海尔生物安全柜操作规程 1. 目的 为了规范海尔生物安全柜使用与维护，保证仪器正常运行，确保设备、环境、人员和血液的安全，建立本操作规程。 2. 范围 2.1适用于海尔生物安全柜使用及维护。 3. 职责 3.1检验科工作人员严格遵守本操作规程对核酸标本试管开盖、平衡温度以及对仪器进行使用维护，并填写《重点设备运行、保养记录》。 3.2 实验室负责人负责仪器的综合管理。 4. 环境要求 温度：18℃-25℃，湿度：30%-80% 5. 操作方法 5.1接通电源。 5.2抬高前窗玻璃，使玻璃门体下沿对正门高标志线（红点处）。 5.3安全柜自洁净运转，直至“please wait”消失。 5.4清洁安全柜工作台和内壁。 5.5实验操作。 5.6取出全部实验物品。 5.7安全柜自运行3分钟。 5.8清洁安全柜工作台和内壁。
5.9关闭前窗玻璃，将门体拉至最底部。 5.10切断电源。 6紫外灯设定步骤 6.1连续按“↑”或“↓”键，直至出现紫外灯设置页面。 6.2按动“设置”键，指示灯亮。 6.3在“U.V AUTO MODE:NO”中”NO“闪动时按动“↑”或“↓”键，进行转换，显示“YES“表示启动紫外灯自动运行模式。 6.4“TIME1“闪动可按动“↑”或“↓”键为紫外灯自动运行设定时间，最多可设置3个时间。 6.5按动“设置“键，指示灯灭，设置完成。 7维护和保养 7.1生物安全柜的维护和保养 7.1.1全面保养的周期 每年或每1000个工作时，以及每次重新启动都应当进行维护。 7.1.2清洁 在通常情况下，清洁只需用少量中性清洁剂，将它溶于水后直接擦拭，就可将设备表面的污物擦掉。 7.1.3在使用过程中每次清洁 （1）使用结束后，自运行5-10分钟。 （2）使用医用酒精消毒和清洗工作室。 （3）使用医用酒精对操作面板进行消毒和清洗。 （4）清洁剂清洁外表面及玻璃门。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
生物安全柜的操作规范 生物安全柜作为致病菌接种必备设备，在微生物检测中有着很重要的作用，为规范生物安全柜的操作。 本文从人员、使用环境、设备操作流程及注意事项等几个方面进行阐述，使微生物检测人员能够正确使用生物安全柜。 01 首先微生物检测人员需进行生物安全柜的使用培训才能进行操作，未经授权人员不能使用。 02 其次使用环境条件建议安置在10,000洁净度以上环境安置，环境在温度0～40℃、相对湿度不超过90％、无腐蚀性气体和通风良好的室内，远离高速尘源和震源。 安全柜附近不得有超过安全柜正面吸入风速（>0.5m/s）的气流。禁止在有人员频繁进出的场所、门和通道口处及空调送风口附近安装使用安全柜，以免空气干扰操作口及排气口气流。在安全柜周围应留有保养检修空间（至少应在两侧留出25cm，背面留出30cm）。
03 然后是仪器原理及操作流程：生物安全柜工作原理是空气由前窗操作口进入负压风道与柜体内空气充分混合后，由风机送入静压箱，经高效过滤器过滤后以垂直层流的状态进入操作区，操作区左右及后部墙体均为负压风道，使工作区与外部环境形成气幕及箱体双层隔离。 同时工作区被负压包围，保证样品不发生泄漏，操作区的气流由于风机的作用，通过负压风道与前窗操作口进入的空气混合后。 其中部分混合气体（约70%）由风机送入静压箱循环使用，其余混合气体（约30%）经排风高效过滤器过滤后排出柜体。 操作流程： 生物安全柜玻璃门为手动操作，正常工作时玻璃门的开启高度200mm，如果超出表示高度时，声光报警系统启动，提醒用户玻璃门超高。注：当玻璃门开启时，紫外灯无法开启。
生物安全柜电源为220V、50Hz，柜体后部方有接地标志，必须做到可靠接地后方可使用。 接通电源后，通电进入待命状态。 （1）按下[紫外灯控制键]，开启紫外灯消毒30分钟后将紫外灯关闭。（注：此时玻璃门应是关闭状态） （2）打开玻璃门到标识处。 （3）按下[风机启动键]，开启风机约30分钟左右，使操作区达到规定的洁净度。
1. 目的: 规范生物安全柜的操作与维护保养工作，确保设备的正常运作，以保障操作人员的安全。 2. 范围: 无菌实验室阳性间菌检员使用的BHC-1300A2生物安全柜。 3．职责：菌检员负责设备的正常操作与维护保养，由质量部经理复核相关文件记录。 4. 内容 4.1 安全柜应放置于十万级以下的初级净化间。操作前应打开紫外灯，照射30min，后将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用75%酒精擦拭物品表面消毒，以去除污染。 4.2 打开风机10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止2min，使柜内气流稳定后再进行操作。 4.3 生物安全柜内不放与本次实验无关的物品。物品应尽量靠后放置，不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。 4.4 操作时应避免交叉污染。为防止可能溅出的液滴，应准备好75%的酒精棉球或用消毒剂浸泡的小块纱布，避免用物品覆盖住安全柜的格栅。 4.5 在实验操作时，不可完全打开玻璃视窗，应保证操作人员的脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。 4.6 安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常，应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知质量部经理。 