第二章（10）植物花药（花粉）培养
1花药培养
是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。
2花粉培养
是将花粉从花药中分离出来，接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程。
3花药培养过程
3.1预处理
低温冷藏是最常用的方法。烟草7?9C , 7?14d ;黑麦1?3 C , 7?14d。
3.2表面消毒
用70%酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可以达到灭菌的要求。
3.3接种
在无菌的条件下把雄蕊上的花药从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养。
不要使花药受到损伤，否则会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。接种的“密度效应”，要有一个合理的群体数量。
3.4培养形成花粉植株。
花粉--- 愈伤组织 --- 苗；花粉 --- 胚状体 --- 苗。
培养方式：①琼脂固化培养基表面培养；②30%Ficoll的液体培养基表面漂浮培养;
③固 - 液双层培养。
4花药培养脱毒
1974 年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；
4.1花药采取时期单核期：花蕾4?6mm花药1mm.
4.2花药诱导愈伤组织培养基
MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L蔗糖 30g+琼脂 7g/L
4.3增殖分化培养基
MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L蔗糖 30g+琼脂 7g/L
4.4生根培养基
1/2MS+IBA0.2mg/L+ 活性炭 3g/L+ 蔗糖 20g+琼脂 7g/L
5单倍体植株染色体加倍的方法
5.1自然加倍
花粉细胞核有丝分裂或核融合，染色体可自然加倍，获得纯合二倍体。
5.2人工加倍
用秋水仙素处理单倍体植物，可使染色体加倍（溶液浸苗、处理愈伤组织和用含秋水仙
0.4% 素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株）
5.3将单倍体植株诱导的愈伤组织反复继代培养，再分化可得到二倍体植株。
6花药和花粉培养的应用
6.1克服后代分离，缩短育种周期；
6.2有利于筛选隐性突变体，选择效率高 ;
6.3有利于隐性基因控制性状的选择 ;
6.4快速获得自交系的超雄株
本节小结：在单倍体细胞中只有 1 个染色体组，表现型和基因型是一致的，一旦发生突变，无
论是显性还是隐性，在当代都可以表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。通过本节的学习，我们要掌握花药培养的过程，还有单倍体加倍技术。
在品种间杂交育种程序中，通过 F1 代花药培养得到的单倍体植株后，经染色体加倍后成为纯和二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要 2 个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。
思考题：
1 花药培养的过程是什么 ?
2 单倍体加倍的方法有哪些？
植物花药培养与花粉培养的不同 艾莉 绵阳师范学院生命科学与技术学院12级2班1211010219 摘要植物组织培养是研究植物生长和分化规律的重要手段，植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。花药培养和花粉培养是植物组织培养中的两大技术，且都在育种上有很大的意义，本文主要从两者的概念、培养层次、培养过程、培养难易程度来综述花药培养和花粉培养的不同。 关键词花药培养、花粉培养、不同 自从印度学者Guha和Maheshuari1964年报道从毛叶蔓陀罗花药培养中获得了单倍体植物和再生植株[1]，80年代后期到90年代期间花药培养技术迅速发展，多作物小孢子培养已经成功。到目前为止，据不完全统计，已经有200多种植物通过花药培养技术获得单倍体。花粉培养是在花药培养的基础上发展起来的技术，两者都在基因遗传、作物育种上起着很大的意义，本文主要从以下几个方面论述两种培养技术的不同。 1.概念 1.1花药培养 花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株，其培养材料是花药。 1.2花粉培养 当花粉发育到一定阶段，从花药中分出单个花粉粒，为获得单倍体植株接种到特定培养基上，诱导其长出愈伤组织，再将愈伤组织移植到另一种特定的培养基上〔含不同配比的细
