免疫组化实验结果的判定和分析
免疫组化实验结果的判定和分析
就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。免疫组化结果的判定原则：1?必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。
2?抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA
及p53 蛋白应定位在细胞核内；EMA 应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
3?阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏
度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。
4?尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这
类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。
5?对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合
分析。
对照染色设计：
（一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三种：
①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；
②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；
③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH 和离子强度不当等。假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：
①自发荧光或内源酶等干扰；
②抗体试剂不纯（特别是一抗）；
③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；
④Fc 受体的干扰，等等。
（二）对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。
?阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。
?阴性组织对照
指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的
是除外假阳性。
?阴性试剂对照
是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。
⑴ 空白对照
指以缓冲液（PBS、TBS 等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。
⑵ 取代对照
指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体（靶生物缺如的）取代第一抗
体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。
⑶ 吸收试验
是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。
⑷ 抑制试验
是指用标记抗体和未标记抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体）两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱（等量或1：9）。此试剂对照多用于直接法。
这类阴性试剂对照的选用原则是：
①空白对照不能省，其他对照在预实验中应多做，尤其是应用新抗体试剂；
②对照必需与实验片同步进行染色；
③对照的结果应附合要求。
4.自身对照
是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。
非特异性染色：
非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：
①内源性干扰（自发荧光、内源酶、内源性生物素等）；
②试剂污染（质量差，交叉反应，Fc 受体干扰等）；
③组织处理不当（组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的
游离试剂残留等）。
纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，即对症下药。阳性标记的形态特征和判断：
免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。特点包括定性、定位和定量三方面。
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。
一、阳性标记免疫特征分"弱（+）、中（++）、强（+++）"三级。免疫荧光法（FITC 为例）则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
免疫酶标记（HRP- DAB/H 2O2）则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图片照像，原则上多取强阳性区域。
二、阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H 2O2 为例）
可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质（浆）型；④微绒毛型和⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。
三、阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H 2O2 为例）
免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：①局灶型；②弥漫型；③
片块型；④网状型；⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型等。这主要取决抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。
四、阳性标记强度特征
依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为：
弱阳性（+1分；
中等阳性（++2分；
强阳性（+++ 3分。
依照阳性细胞数量，可分为：
弱阳性（+ ，指阳性细胞总数在25% 以下）；
中等阳性（++,指阳性细胞总数在25% —49%）；
强阳性（+++ ，指阳性细胞总数在50%以上）。
目前多采用积分综合计量。计算公式为：（+）%x1 + （++ ）%x2+ （+++ ）%x3 ；总数值<1.0
者为（+）， 1.0-1.5 者为（++）,>1.5 者为（+++）。至少随机观察5-10 个HPF 。
文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分 文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话： 是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是 项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。 如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。 1.对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。 2.定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了
过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了
免疫组化结果分析篇1:免疫组化（IHC）经验超全总结 做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。 一、石蜡切片和冰冻切片的比较？ 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 二、一抗的选择要点和技巧是什么？ 单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 应用范围的选择。有的一抗只能用于WB（Westernblotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。 种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此
免疫组化的图象分析 我这里说的免疫组化图片，是这样的一类图片：染上的颜色是黄色，如果染得浓，就呈现棕黄色。（制作样品的过程可别问我。我不知道） 要比较 不同切片的光密度值来确定它们之间的蛋白表达的差异，首先要注意的就是这些切片样品要用尽可能完全一致的方法来处理。最近看到一个新技术挺不错，就是把各个样品定位后，各切出一个小细条，整整齐齐排成一个阵列，包埋在蜡块中，切成一片切片，然后进行免疫组化反应及染色处理。这样在一个载玻片上就有了数百个小切片，不仅它的的切片染色条件一致，还节省了抗体试剂。 切片当然首先得拍成照片才能进行分析。拍照也是一个重要环节，在显微镜下拍摄免疫组化照片需要注意以下几个要点： 1. 所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄，在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍 摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。当然，在使用高倍镜时对焦及寻找视野会稍麻烦一点，但也没办法。保持各张切片的拍摄条件一致更 重要。 2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉！！！ 3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在230-240之间。如果 呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。下面两张照片中左边一张 是合适的曝光，右边那张不好。 打开要分析的图片后首先要进行光密度校正。
免疫组化结果分析的判定 免疫组化实验结果的判定和分析 就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。免疫组化结果的判定原则： ⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。 ⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。 ⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。 ⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。 对照染色设计： (一）对照染色的目的 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三种： ①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽； ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）； ③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH和离子强度不当等。 假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有： ①自发荧光或内源酶等干扰； ②抗体试剂不纯(特别是一抗）； ③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等； ④ Fc受体的干扰，等等。 （二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。 ⒈阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。⒉阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性 ⒊阴性试剂对照
一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项
一文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项... 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：“想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话：“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲...... 免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐
亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值1.5者为(+++)。4.图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐的是一款图像分析软件：Image J。毛博当年在米国做博士猴的时候，就是用的这款软件。这是NIH开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到了1.50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所示。现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成了2个细胞。然后，就可以正式开始分
免疫组化实验结果的判定和分析 免疫组化实验结果的判定和分析 就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。 免疫组化结果的判定原则： ⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。 ⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。 ⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。 ⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。 对照染色设计： (一）对照染色的目的 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三种： ①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽； ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）； ③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH和离子强度不当等。 假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有： ①自发荧光或内源酶等干扰； ②抗体试剂不纯(特别是一抗）； ③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等； ④ Fc受体的干扰，等等。 （二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。 ⒈阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。 ⒉阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。 ⒊阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其 对策 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过，但偶尔也
遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性
一文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项、、、导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟:“想拿高分文章,不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话:“就是这个理,今天我就豁出去,将我十多年的心得与经验奉献给小师弟您了。”小师弟感激涕零,唯诺细听两位前辈的教诲、、、、、、 免疫组化,免疫组织化学技术(immunohistochemistry),就是一项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位,定性的实验技术。免疫组化主要用的就是组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理切片与组织芯片)与冰冻切片。石蜡切片,对组织形态保存好,保存时间也长,虽然对组织抗原暴露有影响,但可以抗原修复,所以石蜡切片仍然就是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候,我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但就是却不知道如何正确地分析,得出理想的结果。这实在就是一件憾事。如下图,正常的结果应该就是这样的:镜下细胞核呈蓝色,阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法与评分法。前者就是在40*光镜下,随机10个视野下计数阳性着色细胞;后者则就是在光学显微镜下按染色程度(0分阴性着色,1分淡黄色,2分浅褐色,3分深褐色)与阳性范围(1分0-25%,2分26-50%,3分51-75%,4分76-100%)评分,最终分
数相加。 免疫组化结果分析就是毛博的特长,以下就是她传授的独门 绝技。 1、对照染色 与做实验的时候必须设立对照组一样,免疫组化也必须设立 对照染色。没有对照染色的免疫组化结果就是不可信的。对照一般有阳性组织对照,阴性组织对照,阴性试剂对照,自身对照。一般来说,有一个阳性组织对照与一个阴性组织对照就足够了。 2、定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上;CK应定位在细胞浆内;PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色,不能视为确切的阳性结果。有可能就是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 3、半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果您的实验室不幸没有那么高大上的话,就只好赶鸭子上架,用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强,所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光与亮绿色耀眼荧光。弱(+)=1,中(++)=2,强(+++)=3。至少随机观察5-10个HPF。