4.7 检验完成后，关闭玻璃视窗，保持风机继续运转10min，同时打开紫外灯，照射30min。 4.8 安全柜应定期进行清洁消毒，可用75%酒精或0.2%新洁尔灭溶液擦拭工作台面及柜体外表面；每次检验工作完成后应全面消毒。 4.9 柜内使用的物品应在消毒缸消毒后再取出，以防止将标准菌株残留带出而污染环境，造成生物危害。 4.10 使用方法： 4.10.1 安全柜采用LED液晶面板控制，控制面板包括的功能键有：电源开关键、杀菌灯键、风挡键（快速、慢速、无风）、照明键。 4.10.2 插上220V交流电源后，按下控制面板上的所示电源开关开启即可使用；需要灭菌时，按灭菌灯键；风挡键有三级（快速、慢速、无风）循环，默认为无风，按一次为慢速，再按为快速，第三次则回到无风，如此循环；平时操作照明，只需按照明键即可。 5.设备的维护保养 5.1 每次检验操作后用75%的酒精（其他杀菌剂视用户使用的材料而定）彻底对安全柜内部工作区域表面、侧壁、后壁、窗户进行表面净化。切勿使用含有氯的杀菌剂，因为它可能对安全柜的不锈钢结构造成损坏。同时对紫外灯和电源输出口表面进行清洁。当清洁安全柜内部区域时，操作人员除了手放以外，身体的其他任何部位不能进入安全柜。 5.2 长时间未实验时也得每两周进行清洁维护，按5.1进行，定期清洁不锈钢表面会使之保持表面的光滑美观。 5.3 每月用湿布对安全柜外部表面进行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆积的灰尘打扫干净。并检查所有的维护配件的合理使用情况。 5.4 根据实际情况，每个季度或者半年检查安全柜的任何物理异常或故障，如有异常及时报修；将初效过滤器拆下清洗，防止积尘将导致进风量不足，而降低洁净效果。 5.5 每年请具备资格的认证技术人员对安全柜进行性能认证，依据紫外灯使用寿命效果，进行紫外灯的更换；当正常调节或清洗初效空气过滤器后，仍达不到理想的截面风速时，则应调节风机的工作电压（旋动旋钮），从而达到理想的均匀风速（将调节风速旋钮从左向右，从低速向高速缓慢调节，新工作台不应调至最高风速）。 5.6 在使用十八个月后当风机工作电压调整至最高点时，仍不能达到理想风速时，则说明高效空气过滤器积尘过多（滤料上滤孔已基本被堵，要及时更新），一般高效空气过滤器的使用期限为十八个月；更换高效空气过滤器时，应注意型号规格尺寸（原生产厂家配置），按箭头风向装置，并注意过滤器的周边密封，绝对无渗漏现象发生。
慢病毒使用操作指南? 一、慢病毒的储存与稀释: ?1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4 ℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口） 注:Ａ．病毒可以存放于－80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过６个月,我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。??B.反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10％;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目的细胞用PＢＳ或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分 装后４℃保存(请尽量在三天内用完）,分装后使用。??二、慢病毒用于体外 (in vitro）实验:感染培养原代细胞和建系细胞 1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invａbｉo提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献,了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数（MOI 值）以及在体内（iｎｖiｖo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（ＭOI 值）(使用２4孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） ?２. 慢病毒感染目的细胞预实验 ①慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A. 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的(HEK2９3T,Hｅla) 细胞作为平行实验的对照细胞。? B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用）稀释;理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。?C．Invabio提供的病毒单位为TＵ/mｌ，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有１X1０8个具有生物活性的慢病毒颗粒。 ?②以24孔培养板为例,进行目的细胞和HEK29３T 细胞的感染预实验? 实验前按照不同的ＭOI设置不同的感染孔，并根据MOＩ和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用ＰBＳ溶液或者无血清培养基稀释病毒原液??