胞分裂素和生长素〕，诱导分化出根和茎、叶，成为完整的植株。其培养材料是单个的花粉粒。 故花药培养和花粉培养概念不同，其研究对象不同。 2.培养层次 花药培养是将花药接种到培养基上，其外植体为花药，花药为花的雄性器官，故花药离体培养属于器官培养。 花粉离体培养是将花药中的花粉粒接种到培养基，其外植体为花粉粒，花粉粒即雄配子体，其本质是单个细胞，故花药培养属于细胞培养。但两者其最终的目的是一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。 从培养层次上来看前者是器官培养，而后者是细胞培养，培养范畴不同。[3] 3.培养过程 3.1花药培养过程 ①选择材料 ②把花粉发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上进行离体培养 ③花粉在培养基所提供的特定条件下可以发生多次分裂，形成类似胚胎的构造（胚状体）或愈伤组织 ④诱导愈伤组织分化出芽和根，最后长成植株 培养过程简述如下：选择材料-消毒-接种培养-愈伤组织生成-分化出单倍体植株。 3.2花粉培养过程 ①选择材料 ②将花粉进行预处理预培养数天，然后再分离花粉 ③通过无菌操作技术，将分离出的花粉接种在人工培养基上进行离体培养 ④花粉在培养基上发生多次分裂，逐渐形成胚状体或愈伤组织 ⑤诱导愈伤组织分化出芽和根，最后长成植株
课题2月季花药培养 一．被子植物花粉发育过程 1．被子植物的花粉是在中由经过分裂形成的。所以，花粉是的生殖细胞。 2．结合教材内容填下列示意图： [思考1]被子植物的花粉的发育要经历时期，期和期等阶段。 [思考2]正常情况下，一个小孢子母细胞可产生个精子；一枚花药中可产生个花粉。二．产生花粉植株的两条途径 1．产生花粉植株（即单倍体植株）的两种途径：一是花粉通过阶段发育为植株，二是通过阶段发育为植株。这两种途径的区别主要取决于培养基中的种类及其的配比。 2．填写培育花粉植株的途径图解： 3．胚状体的结构及其发育过程与种子相似，所以把胚状体到从芽的过程称为，而把从愈伤组织到从芽的过程称为。 4.植物体细胞发育而来的胚状体又叫，花粉发育而来的胚状体 叫，可发育为植物，要使其成为纯合的正常植株，可用 处理发育中的幼苗。 三．影响花药培养的因素 1．影响花粉植株成功与否和成功率的主要因素：和等。2．材料的选择： ①从花药来看，应当选择（初花期、盛花期、晚花期）的花药； ②从花粉来看，应当选择（四分体期、单核期、双核期、萌发期）的花粉，因为单核期以前的花药，选择单核期以后的花药接种，。 ③从花蕾来看，应当选择（完全未开放、略微开放、完全盛开）的花蕾。
四．实验设计 1.材料的选择 选择花药时一般通过确定花粉发育时期，此时需要对花粉细胞核进行染色，最常用的染色剂是和，它们分别可以将细胞核染成色和色。 2.材料的消毒 3.接种和培养 （1）剥取花药：消毒后的花蕾，要在条件下除去花萼、花瓣。在剥离花药时，要尽量不损伤花药，否则还要彻底除去花丝，因为。 （2）接种花药：剥取的花药要立刻接种到上。每个培养瓶接种个花药。（3）培养：花药培养利用的培养基是培养基，pH为，温度为℃，幼苗形成之前（需要、不需要）光照。 （4）培养20－30d后，花药开裂，长出或释放出。前者还要转移到上进行分化培养成再生植株；后者要尽快并转移到新的培养基上。（5）通过愈伤组织形成的植株，常常会出现的变化，因而需要鉴定和筛选。
第六章植物花药和花粉培养 第一节单倍体的概念及发生方式 一、植物单倍体的概念 1、单倍体：指具有配子体染色体组的孢子体。或具有配子染色体数的细胞或个体。 二、单倍体的发生方式(4 种) 1、孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步发育成单倍体植物。 2、孤雄生殖：在传粉后卵细胞退化消失，由精细胞单性发育成为单倍体植物。 3、无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。 4、人工诱发单倍体途径：1966年前: 人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、延迟受粉、用照射花粉授粉。 目前: ⑴离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。——花药和花粉的培养 ⑵离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物体。——胚胎培养 三、雄核的发育途径 1.单核小孢子进行一次均等分裂形成两个等同的子细胞，而不是形成相互不同的营养细胞和生殖细胞，这两个子细胞进一步发育成愈伤组织或胚状体。（pathway I) 2.单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂： 1）然后通过营养细胞进一步分裂形成愈伤组织或胚状体（pathway II) 2）营养核退化，而生殖核进一步发育成单倍体植株（pathway III)。 3）两个细胞都参与愈伤组织或胚状体的形成。有些时候两个核融合而导致非单倍体的形成（pathway IV)。 第二节植物花药与花粉培养 一、概念 花药与花粉培养：指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株后使之二倍化的技术。 雄蕊结构：花药是花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（2n）和花粉粒(1n)组成。花粉粒（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。 花药和花粉培养的基本程序 外植体的选择—外植体（花蕾）预处理—外植体消毒—剥取花药（—分离花粉粒）—接种—诱导培养—分化培养 二、材料选取 1、花粉发育时期的选择 一般情况下，对大多数植物来说，在单核时期（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。 