木瓜蛋白酶水解海洋鱼鳞蛋白的工艺研究
杨丽虹1，吴琴琴1，唐旭2，徐长安2，何建林2
（1.厦门大学海洋系，福建厦门 361005）（2.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门 361005） 摘要：研究了木瓜蛋白酶水解鱼鳞蛋白的单一影响因素，并采用L9(34)正交实验，考察了温度、时间、酶量、底物浓度等因素对水解鱼鳞蛋白的影响。确定了木瓜蛋白酶水解鱼鳞蛋白工艺条件，即温度65 ℃，时间75 min，酶量0.04 g/g鱼鳞，底物浓度10%，适合规模化生产。
关键词：木瓜蛋白酶；海鱼鳞蛋白；水解
文章篇号：1673-9078(2011)12-1484-1486
Hydrolysis Process of Sea-fish Scale Protein Catalyzed by Papain
YANG Li-hong1, WU Qin-qin1, TANG Xu2, XU Chang-an2, HE Jian-lin2
(1.Department of Oceanography, Xiamen University, Xiamen 361005, China)
(2.Third Institute of Oceanography, SOA, Xiamen 361005, China)
Abstract: Hydrolysis of the protein from sea-fish scales by papain was studied using orthogonal experiment method. Effects of several factors on hydrolysis were investigated. Based on the research work, the optimum treatment condition was summarized as follows: temperature 65 ℃, hydrolysis time 75 minutes, enzyme 0.04 g/g scale and substrate concentration 10%. The result indicated that the conditions were suitable for large-scale production.
Key words: papain; sea-fish scales protein; hydrolysis
改革开放以来，海洋水产品加工方面取得了长足的进步。也产生了占30%的废弃物，其中有10%的左右鱼鳞资源未得到很好利用[1]。鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白，是动物体内含量最丰富的蛋白质[2]。具有促进伤口癒合和组织修复的重要功能[3]。同时水解鱼鳞蛋白的主要产物胶原肽，也具有保护胃粘膜、抗溃疡、抑制血压上升，促进骨形成、皮肤胶原代谢等营养及生理功能，在食品及医药等领域具有巨大的开发前景[4]。由于目前，陆生动物资源的生物危险性不断增大，因此，水生动物资源特别是丰富的海洋生物资源越来越受到关注。利用生物酶方法水解鱼鳞比酸碱法条件要温和，效率更高，而且对环境污染小。其酶解产物中含有丰富的小分子肽，更容易被生物体吸收利用，可以有效地缓解细胞衰老，并且有抗菌、抗肿瘤等功效。本文主要探索木瓜蛋白酶酶解海洋鱼鳞蛋白的工艺条件，为进一步开发利用海洋鱼类资源，制造功能性食品发掘新的途径。
1 材料和方法
1.1 实验材料
收稿日期：2011-08-25
基金项目：国家海洋局第三海洋研究所科研基本业务费（海三科2009006） 作者简介：杨丽虹（1989-），女，本科生，海洋化学专业
美国红鱼鱼鳞：购自福建东山，经洗涤、脱脂和脱钙处理后干燥备用；木瓜蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司，酶活力80万U/g。
电子天平：METTLER TOLEDO AL104型；烘箱：上海恒一科学仪器公司，DHG-9240A型；酶标仪：美国分子仪器公司，SpectraMax M5型；pH计：Sartorius PB-10型。
化学试剂购：自汕头西陇化工有限公司。其中碳酸氢钠为食品级其他均为分析纯。
1.2 实验工艺流程
脱脂脱钙鱼鳞→前处理→酶解→灭酶→离心过滤→酶解液
1.3 分析方法[5]
氨基酸态氮：甲醛滴定法；粗蛋白：微量凯氏定氮法；氨基酸显色反应：茚三酮显色法；水解度[6,7]：以水解液中的肽键数目与原料中总肽键数目的百分数表示，
即：%
100
DH×
=
原料总氮
水解液氨态氮
1.4 酶解前处理
脱脂、脱钙[8]干鱼鳞称重，在稀碳酸氢钠溶液中浸泡过夜，然后用清水洗至中性。80 ℃加热5 h预处理。
1484
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1.5 pH 对酶解效果的影响
5 g 干鱼鳞经预处理后，分别加入不同pH 的缓冲液150 mL ，缓冲液的pH 值分别为5.5、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00。分别加入0.20 g 木瓜蛋白酶，于40 ℃酶解1.5 h 。反应结束，待溶液冷却后，离心，取上清液测定酸溶性多肽得率。 1.