第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3~５Ｘ10４个目的细胞,铺板时细胞的融合率为５0％左右，每孔培养基体积为10０μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 1、取出４℃保存的第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验:?? 病毒,使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可)；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢
第一天 病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。 加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。 注意：也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。 第二天 准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。 移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。 注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。 在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。 培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。 轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。 注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。 注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。 注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。 第三天 移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。 孵育细胞过夜。 第四天 欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。 第五－六天及以后 用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
目的：建立生物安全柜的的使用、清洁与维护保养标准操作规程。 范围：适用于微生物实验室的HBC-1300IIA 生物安全柜。 2 职责：审核本规程是质监部QC主任的责任,批准本规程是质量受权人的责任,执行本规程是质监部QC的责任。 1、名称：生物安全柜 2、型号: HBC-1300IIA2 3、依据：该设备的使用说明书 4 、安装及使用前准备 4.1安装 4.1.1生物安全柜安放位置在设计未指明时应避开人流频繁处和房间出入口，并应避免室内空气流动对操作口气流屏障造成干扰。
4.1.2如果实验室有窗子，应始终保持关闭。 4.1.3生物安全柜周围应留出30cm 的空间，以便清除脏物。如果空间限制，至少应在两边留出8cm，背面留出3.8cm空间。应在安全柜的电源处留出足够的空间，以便于在不移动安全柜的情况下，可进行维修。 4.1.4生物安全柜的背面、侧面离墙面的距离应保持在8～30cm之间。对于地面和底边紧贴地面的安全柜，所有的沿地边缘应加以密封。 4.1使用环境： 安全柜应放置不低于D级以下的洁净室（区） （1）工作电压：AC220 V（+10%，-15%） （2）输出负载：MAX AC250V/2A （3）工作温度：0℃～50℃ （4）工作湿度：40～90%（40 ℃不凝露） （5）存放温度：-10℃～+55℃ （6）大气压力：86～106Kpa 4.2使用前准备 4.2.1操作前应打开紫外灯，照射30min，后将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用75%酒精擦拭物品表面消毒，以去除污染。 4.2.2工作人员应在外衣外面穿上带扣的实验工作服，戴乳胶手套保护双手。手套应套在实验服衣袖外而不是扎在里面，穿紧口的袖子也可以保护操作者的手腕。 4.2.3在实验操作时，不可完全打开玻璃视窗，应保证操作人员的脸部在工作窗口之
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
