一、细胞室灭菌
1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置
于超净台内，紫外照射20-30min。
2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。培养细胞和培养用液不可照射
紫外。）
3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。
4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。
5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。）
二、胶原酶1的配置
分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。
具体方法为：（以下过程均在超净台内操作）
1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。
2.加入12ml PBS溶液。
3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。
4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉
素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。
三、取材并分离心肌细胞
1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。
2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。
3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超
净台内。
先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min.
4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠
左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。
5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。
6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。
7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，
在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。
8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取
出余血。
9.继续冲洗2-3遍，
10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净
处），加入2ml PBS溶液。
11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。
12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。
13.取出4个10ml 玻璃离心管，各加入4ml含血清及BRDU的DMEM于其中。
14.在含心脏碎片的玻璃瓶中加入2ml胶原酶1溶液。
15.从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含37°C
热水），37°C消化5min。
16.取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血
清和BRDU的DMEM的玻璃离心管中，此时加入到离心管中的上清中的胶
原酶被稀释而减弱消化反应。
17.在剩下的细胞碎片中再加入2ml胶原酶溶液，重复消化2次，每次消化
结束后，均需将上清吸到上述离心管中。
18.第4次消化改为37°C消化7min，将上清转移到离心管中反复重复消化
（共4次37°C，7min）至不能消化为止。
19.取含细胞消化液的玻璃离心管，用枪吹打混匀，使酶与DMEM充分混匀，
并进一步分离组织块。
20.配平后，从超净台中取出，1000转离心5min。
21.离心结束后，取出离心管，拿回超净台内。
22.取滴管1支，火焰灼烧整个滴管，置于滴管架上放凉备用。
23.用滴管吸掉离心管中上清培养液以除去胶原酶，若吸不干净，管底允许
留少许培养液。
24.用枪加4ml新鲜的含血清和BRDU的DMEM于离心管中。
25.取一只新的滴管，灼烧冷却后，吹打离心管中细胞，至细胞均匀悬浮。
为控制吹打后量，吹打次数可固定，如100下。吹打时，滴管头部置于
溶液底部，防治吹打出气泡。
26.将200目筛网置于灭过菌的烧杯上，用滴管吸取细胞悬液，加到筛网上
过滤，以除去未消化的组织块，只让单个细胞过滤到烧杯中。
此时，得到的细胞即为分离好的乳鼠原代心肌细胞及成纤维细胞。
四、分离的心肌细胞的培养
1.将烧杯中的细胞溶液吸到培养瓶中/6孔板/96孔板中，做好标记。
2.若用培养瓶培养，则先将瓶塞拧松半圈，置于孵箱中静置1-2h。
3.因为成纤维细胞先贴壁，1-2h后，取出孵箱中的培养瓶于超净台中，竖起培
养瓶，用滴管吸取细胞溶液于细口瓶。
4.吹打均匀后，用细胞计数板计数。
5.计数技术后，向6孔板中种细胞。用枪从细口瓶中吸取细胞溶液，加入到6
孔板中，摇匀后，补充新鲜的含血清和BRDU的DMEM至2ml左右，标记后置孵箱中培养。
注：四1、2步骤后可显微镜观察培养瓶中的细胞。
五、清理实验用品和台面，并用酒精棉球擦洗超净台台面。
备注：接种细胞密度依实验目的而定
一般而言，进行细胞实验时，应结扎5×105密度/孔
提取蛋白实验时，应接种5×106密度/孔。
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳. 2消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性 分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染. 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择 成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞. 7换液时间 进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响. 8抗污染措施
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】 ：目的 乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但 是心肌细胞成活率、 搏动率， 纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。 本文 探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠 心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和
Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。 因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套， 操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段 除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。 4．心肌细胞纯化 在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力， 且生长迅速， 比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离， 成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想 方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c) ，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine， BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常
新生大鼠心肌细胞培养技巧 原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中 我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长大量观测表明，选择1~3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳 2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用 . 消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶 透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏 .胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶 I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g?L1,我们使用的为0.8gL1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感 .消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测 .消化过程中使用磁力搅拌器时应注意 :(1)转速一般控制在60~80rmin1左右 .(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织 .(4)适宜温度为35~37℃
.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率接种细胞的绝对数量应经精确计算 . 一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象. 因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞 .溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长 .但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％上的心肌细胞 . 7 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液 .这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实 此外，去血清后可用ITS和0.1gL1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响 .