6 温度对酶解效果的影响
取5 g 干鱼鳞经预处理后，加50 mL 蒸馏水和0.2 g 木瓜蛋白酶，调pH 值为6.0，分别于40、50、55、60、70 ℃下进行酶解，离心，测定鱼鳞水解后的多肽得率。
1.7 酶解时间对酶解效果的影响
取5 g 干鱼鳞经预处理后，加50 mL 蒸馏水和0.2 g 木瓜蛋白酶，调pH 值为6.0，于60 ℃下进行酶解，酶解时间分别为75、90、120、142 min ，然后离心，测定鱼鳞水解后的多肽得率。 1.8 酶用量对酶解效果的影响
取5份5 g 干鱼鳞经预处理后，加50 mL 蒸馏水，调pH 值为6.0，于60 ℃进行酶解，酶解时间为90 min ，酶量分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g ，离心，测定水解后的多肽得率。 2 结果与讨论
2.1 pH 对鱼鳞酶解的影响
pH 对酶解效果的影响见图
1
图1 pH 对鱼鳞酶解的影响
Fig.1 Effect of pH on fish scale hydrolysis
由图1可以看出，用木瓜蛋白酶酶解鱼鳞蛋白最适pH 在6~6.5。随着pH 值升高，酶解活力也随之下降。但是由于使用pH 缓冲溶液，容易导致不必要的杂质引入，因此最终决定使用pH 6.0的稀盐酸溶液作为酶解溶剂。
2.2 温度对酶解效果的影响
温度对鱼鳞酶解效果的影响见图2。
由图2的结果可以看出，温度对木瓜蛋白酶水解
鱼鳞的影响随着温度的上升也在增大，当温度在60 ℃时，多肽浓度也随之达到最高。之后当温度上升，多肽浓度反而呈下降趋势，此时酶的活性受到抑制。
图2 温度对酶解效果的影响
Fig.2 Effect of temperature on fish scale hydrolysis
2.3 酶解时间对酶解效果的影响
考察了75、90、120、142 min 不等的酶解时间，其对酶解效果的影响结果见图3。
图3 酶解时间对酶解效果的影响 Fig.3 Effect of time on fish scale hydrolysis
从图3可以得知，随着酶解时间的增加，最初多肽得率会有所增加，酶解90 min 时，多肽浓度达到最高，之后随时间增加而降低。在90 min 前，鱼鳞中的大分子不断被分解成多肽，因此随时间增加，多肽浓度变大。当达到90 min 时，浓度达到最大值，此后，随酶解时间的增加，多肽浓度下降，这可能是由于副反应增多所致。
2.4 酶用量对酶解效果的影响
在进行了多次酶量实验之后，发现由于鱼鳞本身用量较低，个体差异显现较为明显，导致酶量与多肽浓度的关系曲线趋势不明显。因此改用鱼鳞酶解完成时间来判断最佳酶用量，结果见图4。
由图4可以看出，酶用量为0.08 g/g 鱼鳞时酶解速度非常快，但此时该用量很大，成本较高。而0.04 g/g 鱼鳞和0.06 g/g 鱼鳞的酶解速度相当，从经济角度、反应时间综合考虑，最终选择酶用量为0.04 g/g 。
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图4 酶用量对酶解效果的影响
Fig.4 Effect of enzyme amount to fish scale hydrolysis
2.5 正交实验结果
表1 鱼鳞蛋白水解条件因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment L 9(34) 水平
A 温度/℃
B 时间/min
C 酶量/ (g/g 鱼鳞)
D 底物 浓度/%
1 55 75 0.03 10
2 60 90 0.04 15
3 65 105 0.05 20
表2 L 9(34)正交实验设计与水解度结果 Table 2 Results of orthogonal experiment L 9(34) 实验号
A B C D
多肽浓度
/(mg/mL)
1 1 1 1 1 4.19
2 1 2 2 2 4.20
3 1 3 3 3 4.15
4 2 1 2 3 4.16
5 2 2 3 1 4.20
6 2 3 1 2 4.19
7 3 1 3 2 4.21 8 3 2 1 3 4.15
9 3 3 2 1 4.20 k1 4.181 4.184 4.178 4.194 k2 4.182 4.184 4.187 4.201 k3 4.186 4.181 4.184 4.154
R 0.005 0.003 0.009 0.047
在酶解鱼鳞蛋白工艺中，有诸多影响相互制约、相互依赖。经过初步实验，选定温度、时间、酶量以及底物浓度为主要影响因素，pH 设定为6.0。通过L 9(34)正交实验，确定鱼鳞蛋白水解最佳工艺条件。具体影响因素和实验水平见表1。
从表2实验结果可知，对酶解效果影响程度大小顺序为：D ＞C ＞A ＞B ，即：底物浓度＞酶量＞温度＞时间。经综合考虑，最终确定了木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为A 3B 1C 2D 1，即：酶解温度65 ℃；酶解时间75 min ；酶解时pH 6.0；底物浓度10%；酶量0.04 g/g 鱼鳞。在上述确定的实验条件下，做两份平行实验，最终得到在此条件下的多肽含量可以达到4.35。 4 结论
鱼鳞蛋白经过加热预处理后，可被木瓜蛋白酶较好地水解。经实验优化选出较好的水解条件为：酶解温度65 ℃；酶解时间75 min ；酶解时pH 6.0；底物浓度10%；酶量0.04 g/g 鱼鳞，此时的水解度可以达到4.35。与文献报道[7]的结果相比，酶解时间缩短、水解度增加，可适用于规模化生产。 参考文献
[1] 刘庆慧,王采理,张培新,等.鱼鳞酶解工艺的研究[J].海洋水
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工艺条件优化[J].食品工业科技,2010,242(6):326-328