Generation o f L entivirus Reagents ?293T: ATCC ?Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001 ?FBS: Invitrogen cat# 16000-044 ?DMEM: Invitrogen cat# 11965-118 ?Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155 ?L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156 ?Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050 ?Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024 ?Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058 293T/fibroblast media (500 mls): DMEM (450 ml) 10% FBS (50 ml) Pen/strep (5ml) L-glutamine (5ml) NEAA (5 ml) Reagent setup Lentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectors A. Production of Virus 1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cells reach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection. 2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorf tube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.doczj.com/doc/fb16855458.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/fb16855458.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.doczj.com/doc/fb16855458.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.doczj.com/doc/fb16855458.html,/
生物安全柜的操作流程 1.设备的操作界面： 在安全柜的操作屏上设有液晶显示窗口和五个触控式按键，能够动态显示设备运行状态以及各类故障信息。重复按动各键可相应完成“启动/停止风机；打开/关闭荧光灯；打开/关闭紫外灯；接通/切断插座电源；暂时消去报警声”的操作。 2. 操作流程： 由于生物安全柜是一种为了操作人员及其周围环境的安全,把在处理病原体时发生的污染气溶胶隔离在操作区域内的防御装置。因此,作业人员必须严格按照指定的操作流程,进行正确的操作,才能发挥其有效的隔离与防御作用。 ●作业前准备 打开安全柜的总电源开关，必须先将玻璃移门完全关闭后，再按“杀菌” 键开启紫外灯，实施紫外线杀菌操作。 请注意：此时作业人员必须远离设备，以免紫外线对人身造成伤害。 为了保护作业者，安全柜具有“杀菌操作的联锁与定时”功能。控制系统在杀菌操作连续运行三十分钟后，自动关闭紫外灯，并显示提示信息。在杀菌过程中，一旦打开移门或开启荧光灯，系统就会自动关闭紫外灯。 杀菌操作结束后，打开移门至200mm安全高度，按“送风机”键启动送风机运行,为了实现工作区域的自净，请保持设备在此状态运行十分钟后再开始正式作业。 ●正式作业 按“照明”键开启荧光灯,将移门保持在200mm安全高度,开始正式作业。 安全柜出厂检测时,已将工作区风速调节在额定范围，启动风机后,自动进入标准的额定状态运行，作业者不必进行风速调节。 在安全柜工作腔内部设有两个备用插座，供实验辅助设备使用。并具有独立的过流过载保护线路，不影响安全柜的正常运行。
请注意：1.作业时请不要将移门开启超过安全线高度，否则,将有气流不能平衡的危险,可能会引起不洁气熔胶外漏,而危害作业者的健康。 2.务必在“切断备用插座电源”的状态下，将辅助设备的电源插头插 入“备用插座”，再按“插座”键接通备用插座电源；使用结束时, 必须再次按“插座”键，切断插座电源。 3. 所用辅助设备的功耗不允许超过插座的最大负荷（见插座上标识）。 4. 吸入风口处禁止放置碎物或者细小物件，以免吸入风道至风机里。 结束作业 作业结束时,请保持风机运行十分钟后再关闭。按住“送风机”键持续3秒钟以上，可关闭风机。 请注意:操作结束时，务必先关闭送风机，等待风机停止运转后，再切断安全柜的电源。以免造成器件损坏。
静脉用药调配室生物安全柜的标准操作规程生物安全柜属于垂直层流台，通过层流台顶部的高效过滤器，可以过滤99.99%的0.3μm以上的微粒，使操作台空间形成局部100级的洁净环境，并且通过工作台面四周的散流孔回风形成相对负压，因此，不应当有任何物体阻挡散流孔，包括手臂等。 一、清洁与消毒： （一）每天在操作开始前，应当使用75%的乙醇擦拭工作区域的顶部、两侧及台面，顺序应当从上到下，从里向外； （二）在调配过程中，每完成一份成品输液调配后，应当清理操作台上废弃物，并用清水擦拭，必要时再用75%的乙醇消毒台面； （三）每天操作结束后，应当彻底清场，先用清水清洁，再用75%乙醇擦拭消毒； （四）每天操作结束后应当打开回风槽道外盖，先用蒸馏水清洁回风槽道，再用75%乙醇擦拭消毒。 二、生物安全柜的操作与注意事项： （一）有1至2位调配人员提前半小时先启动生物柜循环风机和紫外线灯，关闭前窗至安全线处，30分钟后关闭紫外线灯，然后用75%乙醇擦拭生物安全柜顶部、两侧及台面，顺序为从上到下、从里到外进行消毒，然后打开照明灯后方可进行调配； （二）紫外线灯启动期间，不得进行调配，工作人员应当离开操作间； （三）紫外线灯应当定期检测，如达不到灭菌效果时，应当及时更换灯管； （四）所有静脉用药调配必须在离工作台外沿20厘米，内沿8～10厘米，并离台面至少10厘米区域内进行； （五）调配时前窗不可高过安全警戒线，否则，操作区域内不能保证负压，可能会造成药物气雾外散，对工作人员造成伤害或污染洁净间； （六）生物安全柜的回风道应当定期用蒸馏水擦拭清洁后，再用75％乙醇消毒； （七）生物安全柜每月应当做一次沉降菌监测，方法：将培养皿打开，放置在操作台上半小时，封盖后进行细菌培养，菌落计数； （八）生物安全柜应当根据自动监测指示，及时更换过滤器的活性炭。 三、每年应当对生物安全柜进行各项参数的检测，以保证生物安全柜运行质量，并保存检测报告。