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用 分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
原代心肌细胞培养方法探讨1 邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014） 周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021） 摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。 关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠 Explore a method of neonatal rat myocardial cells in culture ZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, China Abstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity. Key words Myocardial Cells; Culture; Rat 随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。 1材料与方法 1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰 1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）
成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：
4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35) 4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶 45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ 4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005] 30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA 5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35) 5.1 20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。 5.2 100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。 100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。 50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。 5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL 复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL 复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。 6.心肌细胞分离 其步骤简述如下： 1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重） 2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内 残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。 3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液 4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙 台式液灌流约10min 5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约2min。 6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。 7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。 8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入 新鲜含2%BSA的KB液。 9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。 另一说： 8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。 9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养 1.动物与仪器 1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。 1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。 2.方法 2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。 2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。 2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。 2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％. 2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
一、细胞室灭菌 1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置 于超净台内，紫外照射20-30min。 2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。培养细胞和培养用液不可照射 紫外。） 3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。 4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。 5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。） 二、胶原酶1的配置 分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。 具体方法为：（以下过程均在超净台内操作） 1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。 2.加入12ml PBS溶液。 3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。 4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉 素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。 三、取材并分离心肌细胞 1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。 2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。 3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超 净台内。 先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min. 4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠 左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。 5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。 6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。 7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形， 在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。 8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取 出余血。 9.继续冲洗2-3遍， 10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净 处），加入2ml PBS溶液。 11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。 12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。 13.取出4个10ml 玻璃离心管，各加入4ml含血清及BRDU的DMEM于其中。 14.在含心脏碎片的玻璃瓶中加入2ml胶原酶1溶液。 15.从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含37°C 热水），37°C消化5min。 16.取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血