发酵工程与设备课程论文 题目木瓜蛋白酶 班别学号 姓名 成绩
木瓜蛋白酶 摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries 关键字：木瓜蛋白酶化学修饰酶活力固定化行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。 作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 一、木瓜蛋白酶的制备及保存 木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即
碱性蛋白酶提取花生水解蛋白 摘要： 利用碱性蛋白酶从冷榨花生饼中提取花生水解蛋白。研究了温度、pH 值、加酶量、液固比、水解时间对蛋白质提取率的影响,确定最佳工艺参数为温度55 ℃、pH9.0、加酶量是0.8%、水解时间3 h、液固比7∶1, 在此条件下蛋白质提取率为81.32%。 1、材料与方法 （1）实验材料 冷榨花生饼(蛋白质48.09%, 脂肪8.74%, 粗纤维 4.71%); 碱性蛋白酶(2.4 AU/g)； 主要仪器设备： SC- A型精密恒温水槽, 868 型酸度计, 78- 1 型磁力搅拌器, UV- 2100 紫外可见光分光光度计, 酶反应器。 （2）实验方法 花生水解蛋白的提取：一定质量花生饼(粉碎过80 目筛)与蒸馏水按一定比例加入酶反应器中, 恒温搅拌一定时间, 调节pH 值至适宜, 加入一定量酶进行水解, 并维持反应液pH恒定(变化范围±0.01)。反应结束后, 沸水浴中灭酶5 min, 3000 r/min 离心20min, 收集上清液, 残渣用2 倍体积水洗涤, 合并两次离心所得上清液, 计量体积, Folin- 酚法，测定其中蛋白含量。
蛋白质提取率的计算： 花生蛋白提取率(%)=(提取的上清液蛋白质质量/原料中蛋白质质量)×100% 2、结果与分析 （1）温度对蛋白质提取率的影响在加酶量0.4%,pH8.0, 液固比7∶1, 水解时间 3 h 时, 考察了温度对蛋白提取率的影响, 结果如图 1 所示。 由图1 可知, 随着温度升高, 蛋白质提取率逐渐提高, 当温度达到55 ℃, 蛋白质提取率最高。当温度>55 ℃时, 随温度升高蛋白质提取率反而降低, 其原因可能是超过酶最适温度, 酶分子空间结构发生改变, 导致酶活性减弱或丧失。（2）pH 值对蛋白质提取率的影响在温度55 ℃,加酶量0.4%, 液固比7∶1, 时间3 h 时, 考察了pH值对蛋白提
鱼浆蛋白的开发利用 随着海洋环境的不断恶化和无序的捕捞，使海洋渔业资源急剧衰退，致使世界鱼粉产量急剧下降。而鱼粉加工废水通常为原料鱼重的60%～70%，其中固形物占6%～7%，故开发鱼浆蛋白对于资源的回收利用具有可观的经济效益和社会效益，同时也是一项利国利民的产业化项目，对促进我国饲料工业持续健康发展有重要意义。 １鱼浆蛋白的加工工艺 国外对蛋白质水解的研究始于100多年前，自1886年起就开始把蛋白质水解物应用于食品业。过去采用酸水解，工艺简单、成本低，但因氨基酸受损严重，水解难控制而且还存在安全问题，故而转向酶水解的方向上。酶法水解生产高效且对蛋白质营养价值破坏小，无异味，产品安全性极高，生产条件温和，成本低，已成为最主要的生产方法。纯品鱼浆蛋白是由新鲜鱼类在制作鱼粉的过程中压榨出的鱼溶浆液，经浓缩、酶解、喷雾干燥而成。鱼浆蛋白（腥肽）生产工艺见图1。 ２鱼浆蛋白营养成分 经生产工艺加工而成的鱼浆蛋白特点是富含活性低分子肽（寡肽）、牛磺酸、核苷酸、游离氨基酸、高不饱和脂肪酸、甜菜碱、矿物元素、维生素A、维生素B12、未知生长因子等。各营养组分如表1、表2、表3所示。
鱼浆蛋白是酸碱水解产物，蛋白水解产生大量的寡肽，其浸出物本身含有大量的寡肽。肽（peptides）是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,是蛋白质的结构与功能片段,并使蛋白质具有数以千万计的生理功能。氨基酸是其基本构成单位,由2 个或3 个氨基酸脱水缩合而成的肽分别叫二肽和三肽,以此类推为四肽、五肽。一般说来,肽链上氨基酸数目在10个以内的叫寡肽,10～50 个的叫多肽,50个以上的叫蛋白质。 3 鱼浆蛋白的生理优势 鱼浆蛋白主要是水溶性蛋白，含有大量的寡肽、牛磺酸、核苷酸、游离氨基酸等，还存在大量的促生长因子，使其生理功能方面具有明显的优势。 按照传统的消化理论，蛋白质食物被动物摄入，在消化道通过消化酶作用后，降解为游离氨基酸的形式在小肠吸收，而人们研究发现，在小肠存在一个低聚肽（寡肽）吸收通道，蛋白质经消化降解后，并不一定为完全游离氨基酸才能吸收，而是主要以寡肽的形式吸收，实验证实寡肽比氨基酸更容易、更快地被机体吸收利用。与游离氨基酸吸收相比，寡肽吸收具有速度快、耗能低、载体不易饱和且可避免与氨基酸吸收之间的竞争（如精氨酸和赖氨酸在吸收时相互竞争载体上的结合位点而发生颉颃）。施用晖等（1996）研究发现，完全以寡肽的形式供给动物时，赖氨酸的吸收速度不再受精氨酸的影响。Rerat等(1998)研究报道,向猪十二指肠灌注寡肽后，血浆胰岛素的浓度高于灌注游离氨基酸组。在仔猪生产日粮中添加鱼浆蛋白可以提高粪中乳酸杆菌数量，降低大肠杆菌数量、日粮离子浓度和断乳仔猪的腹泻率。牛磺酸可加快幼龄动物的生长，具有保护视网膜、心血管系统和神经系统的作用，促进脂肪乳化，减少脂肪肝的发生。 核苷酸具有免疫保健作用，增加抗体产生，增强细胞免疫能力，维持肠道和肝脏正常功能，尤其对幼小动物的腹泻有一定预防和治疗效果。它可以促进肠道黏膜创伤的愈合，降低肠炎的发生，减少并清除体内自由基的攻击。 由于含有大量的游离氨基酸和低分子肽等呈味物质，因此鱼浆蛋白诱食性较好。其中游离谷氨酸是最有效的风味物质，其次是焦谷氨酸和丙氨酸。寡肽也被认为是风味的增效因子。可见，鱼浆蛋白对于有效利用蛋白质、节约蛋白质资源、提高动物生产性能将大有裨益，同时能够为人们提供无公害、营养全面、口感良好的安全畜禽产品。 ４鱼浆蛋白的应用效果