The prerequisite for vigorously developing our productivity is that we must be responsible for the safety of our company and our own lives. （安全管理） 单位：___________________ 姓名：___________________ 日期：___________________ 生物安全柜使用的操作规程 (2021新版)
生物安全柜使用的操作规程(2021新版)导语：建立和健全我们的现代企业制度，是指引我们生产劳动的方向。而大力发展我们生产力的前提，是我们必须对我们企业和我们自己的生命安全负责。可用于实体印刷或电子存档（使用前请详细阅读条款）。 1．每次使用前应检查生物安全柜的正常指标，包括风速、气流量和负压在正常范围。若出现异常应停止使用，进行检修工作。 2．在使用中不能打开玻璃观察窗。 3．生物安全柜内应尽量少放器材或样品，不能影响后部压力排风系统的气流循环。 4．生物安全柜内不能使用酒精灯，允许使用微型电加热器，最好使用一次性无菌接种环。 5．所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过玻璃观察挡板看到。操作者不要频繁移动手臂及挥动手臂以免破坏定向气流。 6．尽量减少操作者身后的人员走动以及快速开关房间的门，以防止对生物安全柜的气流造成影响。 7．操作时废物袋以及盛放废弃吸管的容器等必须放在安全柜内而不应放在安全柜之外。污染的吸管、容器等应先在放于安全柜内的装有消毒液的容器中消毒1h以上，方可转入医疗废物专用垃圾袋中进行
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
生物安全柜的操作规程及注意事项 1、操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免 双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用70%酒精 擦拭表面消毒，以去除污染。 2、打开风机5～10分钟，待柜内空气净化并气流稳定 后再进行实验操作。将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静 止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作。 3、安全柜内不放与本次实验无关的物品。柜内物品摆 放应做到清洁区、半污染区与污染区基本分开，操作过 程中物品取用方便，且三区之间无交叉。物品应尽量靠 后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。 4、操作时应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉 污染。为防可能溅出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂 浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖住安全柜格栅。 5、柜内操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产 生的热量产生气流，干扰柜内气流稳定；且明火可能损 坏HEPA滤器。 6、工作时尽量减少背后人员走动以及快速开关房门， 以防止安全柜内气流不稳定。 7、在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者 脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，
防止影响柜内气流。 8、安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。 工作中一旦发现安全柜工作异常，应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知相关人员。 9、工作完全后，关闭玻璃窗，保持风机继续运转10～ 15分钟，同时打开紫外灯，照射30分钟。 10、安全柜应定期进行清洁消毒，柜内台面污染物可在 工作完成且紫外灯消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭。 11、柜内使用的物品应在消毒后再取出，以防止将病原 微生物带出而污染环境。 缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态，柜内操作时手应该尽量平缓移动。 物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象产生，在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开，避免回风过程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。 避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器（例如离心机、旋涡振荡器等）的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物