作者：王涛，余志斌，谢满江，车红磊 【关键词】细胞培养 【关键词】细胞培养；心肌细胞；大鼠 引言原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中。我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1. 新生大鼠鼠龄的选择 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想。其中，尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。 2. 消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用。消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶。透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用。胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏。胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I。文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g ?L，我们使用的为0.8 g?L。胶原酶最好现用现配。 3. 消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感。消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测。消化过程中使用磁力搅拌器时应注意：(1)转速一般控制在60~80 r?min左右。(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定。(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织。(4)适宜温度为35~37℃。 (5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化。 4. 接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率。接种细胞的绝对数量应经精确计算。一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量。例如，如作形态学观测，六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养 ㈠、概述 整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。 ㈡、[试剂] 1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。 2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。 3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L ㈢、[实验步骤] 1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心
脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中 （37℃5%CO2）培养。
乳鼠心肌细胞培养经验谈 1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降： 胰酶＋胶原酶II混合消化的方法，并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2.5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。 经验一： 总结来说： 1.0.08％胶原酶II＋0.125%胰酶等比混合后消化 2.消化前后一定要轻柔吹打 3.重悬时要充分吹打，动作轻柔（100次） 4.种板密度要合适 5.当然血清，板都要进口，别图便宜 6.别忘了检查CO2温箱的情况 2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走： 胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧，或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。 经验二： 1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的，活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的，再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。 2:胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了,处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5%血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。离心1000转4分钟. 3:四季清的胎牛血清,180元一瓶,很便宜,进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱,我建议用进口的.我们用的是15%的浓度.(注意:终止液和培养液浓度是不同的,终止液没必要用那么高浓度,有点浪费),我们用高糖的DMEM,感觉不错.在这里我感觉最重要的培养液的PH值,尽量在7.2-7.4之间,刚开始我们还有仪器测,后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调,大部是高,没有低的.所以NAOH没有用过. 4:离心管和瓶最好是用进口的,还要差速贴壁.细胞接种的浓度最好高些,宁可浪费一些.也不要让浓度太低,低了不容易活.这个本人觉得可能是细胞之间会产生某些刺激生长的东西,再说了,不管浓度高低肯定会有一些死细胞存在的,死的细胞对活细胞的生长也是有害的,所以尽量接种浓度要高些。 心肌细胞培养最好的培养基相关问题讨论总结 乳鼠心肌细胞培养培养基可以用EMEM,MEM,DMEM,M199,MCDB107液,DMEM/F12液，其中以DMEM/F12液最佳，ph值为7.2-7.4。 DMEM/F12养原代心肌，依赖于开始养的细胞状态。DMEM/F12可能开始会使细胞状态可以，提前拨动，但也会让细胞提前老化，所以很难控制最佳状态，提高血清会提高细胞的贴壁率，当然也会带来成纤维的干扰，事实上有点成纤维，心肌会长的更好。HG-dmem+10%FBS养，感觉状态比较好控制，次日下午就可以看到跳动，第三天同步搏动就可以开展实验了，之后细胞呈老态化，数目减少，成聚，个个像个会搏动的向日葵。
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定 1、材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。 1.1.2主要仪器与试剂 5％CO 2恒温培养箱（model TC2323 CO 2 incubator）；倒 置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。 1.2方法 于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。 随后用上述方法反复消化7～8次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后，200目的尼龙网筛过滤去除残留组织块，以1000 r/min速度离心8 min，将所得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次2 h，将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3 d加入0.1 mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。48 h首次换液，以后根据情况2～3 d换液。
乳鼠心肌细胞培养 物品准备 眼科剪、眼科镊、泡沫板、75%酒精、细胞培养皿、细胞培养瓶、胰蛋白酶、胶原酶II、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、离心机、温控水平摇床、二氧化碳培养箱、普通倒置显微镜、细胞计数板、胎牛血清、DMEM培养基、生理盐水、细胞过滤器、除菌过滤器、15ml离心管、50ml离心管 试液配制 （1）培养液A:按每90ml培养液加入10ml胎牛血清即为10%DMEM培养液（含双抗）。 （2）培养液B:含0.1mmol/LBrdU配制的DMEM高糖型培养液（含双抗）。 （3）消化液：0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ型分装冻存于-20C。将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。 操作步骤 （1）取1-3天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上; （2）应用75%酒精常规消毒; （3）从左侧肋下缘剪开胸腔,用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中; （4）全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中; （5）剪碎，用无血清培养液洗1-2遍后，转移入50ml离心管中; （6）加入10ml 消化液，放入37℃摇床 100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。（7）沉淀的心室组织中加入10ml消化液，37℃摇床 100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于 20ml 培养液中。 （8）重复 5-6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。用200μm 筛网过滤，1000rpm，4℃，离心 8min。 （9）用培养液A将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入 5%CO2 恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。 （10）将T25培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25培养瓶，放入细胞培养箱培养 1h，进行第二次差速贴壁。 （11）收集上清并计数后，离心 1000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。（12）用培养基B重悬细胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的细胞密度接种于六孔板中，放入细胞培养箱培养。同时，取200μl未接种的细胞悬液进行细胞存活率检测。 （13）细胞培养24h 后给予培养基B换液，前3天每天使用培养基B换液培养，以后使用培养基 A（即不加 BrdU）常规培养。心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。 注意事项 （1）心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占50%。决定心肌细胞培养成败的关键是:1)不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。2 )尽量减少非心肌细胞的存在。为了获得纯化的心肌细胞，可以采取差速贴壁及应用DNA抑制剂等办法。因心肌细胞需12-15h后才开始粘附并伸展，而其它非心肌细胞包括内皮细胞、平滑肌