木瓜蛋白酶的研究进展2010-2011学年第2学期《食品添加剂》课程论文 得分
摘要 木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，具有较高的热稳定性。在食品工业中主要用于啤酒和其他酒类的澄清，肉类嫰化，饼干、糕点松化及蛋白质水解生产等，在医药工业中也有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域。由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。 关键字:木瓜蛋白酶固定化食品工业
1.木瓜蛋白酶的概述 木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶,番瓜酵素。木瓜酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23.406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。 2.木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 3.木瓜蛋白酶的作用机制 作用方式：木瓜蛋白酶是一种内切酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精以及低聚糖中的a-1,4糖苷键。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格。 木瓜蛋白酶（Papain）是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 4.木瓜蛋白酶在各个行业的应用 （1）医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 （2）食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有
木瓜蛋白酶最适PH值和温度 木瓜蛋白酶﹙Papain﹚是由种植的番木瓜未成熟果实中割取乳液经采用生物技术提取、微滤、超滤、冷冻干燥提练而得的纯天然、健康、安全、高效的生物酶制剂。本品是蛋白酶混合物，含木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶、木瓜肽酶。有很强的蛋白水解催化活性及凝乳、溶菌活性，还具备脂解能力及蛋白合成能力，主要是催化蛋白质水解，切割分解点很多，优先分解精氨酸，苯丙氨酸的肽鍵。木瓜蛋白酶是由212个氨基酸组成，分子量为21000，属于含疏基﹙—SH﹚肽链内切酶，由于木瓜蛋白酶具有酶活高，热稳定性好，可广泛应用于食品、医药、日化、饲料、皮革及纺织等行业。 一、酶解原理 在一定温度，PH值及底物浓度下，木瓜蛋白酶能够分解蛋白质生成蛋白胨，多肽及氨基酸等物质。 二、活力定义 紫外光分光度法：在测定条件（37±0.2℃；PH值7.0）每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长有吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u/g表示。 三．木瓜酶最适PH值 木瓜蛋白酶的最适pH值：每个酶都有最适pH，在此pH下催化反应的速率是它的最高值。木瓜蛋白酶可进行催化反应的pH作用范围是3.5~9，最适pH范围是5~7。 四、木瓜酶最适温度 木瓜蛋白酶的最适温度：木瓜蛋白酶最佳温度是50~60℃，最佳的温度必然受作用时间的影响，较短的作用时间必须有较高的最适温度，较长的作用时间必须有较低的最适作用温度，这是木瓜蛋白酶与其他酶类的共同特点。 木瓜蛋白酶的有效作用温度范围是20~80℃。这个温度范围既适合木瓜乳汁生产粗酶的温度，也适合木瓜蛋白酶在一定条件下的活性反应作用。超过80℃时，木瓜蛋白酶活性会下降，当温度升到90℃时木瓜蛋白酶会钝化。
1、海洋生态学：研究海洋生物有机体与其栖息地环境之间相互关系的科学。 2、分子生态学：以分子生物学方法研究分子进化，种群遗传，物种形成与进化生态学效应与规律的科学。 3、随着生态学的发展，关于生态学的定义有何新的内涵？ 现代生态学的发展已经不仅是生物科学中揭示生物与环境相互关系的一门分支学科，而已经成为指导人类对自然的行为准则的一门学科。 提出了“社会——经济——自然复合生态系统”的概念，高度概括为“人类生存的科学”。 研究生物生存条件、生物及其群体与环境相互作用的过程及其规律的科学；其目的是指导人与生物圈（即自然、资源与环境）的协调发展。 4、海洋生态学有哪些重要的研究成果？ (1)在海洋初级生产力方面发现初级生产力是由再生产力和和新生产力两部组成，初步估计新生生产力在 总初级生产力中所占比例，并且与海洋生物泵过程及海—气之间的CO2交换联系起来。 (2)在食物网结构研究中发现微型生物食物网结果及在海洋生态系统能流、物流中的作用。 (3)在生物地化循环方面对包括以碳为主的各种元素循环的源，汇集其与全球生态平衡的关系等方面都取 得重要研究成果。 (4)发现热液口，冷渗口生态系统，对海底生物也有新的认识。 1、为什么说海洋是地球上最大的生态单位？联系海洋主要分区说明海洋在纬度、深度和从近岸到大洋三大环境梯度特征。 1) 地球表面大部分为海水覆盖，海洋约占地球面积的71%，平均深度为3820m，最深处超过10000m。海洋的空间总体积达1370 ×106km3，比陆地和淡水中生命存在空间大300 倍。所以，海洋是地球上最大的生态系统单位。 2) 大洋区是海洋的主体，包括太平洋，大西洋，印度洋，和北冰洋。 海洋具有三大环境梯度，即从赤道到两极的纬度梯度，从海面到深海海底的深度梯度以及从沿岸到开阔大洋的水平梯度。 ①纬度梯度主要表现赤道向两极的太阳辐射强度逐渐减弱，季节差异逐渐增大，每日光照持续时间不同，从而直接影响光合作用的季节差异和不同维度海区的温跃层模式。 ②深度梯度主要由于光照只能照射到海水表层，其下方只有微弱的光或是无光世界。同时，温度也有明显的垂直变化，表层因太阳辐射而温度较高，地处温度较低且恒定。压力也随深度不断增加，有机食物在深层很少。 ③从沿海到开阔大洋的梯度主要涉及深度，营养物质含量和海水混合作用的变化，也包括其他环境因素的波动呈现从沿岸向外洋减弱的变化。 2、简述海洋浮游生物的共同特点及其在海洋生态系统中的作用。 共同特点：一般个体较小，缺乏发达的运动器官，运动能力弱或完全缺乏运动能力，只能随水移动，具有多种多样适应浮游生活的结构。 作用： (1)数量多，分布广，是海洋生产力的基础，也是海洋生态系统能量流动和物质循环的最主要环节。 (2)有的浮游生物可以作为判别水团，海流的指示种。 (3)有些化石种类的分布有助于勘探海底石油资源。
木瓜蛋白酶应用及研究进展 摘要本文主要介绍了木瓜蛋白酶的作用机理，在医药、食品、化工、科研等方面的应用，以及在木瓜蛋白酶的固定等方 面的最新研究进展。 关键字木瓜蛋白酶应用酶的固定化发展 一、简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，主要应用于啤酒及食品工业。 二、作用机理 木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展 赵电波，陈茜，张丽尧 (郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002) 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶的组成，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Progress of Extraction and Application of Technology of PapainZHAO Dianbo, CHEN Xi, ZHANG Liyao（College of Food and Biotechnology Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, HenanZhengzhou 450002, P. R. China）Abstract: The composition of papain was described, and its extraction methods, research of extractiontechnology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing itwas further described, and its applicationsinpharmaceutical, chemical industry and the future prospects offood processing have been prospected in this article.Key words: papain;extractiontechnology; food processing; application 中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1001-8123(2010)11-0019-05 木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）[1]，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。1木瓜蛋白酶的提取工艺 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等[2]用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，且产品的纯度较低。木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等[2] 用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀 单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。1.2目前较为常见的提取方法 目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法提取木瓜蛋白酶。 1.2.1超滤法提取木瓜蛋白酶
课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日
目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫
2.海洋生物学-发展简史： 1674年，荷兰A.van列文虎克最先发现海洋原生动物。1777年，丹麦O.F.米勒应用显微镜观察北海的浮游生物。19世纪前期，C.G.爱伦贝格在海洋中发现硅鞭藻类。英国C.R.达尔文对他在1831～1836年“贝格尔”号航海中采集的蔓足类和珊瑚类，进行了出色研究。德国J.米勒于1845年使用浮游生物网，采集和研究海洋浮游生物。英国E.福布斯在19世纪中期先后提出海洋生物垂直分布的分带现象，按深度将爱琴海分成8个带；发表《英国海产生物分布图》；出版《欧洲海的自然历史》。德国V.亨森于1887年提出浮游生物(Plankton)的概念，并对海洋浮游生物开展了定量研究。1891年，德国E.H.哈克尔提出游泳动物(Nekton)和底栖生物(Benthos)两个概念。上述3个生态类群的概念，至今仍广为应用。1908～1913年，丹麦C.G.J.彼得松的工作奠定了海洋底栖生物定