生物安全柜标准（SFDA 版）微生物安全柜性能要求 Performance criteria for microbiological safety cabinets 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布目次目次II 前言IV 1 范围 1 2 规范性引用文件1 3 术语和定义1 4 分级 2 4.1 Ⅰ级微生物安全柜2 4.2 Ⅱ级微生物安全柜2 4.3 Ⅲ级微生物安全柜3 5 基本要求4 5.1 外观要求 4 5.2 基本功能要求4 5.3 尺寸偏差 4 5.4 材料要求 4 5.5 结构要求 5 6 性能要求7 6.1 柜体防泄漏7 6.2 HEPA 过滤器防泄漏7 6.3 噪声7 6.4 光强度7 6.5 振动7 6.6 人员、产品与交叉污染防护7 6.7 下降气流流速8 6.8 流入气流流速8 6.9 气流模式8 6.10 集液槽泄漏8 6.11 稳定性8 6.12 温升9 6.13 压差9 6.14 电气设备9 7 性能试验方法9 7.1 箱体防泄漏9 7.2 HEPA 过滤器泄漏9 7.3 噪声9 7.4 光强度9 7.5 振动9 7.6 人员、产品与交叉污染保护的微生物试验9 7.7 下降气流流速10
7.8 流入气流流速10 7.9 气流模式10 7.10 排溢槽泄漏10 7.11 稳定性10 7.12 温升10 7.13 压差10 8 检验规则10 8.1 出厂检验10 8.2 型式检验10 8.3 安装检验11 8.3 常规维护检验11 9 标志11 9.1 产品标志（铭牌）11 9.2 包装标志12 10 包装、运输、储存12 10.1 包装12 10.2 随机文件与附件13 10.3 运输13 10.4 储存13 附录 A （规范性附录）性能测试14 附录 B （资料性附录）枯草芽孢杆菌悬浮液的制备33 参考文献35 前言 本标准参照EN12469:2000《生物技术微生物安全柜性能要求》和NSF/ANSI49-2002 《Class Ⅱ（层流）生物安全研究柜》制定。 本标准的附录 A 为规范性附录，附录 B 为资料性附录。本标准由国家食品药品监督管理局提出。 本标准由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会归口。本标准起草单位：北京市医疗器械检验所、广州新仪仪器有限公司、上海瑞仰净化装备有限公司、力新仪器（上海）有限公司、上海复星医学科技发展有限公司、新加坡ESCO 公司。本标准主要起草人： 微生物安全柜性能要求 Performance criteria for microbiological safety cabinets 1 范围本标准适用于微生物安全柜,并规定符合本标准的安全柜可以通过测试。本标准包括对微生物安全柜设计、结构和性能的基本要求、试验方法、检验规则和产品的标志、包装、运输。这种安全柜应有对人员、产品和环境的保护、安全运转、耐久性和结构稳定性、洁净能力、噪音水平的限制、照明、振动、电动机/鼓风机性能的基本要求。 2 规范性引用文件 下列标准中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后 所有的修改单（不包括堪误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准目 的达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新
慢病毒使用操作手册 1.慢病毒使用操作 2.慢病毒安全使用规范 3.悬浮细胞感染方法概要 4.相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ) 5.细胞培养器皿的相关参数 地址: 上海市浦东新区张江高科园蔡伦路781号电话: 400 616 7117
地址: 上海市浦东新区张江高科园蔡伦路781号 电话: 400 616 7117 1 慢病毒使用操作手册 1.1 慢病毒的储存与稀释: 1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） 注：A ． 病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 B ． 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS 或无血清培养基 (含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存 (请尽量在三天内用完) 分装后使用。 