四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期 ------------------------ ---------------------------------------- 小孢子花粉粒 ---------------- ---------------------------------- 花粉培养花药培养 培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细胞学花粉发育时期的镜检（醋酸洋红）。(花蕾或幼穗大小、颜色等形态学性状，瓣长/药长比） 2、基因型 供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。二棱大麦比四棱和六棱大麦愈伤组织诱导率高,小麦品种间杂种比纯种更易产生愈伤组织. 3、生理状态的选择 花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高2—3倍。 4、外植体预处理对花粉培养的影响 （1）低温度处理：Nitsch（1973）低温处理可以明显提高花粉胚的诱导率，3℃下保存48h，花粉胚的诱导率提高了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药7～9℃下7～14d为宜；水稻处理10℃、48h；小麦和黑麦需在1～3℃下2～20d得到良好效果。 低温处理的作用机理就目前来看有两种观点：一种认为低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，结果使得花粉朝着胚胎方向发育；另一种观点认为低温的作用是使花粉保持了较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。 （2）离心处理Tanaka（1973）将单核后期的烟草花药在10000～11000r/min的速度下离心30min，产生小植株的频率从30.5%提高38.2%，每个花药产生的小植株数目从对照的平均1.6株提高到5.4株。 （3）乙烯处理Bennett和Hughes(1972)在研究小麦化学去雄时注意到，在减数分裂前用乙烯利喷施植株，促使花粉细胞核发生分裂。王敬驹（1979）在培养基中及植株上分别施加乙烯利，小麦花药培养基中较低浓度的乙烯利（40～
第二章（10）植物花药（花粉）培养 1花药培养 是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。 2花粉培养 是将花粉从花药中分离出来，接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的过程。 3花药培养过程 3.1预处理 低温冷藏是最常用的方法。烟草7?9C , 7?14d ;黑麦1?3 C , 7?14d。 3.2表面消毒 用70%酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可以达到灭菌的要求。 3.3接种
在无菌的条件下把雄蕊上的花药从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养。 不要使花药受到损伤，否则会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。接种的“密度效应”，要有一个合理的群体数量。 3.4培养形成花粉植株。 花粉--- 愈伤组织 --- 苗；花粉 --- 胚状体 --- 苗。 培养方式：①琼脂固化培养基表面培养；②30%Ficoll的液体培养基表面漂浮培养; ③固 - 液双层培养。 4花药培养脱毒 1974 年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 4.1花药采取时期单核期：花蕾4?6mm花药1mm. 4.2花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L蔗糖 30g+琼脂 7g/L 4.3增殖分化培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L蔗糖 30g+琼脂 7g/L 4.4生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+ 活性炭 3g/L+ 蔗糖 20g+琼脂 7g/L 5单倍体植株染色体加倍的方法 5.1自然加倍 花粉细胞核有丝分裂或核融合，染色体可自然加倍，获得纯合二倍体。 5.2人工加倍 用秋水仙素处理单倍体植物，可使染色体加倍（溶液浸苗、处理愈伤组织和用含秋水仙 0.4% 素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株） 5.3将单倍体植株诱导的愈伤组织反复继代培养，再分化可得到二倍体植株。 6花药和花粉培养的应用 6.1克服后代分离，缩短育种周期； 6.2有利于筛选隐性突变体，选择效率高 ; 6.3有利于隐性基因控制性状的选择 ; 6.4快速获得自交系的超雄株 本节小结：在单倍体细胞中只有 1 个染色体组，表现型和基因型是一致的，一旦发生突变，无