pAAV-CAG-Fluc
pAAV-CAG-Fluc载体基本信息：
载体名称: pAAV-CAG-Fluc 、pAAV-CAG-luc
质粒类型: 腺病毒载体；荧光素酶报告载体；荧光蛋白报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝
克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点
启动子: CAG (CMV enhancer/chicken β-actin promoter)
载体大小: 8323 bp
5' 测序引物及序列: --
3' 测序引物及序列: --
载体标签: --
载体抗性: 氨苄青霉素
筛选标记: 萤火虫荧光素酶、橙色荧光蛋白
克隆菌株: Stbl3 或NEB Stble
宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系
备注: --
稳定性: 稳表达
组成型/诱导型: 组成型
病毒/非病毒: 腺病毒
pAAV-CAG-Fluc载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pAAV-CAG-Fluc载体简介：
This AAV is a fLuc construct driven by the ubiquitous CAG promoter.
The roughly 1.8Kb CAG promoter (also known as CBA promoter or CAGGS promoter) is a strong synthetic promoter frequently used to drive high levels of gene expression in mammalian cells. The CAG promoter is composed of the following regulatory elements: (C) cytomegalovirus (CMV) early enhancer element; (A) the promoter region, the first exon, and the first intron of chicken beta-Actin gene, and (G) the splice acceptor of the rabbit beta-Globin gene. Like the EF1a promoter, the CAG promoter is commonly used as an alternative for the CMV promoter, from which the expression is decreased due to methylation/silencing. In many cell types tested, the CAG and EF1a promoters give much higher levels of expression than other commonly used cellular promoters such as the UBC and PGK promoters. Firefly luciferase (fLuc) is an oxidative enzyme used in bioluminescence and is distinct from a photoprotein. In the luciferase reaction, light is emitted when luciferase acts on the appropriate luciferin substrate. Photon emission can be detected by a light-sensitive apparatus such as a luminometer or modified optical microscope. Firefly luciferase is commonly used as a reporter to assess the transcriptional activity in cells.
pAAV-CAG-Fluc载体序列：
ORIGIN
1 GGGGGGGGGG GGGGGGGGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC
61 GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA
121 GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC ACTAGGGGTT CCTAGATCTA GGATCACGCG
181 TTCTAGTCCT AGGGATGTAC CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC
241 AATAGGGACT TTCCATTGAC GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC
301 AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT GACGTCAATG ACGGTAAATG
361 GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC TTTCCTACTT GGCAGTACAT
421 CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT CGAGGTGAGC CCCACGTTCT GCTTCACTCT
481 CCCCATCTCC CCCCCCTCCC CACCCCCAAT TTTGTATTTA TTTATTTTTT AATTATTTTG
541 TGCAGCGATG GGGGCGGGGG GGGGGGGGGG GCGCGCGCCA GGCGGGGCGG GGCGGGGCGA
601 GGGGCGGGGC GGGGCGAGGC GGAGAGGTGC GGCGGCAGCC AATCAGAGCG GCGCGCTCCG
661 AAAGTTTCCT TTTATGGCGA GGCGGCGGCG GCGGCGGCCC TATAAAAAGC GAAGCGCGCG
721 GCGGGCGGGA GTCGCTGCGC GCTGCCTTCG CCCCGTGCCC CGCTCCGCCG CCGCCTCGCG
781 CCGCCCGCCC CGGCTCTGAC TGACCGCGTT ACTCCCACAG GTGAGCGGGC GGGACGGCCC
841 TTCTCCTCCG GGCTGTAATT AGCGCTTGGT TTAATGACGG CTTGTTTCTT TTCTGTGGCT
901 GCGTGAAAGC CTTGAGGGGC TCCGGGAGGG CCCTTTGTGC GGGGGGAGCG GCTCGGGGCT
961 GTCCGCGGGG GGACGGCTGC CTTCGGGGGG GACGGGGCAG GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC
1021 GTGTGACCGG CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC
1081 AGCTCCTGGG CAACGTGCTG GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTGGATC
1141 TAGTCGATTC GAATTCATGG AAGACGCCAA AAACATAAAG AAAGGCCCGG CGCCATTCTA
1201 TCCGCTAGAG GATGGAACCG CTGGAGAGCA ACTGCATAAG GCTATGAAGA GATACGCCCT
1261 GGTTCCTGGA ACAATTGCTT TTACAGATGC ACATATCGAG GTGAACATCA CGTACGCGGA
1321 ATACTTCGAA ATGTCCGTTC GGTTGGCAGA AGCTATGAAA CGATATGGGC TGAATACAAA
1381 TCACAGAATC GTCGTATGCA GTGAAAACTC TCTTCAATTC TTTATGCCGG TGTTGGGCGC 1441 GTTATTTATC GGAGTTGCAG TTGCGCCCGC GAACGACATT TATAATGAAC GTGAATTGCT 1501 CAACAGTATG AACATTTCGC AGCCTACCGT AGTGTTTGTT TCCAAAAAGG GGTTGCAAAA 1561 AATTTTGAAC GTGCAAAAAA AATTACCAAT AATCCAGAAA ATTATTATCA TGGATTCTAA 1621 AACGGATTAC CAGGGATTTC AGTCGATGTA CACGTTCGTC ACATCTCATC TACCTCCCGG 1681 TTTTAATGAA TACGATTTTG TACCAGAGTC CTTTGATCGT GACAAAACAA TTGCACTGAT 1741 AATGAACTCC TCTGGATCTA CTGGGTTACC TAAGGGTGTG GCCCTTCCGC ATAGAACTGC 1801 CTGCGTCAGA TTCTCGCATG CCAGAGATCC TATTTTTGGC AATCAAATCA TTCCGGATAC 1861 TGCGATTTTA AGTGTTGTTC CATTCCATCA CGGTTTTGGA ATGTTTACTA CACTCGGATA 1921 TTTGATATGT GGATTTCGAG TCGTCTTAAT GTATAGATTT GAAGAAGAGC TGTTTTTACG 1981 ATCCCTTCAG GATTACAAAA TTCAAAGTGC GTTGCTAGTA CCAACCCTAT TTTCATTCTT 2041 CGCCAAAAGC ACTCTGATTG ACAAATACGA TTTATCTAAT TTACACGAAA TTGCTTCTGG 2101 GGGCGCACCT CTTTCGAAAG AAGTCGGGGA AGCGGTTGCA AAACGCTTCC ATCTTCCAGG 2161 GATACGACAA GGATATGGGC TCACTGAGAC TACATCAGCT ATTCTGATTA CACCCGAGGG 2221 GGATGATAAA CCGGGCGCGG TCGGTAAAGT TGTTCCATTT TTTGAAGCGA AGGTTGTGGA 2281 TCTGGATACC GGGAAAACGC TGGGCGTTAA TCAGAGAGGC GAATTATGTG TCAGAGGACC 2341 TATGATTATG TCCGGTTATG TAAACAATCC GGAAGCGACC AACGCCTTGA TTGACAAGGA 2401 TGGATGGCTA CATTCTGGAG ACATAGCTTA CTGGGACGAA GACGAACACT TCTTCATAGT 2461 TGACCGCTTG AAGTCTTTAA TTAAATACAA AGGATACCAG GTGGCCCCCG CTGAATTGGA 2521 GTCGATATTG TTACAACACC CCAACATCTT CGACGCGGGC GTGGCAGGTC TTCCCGACGA 2581 TGACGCCGGT GAACTTCCCG CCGCCGTTGT TGTTTTGGAG CACGGAAAGA CGATGACGGA 2641 AAAAGAGATC GTGGATTACG TCGCCAGTCA AGTAACAACC GCGAAAAAGT TGCGCGGAGG 2701 AGTTGTGTTT GTGGACGAAG TACCGAAAGG TCTTACCGGA AAACTCGACG CAAGAAAAAT 2761 CAGAGAGATC CTCATAAAGG CCAAGAAGGG CGGAAAGTCC AAATTGCTCG AGGGCAGAGG 2821 AAGTCTTCTA ACATGCGGTG ACGTGGAGGA GAATCCCGGC CCTGCACCGG GATCCATGTC 2881 CAGATTAGAT AAAAGTAAAG TGATTAACAG CGCATTAGAG CTGCTTAATG AGGTCGGAAT 2941 CGAAGGTTTA ACAACCCGTA AACTCGCCCA GAAGCTAGGT GTAGAGCAGC CTACATTGTA 3001 TTGGCACGTG CGCAACAAGC AGACTCTTAT GAACATGCTT TCAGAGGCAA TACTGGCGAA 3061 GCATCACACC CGTTCAGCAC CGTTACCGAC TGAGAGTTGG CAGCAGTTTC TCCAGGAAAA 3121 TGCTCTGAGT TTCCGTAAAG CATTACTGGT CCATCGTGAT GGAGCCCGAT TGCATATAGG 3181 GACCTCTCCT ACGCCCCCCC AGTTTGAACA AGCAGAGGCG CAACTACGCT GTCTATGCGA 3241 TGCAGGGTTT TCGGTCGAGG AGGCTCTTTT CATTCTGCAA TCTATCAGCC ATTTTACGTT 3301 GGGTGCAGTA TTAGAGGAGC AAGCAACAAA CCAGATAGAA AATAATCATG TGATAGACGC 3361 TGCACCACCA TTATTACAAG AGGCATTTAA TATTCAGGCG AGAACCTCTG CTGAAATGGC 3421 CTTCCATTTC GGGCTGAAAT CATTAATATT TGGATTTTCT GCACAGTTAG ATGAAAAAAA 3481 GCATACACCC ATTGAGGATG GTAATAAACC AAAAAAGAAG AGAAAGCTAG CAGTGTCAGT 3541 GACATTTGAA GATGTGGCTG TGCTCTTTAC TCGGGACGAG TGGAAGAAGC TGGATCTGTC 3601 TCAGAGAAGC CTGTACCGTG AGGTGATGCT GGAGAATTAC AGCAACCTGG CCTCCATGGC 3661 AGGATTCCTG TTTACCAAAC CAAAGGTGAT CTCCCTGTTG CAGCAAGGAG AGGACCCGTA 3721 TCTCGAGGGC AGAGGAAGTC TTCTAACATG CGGTGACGTG GAGGAGAATC CCGGCCCTGC 3781 ACCGGGATCC ATGGTGAGTG TGATTAAACC AGAAATGAAG ATGAGGTACT ACATGGACGG 3841 CTCCGTCAAT GGGCATGAGT TCACAATTGA AGGTGAAGGC ACAGGCAGAC CTTACGAGGG 3901 ACATCAAGAG ATGACACTAC GCGTCACAAT GGCCAAGGGC GGGCCAATGC CTTTCGCGTT 3961 TGACTTAGTG TCACACGTGT TCTGTTACGG CCACAGACCT TTTACTAAAT ATCCAGAAGA