1.2 慢病毒用于体外（In Vitro ）实验：感染培养原代细胞和建系细胞 1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio 提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo ）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） 1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验 1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A ． 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细（HEK293T ，Hela ） 细胞作为平行实验的对照细胞。 B ． 在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 C ． Invabio 提供的病毒单位为TU/ml , 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 1.2.2.2 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验 实验前按照不同的MOI 设置不同的感染孔，并根据MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl ；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
在实验室中使用苏净安泰生物安全柜操作说明： 1. 位置空气通过前面开口进入生物安全柜的速度大约为0.45m/s。这样速度的定向气流是极易受到干扰的，包括人员走近生物安全柜所形成的气流，打开窗户，送风系统调整以及开关门等都可能造成影响。 因此，最为理想的是，生物安全柜应位于人员活动，物品流动以及可能会扰乱气流的地方。在安全柜的后方以及每一个侧面要尽可能留有30cm的空间，以利用对安全柜的维护。在安全柜的上面应留有30-35cm的空间，以便准确测量空气通过排风过滤器的速度，并便于排风过滤器的更换。 2. 操作人员生物安全柜如果使用不当，其防护作用就可能大大地受到影响。操作人员在移动双臂进出安全柜时，需要小心维持前面开口处气流的完整性，双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口。 手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟，以便安全柜调整完毕并且让里面的空气"扫过"手和双臂的表面以后，才可以开始对物品进行处理。要在开始实验之前将所有必须的物品置于安全柜内，以尽可能减少双臂进出前面开口的次数。 3.物品放置二级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸，仪器设备或其他物品阻挡。放入安全柜内的物品应采用70%酒精来消除表面污染。可以在消毒剂浸湿的毛巾上进行实验，以吸收可能溅出的液滴。 所有物品应尽可能地放在工作台后部靠近工作台边缘的位置，并使其在操作中不会阻挡候补格栅。可产生气溶胶的设备（例如混匀器，离心机等）应靠近安全柜的后部放置。像有生物危害性的废弃物袋，盛放废弃吸管的盘子以及吸滤瓶等体积较大的物品，应该放在安全柜内的某一侧。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。 耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及吸管盛放盘不应放在安全柜的外面，否则在使用这些物品时双臂就必须频繁进出安全柜，这样会干扰安全柜空气屏障的完整性，从而影响对人员和物品的防护。 4.操作和维护大多数生物安全柜的设计允许全天24小时工作。研究人员还发现，连续工作有助于控制实验室中灰尘和颗粒的水平。向房间中排风或通过套管接口与专门的排风管相连接的一级A1和A2型生物安全柜，在不使用时是可以关闭的。其他如二级B1和二级B2型生物安全柜，是通过硬管安装的，就必须始终保持空气流动以维持房间空气的平衡。 在开始工作以前以及完成工作以后，应至少让安全柜工作5分钟来完成"净化"的过程，应即应留在将污染的空气派出安全柜的时间。 生物安全柜的所有维修工作应该由有资质的专业人员来进行。在生物安全柜操作中出现的任何故障都应该报告，并应在再次使用之前进行维修。 5.紫外灯生物安全柜中不需要紫外灯。如果使用紫外灯的话，应该每周进行清洁，以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。在安全柜重新认证时，要检查紫外线的强度，以确保有适当的光发射量。房间中有人时一定要关闭紫外灯，以保护眼睛和皮肤，避免因不慎暴露而造成伤害。 6.明火在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中，应避免使用明火。使用明火会对气流产生影响，并且在处理挥发性物品和易燃物品时，也易造成危险。在对接种环进行灭菌时，可以使用微型燃烧器或电炉，而不应使用明火。 7. 溢出实验室中要张贴如何处理溢出物的实验室操作规则，每一位使用实验室的成员都要阅读并理解这些规程。一旦在生物安全柜中发生由生物学危害的物品溢出时，应在安全柜出于工作状态下立即进行清理。要使用有效的消毒剂，并在处理过程中尽可能减少气溶胶的生成。所有接触溢出物品的材料都要进行消毒/或高压灭菌。 8. 认证在安装是一季每隔一定时间以后，应由有资质的专业人员按照生产商的说明对