量研究的基础。1946年，美国C.E.佐贝尔的《海洋微生物学》奠定了海洋微生物，主要是海洋细菌的研究基础。瑞典S.埃克曼的《海洋动物地理学》（1935、1953）、美国J.W.赫奇佩斯等主编的《海洋生态学和古生态学论文集》(1957)和H.B.穆尔的《海洋生态学》(1958)等，都促进了海洋生物学的发展。 19世纪下叶 各国竞相派出海洋考察船、设立滨海生物研究机构，海洋生物的研究工作日益兴盛。其中，最有名的海洋考察是英国“挑战者”号调查船历时三年半(1872～1876)的环球调查，学者们采集了大量深层和中层生物，出版了50卷巨著，所记载的生物的新种达4400多个，使当时已知的海洋生物种数翻几番。最古老的海洋生物研究机构是意大利那不勒斯（那波利）海洋生物研究所，成立于1872年，1874年正式开放。1888年，英国海洋生物学会成立了普利茅斯海洋研究所。美国在大西洋岸的伍兹霍尔，于1888年建立海洋生物研究所；在太平洋岸的斯克里普斯海洋研究所的前身海洋生物实验所，于1891年创建，等等。它们至今仍是世界上最活跃的海洋生物研究中心，特别是伍兹霍尔海洋生物研究所的工作，对海洋生物学的发展起了重要的作用。 20世纪 60、70年代以来，由于电子计算机、信息论、控制论和微量化学元素测定等数理化新成就、新技术的应用，海洋生物学的研究发展到新的阶段。如英、日学者利用生物工程技术研制出控制海洋鱼苗性别的方法；美国发射海洋卫星调查海洋鱼群的数量和种类变化等。该阶段的特点是：①海洋生物学研究出现了大综合趋势，海洋生态系研究兴起。如对珊瑚礁生态系、上升流生态系的研究。②实验生物学研究大力开展，并与生产实践密切联系,进行水产增养殖研究,“海洋水产生产农牧化”已成为重要的发展方向。据统计，中国海藻养殖1983年年产150多万吨（鲜品）,日本约为50多万吨；中国对虾养殖产量1984年已达2万吨,大大超过了同年的捕捞产量。③向深海和远洋两个方向发展。研究深海和远洋生物的生命活动、代谢规律和演变及其资源，如对南大洋磷虾资源的调查和利用；美国等国学者在深海海底，发现独特的化能自养的细菌和动物等组成的海底热泉生物群落，它们组成了一个与陆地、淡水以及绝大部分海域迥然不同的物质循环和生态系统。④海洋生物药物研究兴起。自50年代后期在柳珊瑚中发现有价值的药用成分后，沿海各国纷纷从海洋生物中寻找药物，目前已知的海洋药用生物已有一千多种。 中国对海洋生物的科学研究始于20世纪20年代，以后曾活跃一阵。30年代初在厦门组织了全国性的“中华海产生物学会”，30年代中期海洋生物研究中心逐渐转移到青岛。30年代后期至40年代，中国海洋生物研究基本处于停顿状态。50年代及其以后，在中国科学院、教育部、国家水产局和海洋局系统以及一些省市，先后建立了海洋生物的研究机构，开展了全国性的海洋调查、渔场调查、海洋水产养殖和栽培，以及实验生物学和海洋生物学基础理论的研究，取得了许多较高水平的成果。 3.海洋生物学- 研究内容 海洋生物学研究的内容极为丰富，且随着海洋调查手段和开发技术的改进而不断地发展。可以说生物学的各个领域──分类、形态、区系分布、生态、生理、生化、遗传等，在海洋生物学中均有相应的发展。但研究程度相差甚远，目前海洋生态的研究较为成熟，已形成海洋生态学。
木瓜蛋白酶在食品工业中应用的研究进展 江甜 （武汉轻工大学，湖北武汉430023） 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Applications of papain in the food industry JIANG Tian （Wuhan Polytechnic University，Wuhan, 430023） Abstract: The papain was described, and its extraction methods, research of extraction technology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing it was further described, and its applications in pharmaceutical, chemical industry and the future prospects of food processing have been prospected in this article. Key words: papain; extraction technology; food processing; application 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内，未成熟果实的乳汁中含量最丰富[1]。木瓜蛋白酶的作用范围很广，水解温度为10℃～80℃，在pH值3～9的范围内对底物均有作用，且稳定性好。在密封容器内，4℃的条件下或阴凉干燥处保存6个月酶活力仅下降0～10 或10 ～20 [2]。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解和合成能力，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，利用木瓜蛋白酶的酶促反应，可把大分子的蛋白质水解成容易消化吸收的小分子多肽或氨基酸[3-4]，不仅可以用来改善植物蛋白的营养价值或功能性质，而且也广泛应用于食品行业，如啤酒的澄清、肉的嫩化以及制革、纺织和日化用品等行业中，同时也受了医学界的极力关注和重视[5-6]。 1木瓜蛋白酶的制备 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，