4021 GATACCAGAC TATTTCAAAC AAGCATTTCC TGAAGGCCTG TCATGGGAAA GGTCGTTGGA 4081 GTTCGAAGAT GGTGGGTCCG CTTCAGTCAG TGCGCATATA AGCCTTAGAG GAAACACCTT 4141 CTACCACAAA TCCAAATTTA CTGGGGTTAA CTTTCCTGCC GATGGTCCTA TCATGCAAAA 4201 CCAAAGTGTT GATTGGGAGC CATCAACCGA GAAAATTACT GCCAGCGACG GAGTTCTGAA 4261 GGGTGATGTT ACGATGTACC TAAAACTTGA AGGAGGCGGC AATCACAAAT GCCAATTCAA 4321 GACTACTTAC AAGGCGGCAA AAAAGATTCT TAAAATGCCA GGAAGCCATT ACATCAGCCA 4381 TCGCCTCGTC AGGAAAACCG AAGGCAACAT TACTGAGCTG GTAGAAGATG CAGTAGCTCA 4441 TTCCTGATGT ACAAGTAAAG CGGCCGCAAG CTTATCGATA ATCAACCTCT GGATTACAAA 4501 ATTTGTGAAA GATTGACTGG TATTCTTAAC TATGTTGCTC CTTTTACGCT ATGTGGATAC 4561 GCTGCTTTAA TGCCTTTGTA TCATGCTATT GCTTCCCGTA TGGCTTTCAT TTTCTCCTCC 4621 TTGTATAAAT CCTGGTTGCT GTCTCTTTAT GAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CAGGCAACGT 4681 GGCGTGGTGT GCACTGTGTT TGCTGACGCA ACCCCCACTG GTTGGGGCAT TGCCACCACC 4741 TGTCAGCTCC TTTCCGGGAC TTTCGCTTTC CCCCTCCCTA TTGCCACGGC GGAACTCATC 4801 GCCGCCTGCC TTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTCGGCTGT TGGGCACTGA CAATTCCGTG 4861 GTGTTGTCGG GGAAGCTGAC GTCCTTTCCA TGGCTGCTCG CCTGTGTTGC CACCTGGATT 4921 CTGCGCGGGA CGTCCTTCTG CTACGTCCCT TCGGCCCTCA ATCCAGCGGA CCTTCCTTCC 4981 CGCGGCCTGC TGCCGGCTCT GCGGCCTCTT CCGCGTCTTC GCCTTCGCCC TCAGACGAGT 5041 CGGATCTCCC TTTGGGCCGC CTCCCCGCCT GATCGATACC GTCGACTAGA GCTCGCTGAT 5101 CAGCCTCGAC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT 5161 CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA ATAAAATGAG GAAATTGCAT 5221 CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG GGTGGGGCAG GACAGCAAGG 5281 GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGAGAG ATCTGAGGAA CCCCTAGTGA 5341 TGGAGTTGGC CACTCCCTCT CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC 5401 CCGGGCGTCG GGCGACCTTT GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG 5461 GAGTGGCCAA CCCCCCCCCC CCCCCCCCTG CAGCCTGGCG TAATAGCGAA GAGGCCCGCA 5521 CCGATCGCCC TTCCCAACAG TTGCGTAGCC TGAATGGCGA ATGGCGCGAC GCGCCCTGTA 5581 GCGGCGCATT AAGCGCGGCG GGTGTGGTGG TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA 5641 GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACG TTCGCCGGCT 5701 TTCCCCGTCA AGCTCTAAAT CGGGGGCTCC CTTTAGGGTT CCGATTTAGT GCTTTACGGC 5761 ACCTCGACCC CAAAAAACTT GATTAGGGTG ATGGTTCACG TAGTGGGCCA TCGCCCTGAT 5821 AGACGGTTTT TCGCCCTTTG ACGTTGGAGT CCACGTTCTT TAATAGTGGA CTCTTGTTCC 5881 AAACTGGAAC AACACTCAAC CCTATCTCGG TCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTGC 5941 CGATTTCGGC CTATTGGTTA AAAAATGAGC TGATTTAACA AAAATTTAAC GCGAATTTTA 6001 ACAAAATATT AACGTTTACA ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG 6061 TATTTCACAC CGCATATGGT GCACTCTCAG TACAATCTGC TCTGATGCCG CATAGTTAAG 6121 CCAGCCCCGA CACCCGCCAA CACCCGCTGA CGCGCCCTGA CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC 6181 ATCCGCTTAC AGACAAGCTG TGACCGTCTC CGGGAGCTGC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC 6241 GTCATCACCG AAACGCGCGA GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT TATAGGTTAA 6301 TGTCATGATA ATAATGGTTT CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG 6361 AACCCCTATT TGTTTATTTT TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA 6421 ACCCTGATAA ATGCTTCAAT AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG 6481 TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC 6541 GCTGGTGAAA GTAAAAGATG CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT 6601 GGATCTCAAC AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT
6661 GAGCACTTTT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA 6721 GCAACTCGGT CGCCGCATAC ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC 6781 AGAAAAGCAT CTTACGGATG GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT 6841 GAGTGATAAC ACTGCGGCCA ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC 6901 CGCTTTTTTG CACAACATGG GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT 6961 GAATGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA TGGCAACAAC 7021 GTTGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA
7081 CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG 7141 GTTTATTGCT GATAAATCTG GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT 7201 GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC 7261 TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA 7321 ACTGTCAGAC CAAGTTTACT CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ATTTTTAATT
7381 TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA
7441 GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC 7501 TTTTTTTCTG CGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT 7561 TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC 7621 GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC
7681 TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG
7741 CGATAAGTCG TGTCTTACCG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG 7801 GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA 7861 ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC 7921 GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG 7981 GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG 8041 ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT 8101 TTTACGGTTC CTGGCCTTTT GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC
8161 TGATTCTGTG GATAACCGTA TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG 8221 AACGACCGAG CGCAGCGAGT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC 8281 GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGGCTG CAG
//
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.doczj.com/doc/e710761484.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.doczj.com/doc/e710761484.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息： 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体；四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin ） 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等） 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-TetOne-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT
pAAV--‐CAG--‐GFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV--‐CAG--‐GFP pAAV--‐CAG--‐GFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CAG--‐GFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β--‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p 5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: EGFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CAG--‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CAG--‐GFP载体序列: ORIGIN 1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT 61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT 241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA 361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT 421 C CAAGCTGGG C TGTGTGCAC G AACCCCCCG T TCAGCCCGA C CGCTGCGCC T TATCCGGTA 481 A CTATCGTCT T GAGTCCAAC C CGGTAAGAC A CGACTTATC G CCACTGGCA G CAGCCACTG 541 G TAACAGGAT T AGCAGAGCG A GGTATGTAG G CGGTGCTAC A GAGTTCTTG A AGTGGTGGC 601 C TAACTACGG C TACACTAGA A GAACAGTAT T TGGTATCTG C GCTCTGCTG A AGCCAGTTA 661 C CTTCGGAAA A AGAGTTGGT A GCTCTTGAT C CGGCAAACA A ACCACCGCT G GTAGCGGTG 721 G TTTTTTTGT T TGCAAGCAG C AGATTACGC G CAGAAAAAA A GGATCTCAA G AAGATCCTT 781 T GATCTTTTC T ACGGGGTCT G ACGCTCAGT G GAACGAAAA C TCACGTTAA G GGATTTTGG 841 T CATGAGATT A TCAAAAAGG A TCTTCACCT A GATCCTTTT A AATTAAAAA T GAAGTTTTA 901 A ATCAATCTA A AGTATATAT G AGTAAACTT G GTCTGACAG T TACCAATGC T TAATCAGTG 961 A GGCACCTAT C TCAGCGATC T GTCTATTTC G TTCATCCAT A GTTGCCTGA C TCCCCGTCG 1021 T GTAGATAAC T ACGATACGG G AGGGCTTAC C ATCTGGCCC C AGTGCTGCA A TGATACCGC 1081 G AGACCCACG C TCACCGGCT C CAGATTTAT C AGCAATAAA C CAGCCAGCC G GAAGGGCCG 1141 A GCGCAGAAG T GGTCCTGCA A CTTTATCCG C CTCCATCCA G TCTATTAAT T GTTGCCGGG 1201 A AGCTAGAGT A AGTAGTTCG C CAGTTAATA G TTTGCGCAA C GTTGTTGCC A TTGCTACAG 1261 G CATCGTGGT G TCACGCTCG T CGTTTGGTA T GGCTTCATT C AGCTCCGGT T CCCAACGAT 1321 C AAGGCGAGT T ACATGATCC C CCATGTTGT G CAAAAAAGC G GTTAGCTCC T TCGGTCCTC 1381 C GATCGTTGT C AGAAGTAAG T TGGCCGCAG T GTTATCACT C ATGGTTATG G CAGCACTGC 1441 A TAATTCTCT T ACTGTCATG C CATCCGTAA G ATGCTTTTC T GTGACTGGT G AGTACTCAA 1501 C CAAGTCATT C TGAGAATAG T GTATGCGGC G ACCGAGTTG C TCTTGCCCG G CGTCAATAC 1561 G GGATAATAC C GCGCCACAT A GCAGAACTT T AAAAGTGCT C ATCATTGGA A AACGTTCTT 1621 C GGGGCGAAA A CTCTCAAGG A TCTTACCGC T GTTGAGATC C AGTTCGATG T AACCCACTC 1681 G TGCACCCAA C TGATCTTCA G CATCTTTTA C TTTCACCAG C GTTTCTGGG T GAGCAAAAA 1741 C AGGAAGGCA A AATGCCGCA A AAAAGGGAA T AAGGGCGAC A CGGAAATGT T GAATACTCA 1801 T ACTCTTCCT T TTTCAATAT T ATTGAAGCA T TTATCAGGG T TATTGTCTC A TGAGCGGAT 1861 A CATATTTGA A TGTATTTAG A AAAATAAAC A AATAGGGGT T CCGCGCACA T TTCCCCGAA 1921 A AGTGCCACC T AAATTGTAA G CGTTAATAT T TTGTTAAAA T TCGCGTTAA A TTTTTGTTA 1981 A ATCAGCTCA T TTTTTAACC A ATAGGCCGA A ATCGGCAAA A TCCCTTATA A ATCAAAAGA 2041 A TAGACCGAG A TAGGGTTGA G TGTTGTTCC A GTTTGGAAC A AGAGTCCAC T ATTAAAGAA 2101 C GTGGACTCC A ACGTCAAAG G GCGAAAAAC C GTCTATCAG G GCGATGGCC C ACTACGTGA 2161 A CCATCACCC T AATCAAGTT T TTTGGGGTC G AGGTGCCGT A AAGCACTAA A TCGGAACCC 2221 T AAAGGGAGC C CCCGATTTA G AGCTTGACG G GGAAAGCCG G CGAACGTGG C GAGAAAGGA 2281 A GGGAAGAAA G CGAAAGGAG C GGGCGCTAG G GCGCTGGCA A GTGTAGCGG T CACGCTGCG 2341 C GTAACCACC A CACCCGCCG C GCTTAATGC G CCGCTACAG G GCGCGTCCC A TTCGCCATT 2401 C AGGCTGCGC A ACTGTTGGG A AGGGCGATC G GTGCGGGCC T CTTCGCTAT T ACGCCAGCT 2461 G CGCGCTCGC T CGCTCACTG A GGCCGCCCG G GCAAAGCCC G GGCGTCGGG C GACCTTTGG