它们将乙酸盐或氢和二氧化碳转化为甲烷。3、EGSB反应器特点 1）BOD去除率高（90%～95%）；运行稳定，构造简单。 2）更易形成颗粒污泥且分布均匀，污泥床内生物量多（可达60g/l）；非常适用于中高浓度有机废水处理。 3）容积负荷率高（20～30kgCOD/m3.d），停留时间较短，因此所需容积大大缩小；反应器容积负荷率高出普通UASB反应器2-3倍以上。 4）运行方便，采用旋混布水方式，布水均匀，传质较果好，而且不存在堵塞短流问题。 5）增设了外回流系统，厌氧反应器运行中碱度可通过回流水可以实现碱度