白蛋白与昆虫蛋白的营养对比 摘要 摘要：：白蛋白具有重要的生理功能和药用价值，是血液总渗透压的主要调节物质。但是，以其为原料做成的制剂产品效果并不乐观。同时，我们把目光投向另一种新型营养能源——昆虫蛋白，通过两者的对比，浅析其营养成分与作用价值。 关键词：白蛋白、昆虫蛋白、营养价值 一、白蛋白与人血白蛋白制剂 白蛋白（Alb）又称清蛋白，是广泛存在于动植物细胞和体液中的一种球形单纯蛋白质。如卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白等都属于此类。 人血白蛋白具有维持血液渗透压、运输和解毒、抗休克、提供营养、调节机能障碍等生理功能。人血白蛋白制剂是一种从健康人血液里面分离提取、加温灭活病毒后制成的液体，直接静脉注射到病人体内，主要用于烧伤引起的休克，脑水肿及损伤引起的颅压升高，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水等危重病人和失血创伤、癌症术后营养严重不良者，是临床急救的一种特殊药品。 目前，不少人对人血白蛋白存在严重的错误认识，将人血白蛋白制剂当成“有病治病、无病强身”的营养品使用，认为人血白蛋白“营养丰富，可以防病治病、增强体质、加速疾病痊愈”。 其实，在临床上人血白蛋白只是一种营养药，而非营养品，对普通人甚至普通病人而言，其营养价值十分有限。而就算是注射了白蛋白，也不能“立竿见影”地提高营养水平。因为外源性白蛋白进入人体后，首先水解为氨基酸，然后才能被机体组织细胞所利用，合成所需的各种蛋白质。而在健康的人体内重新合成蛋白质的比率更低，有相当一部分只是作为能量燃料进行利用，供身体发热。其营养价值跟牛奶、鸡蛋毫无差别。 另外，人血白蛋白制剂中的若干生理活性物质，如微量内毒素、血管舒缓素可能产生副作用，使人出现血压下降、休克等循环紊乱，甚至有可能引起免疫力功能下降。偶尔可出现小寒战、发热、颜面潮红、皮疹、恶心呕吐等症状。快速输注可引起血管超负荷导致肺水肿及过敏反应。同时，目前生成的白蛋白制剂，虽然是经过严格加热消毒处理的，但也不能完全避免肝炎、艾滋病等传染性疾病的感染。因此，专家提醒消费者，人血白蛋白的使用要因人而异，因病而异，不能盲目输入，更不能当作营养品来补充。 在逐渐揭开人血白蛋白“真面目”的同时，更多人开始把目光投向其他营养物质。这时，一种新型的营养能源——昆虫蛋白开始进入人们的视野，并被大众所认可。 二、昆虫活性蛋白与其营养价值 昆虫活性蛋白是迄今为止，世界生物领域最神秘也是最令人期待的物质之一。科学家发现，尽管昆虫生活在潮湿、多菌的环境里，身上携带着多达几十种容易导致感染疾病的细菌、病毒，但这些昆虫却从来不生病。这正是由于昆虫体内含有一种神秘物质——昆虫蛋白。 第四代蛋白——昆虫蛋白，被誉为“天然白蛋白”。与人血白蛋白相比，昆虫蛋白在以下9个方面具有优越性： 一、营养性。 昆虫蛋白含粗蛋白59％～65％，脂肪10％～14％，小分子壳聚糖8％～10％和维生素、微量元素等，营养成分较全面。 在昆虫蛋白质中氨基酸比较齐全，所提供的氮基酸均能满足儿童和成人建议的氨基酸需
元素逗留时间:某元素以稳定速率向海洋输送，将海水胸该元素全部置换出来所需要的时间（单位:年）称为该元素的逗留时间。前提条件 1.稳态 2. 元素在海洋中是均匀的 海洋“稳态”原理: 海洋中各元素的含量（供给和从海水中去除）处于一种动态平衡的状态。 dA/dt=0 各元素含量不随时间改变 保守性元素:海洋中的浓度表现为无变化或几乎无变化的元素。 非保守性元素:海洋中的浓度表现为随位置变化而变化的元素。 恒比规律:尽管各大洋各海区海水的含盐量可能不同，但海水主要溶解成分的含量间有恒定的比值。 海水盐度:是指海水中全部溶解固体与海水重量之比，通常以每千克海水中所含的克数表示。海水氯度简称“氯度”:早期定义为：一千克海水中所含的溴和碘由等当量的氯置换后所含氯的总克数。单位为“克/千克，符号为Cl‰。为了使氯度值保持永恒性，便于相互比较，克努森和雅科布森在1940年提出新的定义：沉淀0.3285233千克海水中全部卤素所需银原子的克数，即为氯度。 标准海水:经过放置和严格的过滤处理，调整其氯度为19.38‰左右（其氯度值准确测定到0.001‰）的大洋海水。中国标准海水由中国海洋大学生产，其氯度值与中国海平均氯度数值相近，在17—19‰左右。 实用盐度标度:将盐度为35的国际标准海水用蒸馏水稀释或经蒸发浓缩,在15℃时测得的相对电导比. 绝对盐度:符号SA，定义为海水中溶解物质的质量与溶液质量的比值 营养盐:一般指磷、氮、硅元素的盐类。 营养盐再生:在真光层内，营养盐经生物光合作用被吸收，成为生物有机体组成部分，生物体死亡后下沉到真光层以下，有机体分解、矿化，营养元素最终以无机化学形式返回到海水中的过程为营养盐再生。 铁假说: 离子缔合:两个异号电荷离子相互接近到某一临界距离形成离子对的过程。 EH:通称氧化还原电位，氧化还原反应强度的指标。 PH:指氢离子浓度指数,是指溶液中氢离子的总数和总物质的量的比。 1.大气的气体组成可分为不变气体成分和可变气体成分两部分：不变气体成分（11种）主要成分：N2、O2、Ar 微量成分：He、Ne、Kr、Xe、H2、CH4、N2O；可变气体成分：CO2、O3、NO2、CO、SO2、NH3、H2O 2.生源: CH4、NH3、 N2O、 H2、 CS2、 OCS 光化学: CO、 O3、 NO2、 HNO3、 OH、 HO2、H2O2、 H2CO 闪电: NO、HO2 火山: SO2 4.真实气体（ Vander Waals方程）式中，a、b为范德华常数。a是与分子间引力有关的常数b是与分子体积和压缩系数有关的常数。 5.湿度校正：所谓湿度校正是将含有水蒸气的“湿”空气，折算成不含水蒸气的“干”空气。绝对湿度：大气中水蒸气的分压或含量。以分压表示时符号为“PH20”，单位为“Pa”或“atm”。 相对湿度：一定温度条件下，空气中水蒸气含量（或蒸气压）与该温度下饱和蒸气量（饱和蒸气压）的比值，以“h%”表示。 6.气体溶解度的概念：当气体在大气和海水之间达到平衡时，海水中溶解气体的浓度，即为该气体的溶解度（或称“饱和含量”）。 8.气体饱和度：现场温度、盐度条件下，某气体在海水中的实际浓度占该气体溶解度的百分量即为气体的饱和度。 9.位温：现场条件下，将一定深度下的海水绝热提升到海面时，海水应该具有的温度。
食品添加剂 木瓜蛋白酶 学院:食品与营养工程学院专业:食品加工 班级:食工102 学号:010******* 姓名:王瑞真
木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类疏基蛋白酶。广泛存在与番木瓜的根、茎、叶和果实内，在未成熟的乳汁中含量最丰富。它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特色，因此在食品、医药、饲料、皮革及纺织等行业得到广泛应用[1]。 一、木瓜蛋白的组分 工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶[2]。 二、木瓜蛋白的结构 木瓜乳汁中四种已知半肤氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性,其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。除chymopapain含有8个半肤氨酸外,其余三种酶都只含有7个半肤氨酸。25位的流基是活性位点,不参与二硫键的形成（chymopapain的117位琉基也不参与二硫键的形成 ）,其余疏基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。人们在不同清晰下得到了四种酶的X 一射线结构。四种酶的肤链折叠方式相似,形成两个大小相、构型不同的区域。一个是由a一螺旋构成的L一区,另一个是由大量反向平行的片层构成的R一区。活性位点氨基酸残基Cys25,Asn179和His159 就位于这些区域的表面,其中Cys25位于 L一区,起始a一螺旋上。木瓜蛋白酶家族的Cys25 ，Gly23，Gly65 形成的S。亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同,几何形状亦不同,对酶的性质影响较大[3]。 三、木瓜蛋白酶的提取工艺 1.过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，而且产品的纯度较低[4]。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机(>40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.3 试剂 三氯醋酸(TCA) 丙酮 二硫苏糖醇(DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上。 1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L； (2) EDTA 储存液： 18.61 g Na2EDTA?2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3) 亮肽素储存液(50 μg/ml，100×) 10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存； (4) 抑肽素储存液(70 μg/ml，100×) 1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存； (5) PMSF储存液(10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。 DTT 储存液(1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。 (7) 裂解液:
Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O Lysis buffer D (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml) Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer F 100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。 蛋白酶抑制剂混合物[3] 成分终浓度 蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 μg/ml 亮肽素 0.5 μg/ml 1.2 方法 1.1.1组织蛋白提取方法 1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1] (1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； (3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白–20℃沉淀过夜； (5)35000×g(6℃)离心30min； 将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中； (7)-20℃放置1h； 35000×g(6℃)离心30min； (9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）； (11)15℃,40000×g，离心1hr； (12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。 1.2.1.2超速离心法 (1)取材； (2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s；