分子标记辅助选择育种
传统的育种主要依赖于植株的表现型选择
(Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。
育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选
择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。
第一节分子标记的类型和作用原理
一、分子标记的类型和特点
按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引
物类型又可分为：①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记(Random 别amplification polymorphism DNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标记(1nter-simple sequence repeats polymorphisms，ISSR)等技术；
②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3'端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记(Simple sequence repeats，SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术)和序标位(Sequence—tagged sites，简称STS)等。第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。表达序列标签(Expressed sequences tags，EST)是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序(Singlepass sequence)而产生的300～500bp的核苷酸片段。
应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表17—1。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不是太高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。
二、分子标记的原理和遗传特性
(一)RFLP
发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在20世纪70年代已被发现。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。目前，该技术已广泛用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记等。
1．RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插人、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，
用放射性同位素(如32P)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的
探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况(图17—2)。
对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。
RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。
2．RFLP标记的特点RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F，中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。
RFLP标记所需DNA量大(5～15鹏)，检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA 克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素(通常为少')，易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于育种上利用。
(二)RAPD标记
1．RAPD标记的原理Williams等(1990)以DNA聚合酶链式反应为基础而提出的。所谓RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为10个核苷酸)通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。RAPD标记的原理同PCR技术，但又有别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：·①引物。常规的PCR 反应所用的是一对引物，长度通常为20bp(碱基对)左右；RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp。②反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般为55—60℃，而RAPD的复性温度仅为36℃左右。③扩增产物。常规PCR产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核
苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。
原理上与RAPD相似的还有AP—PCR(Arbitrarily
primed polymerae chain reaction)。AP—PCR指在PCR反应中使用的引物长度与一般PCR反应中的引物相当，但在反应开始阶段退火温度较低，允许大量错配，因此可引发随机的扩增。一般在AP—PCR反应中应用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影，检测其多态性。
2．RAPD标记的特点如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。若PCR产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标记，通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这
F1的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为“有／无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。
RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种
质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。因此RAPD 也是一种潜力很大的分子标记。
由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探针制备、同位素标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。RAPD分析所需DNA样品量少(一般5～10ng)，对DNA质量要求较RFLP低。同时，RAPD标记还可转化为RFLP探针，SCAR及STS等表现为共显性和显性的分子标记。
RAPD最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg2+浓度等。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。
3．SCAR标记在RAPD技术的基础上，1993年，Paran等提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。它的基本原理是：目标DNA经RAPD分析后，将RAPD多态片段克隆一对克隆片段两端测序一根据测序结果设计长为18～24bp的引物，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段，由于Taq酶可使PCR产物3，末端带上A尾巴，人工设计的克隆载体5，末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物，PCR扩增，检测是否还能扩增出
原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR 标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。
(三)AFLP
它是荷兰Keygene公司科学家Marc ＆Pieter l993年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100—150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。
1．AFLP标记的原理首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequent cutter)，另一种为酶切频率较低的酶(rare cutter)。用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易于扩增的，且可在测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA 片段的数量。AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制内切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。将酶切片段和含有与其黏性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1～3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP
的原理示意图见图17—3。AFLP分析的基本步骤可以概括为：
(1)将基因组DNA同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，在这些DNA片段两端连接上特定的寡核苷酸接头(oligo nucleotide adapters)。
(2)通过接头序列和PCR引物3'末端的识别，对限制性片段进行选择扩增。一般PCR引物用同位素32P或33P标记。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。
(4)将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理。
(5)在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。
为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。
2.AFLP标记的特点AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。
AFLP多态性远远超过其他分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50—100条AFLP扩增产物，一次PCR 反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。
AFLP标记多数具有共显性表达、无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。
该技术受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格较贵，分析成本高；对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这也是它的不足之处。
(四)SSR
1987年，Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，他们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR(Variable量number tande repeat)。VNTR 标记包括小卫星(minisatellites)和微卫星(mierosatellites)标记两种。微卫星标记，即SSR标记，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置(图17—4A)。如(CA)n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重复，其中n 代表重复次数，其大小在10～60之间。这类序列的重复长度具有高度
变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组研究。目前植物SSR研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已明确在植物核基因组中，各种SSR数量从大到小依次为(AT)n、An、Tn、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTI)n、(AC)n、(GT)n等。
1．SSR标记的原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA 两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。
建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般程序(图17—4A)如下：①建立基因组DNA的质粒文库；②根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲获得(AT)I／(TA)nSSR则可合成G(AT)n作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆；③对阳性克隆DNA插人序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤以待研究的植物DNA 为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；⑥高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。
目前，SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制及品种纯度检测，以及目标性状基因标记等领域。特别在人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，已成为取代RFLP标记的第二代分子标记。
2．SSR标记的特点SSR的检测是依据其两侧特定的引物进行PCR 扩增，因此是基于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳它可检测出单拷贝差异。它兼具PCR反应的优点，所需DNA样品量少，对DNA质量要求不太高。
使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。这可以在其他种的DNA数据库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，因此微卫星标记的开发成本高。
3．ISSR标记在SSR标记的基础上开发的ISSR(inter-simple sequence repeat polymorphicDNA)分子标记是用两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间单拷贝序列，通过电泳检测其扩增产物的多态性。引物设计采用二个核苷酸、三个核苷酸或四个核苷酸序列为基元(motifs)，以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物，从而保证引物与基因组DNA中SSR的5'或3'末端结合，通过PCR
反应扩增两个SSR之间的DNA片段。如(AC)nX，(TG)nX，(ATG)nX，(CTC)nX，(GAA)nX等(X代表非重复的锚定碱基)。Naganka等(1997)已在小麦的
ISSR标记研究中发现ISSR标记可获得数倍于RAPD标记的信息量。由于ISSR标记不像RFLP标记一样步骤繁琐，且不需同位素标记，因此，针对重复序列含量高的物种，利用ISSR法可与RFLP，RAPD等分子标记相媲美。它对填充遗传连锁图上大的不饱和区段，富集有用的理想标记具有重要意义。
(五)其他标记
1．CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence—tagged sites) CAPs技术又称为PCR—RFLP。用特异设计的PCR引物扩增目
标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很小，以至无多态性出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性(Akopyanz等，1992)。其基本步骤是：先利用特定引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，溴化乙锭(EB)染色，观察其多态性。与RFLP技术一样，CAPs技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。Talbert等(1994)在小麦中将RFLP标记转化为STS标记过程中，有些STS标记无多态，但酶切后又出现多态性。CAPs作为一种分子标记，有以下几个优点：①引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析。②在真核生物中，CAPs标记呈共显性。③所需DNA量少。④结果稳定可靠。⑤操作简便、快捷、自动化程度高。CAPs标记最成功的应用是构建拟南芥遗传图谱。Konieczny等(1993)将RFLP探针两端测序，合成PCR引物，在拟南芥基因组DNA中进行扩增，之后用一系列4碱基识别序列的限制性内切酶酶切扩增产物，产生了很多CAPs标记，并且只用了28个巧植株，就将这些CAPs标记定位在各染色体上并构建了遗传图谱。I-tittalmani(1995)等找到了一个抗稻瘟病基因Pi—2(t)的CAPs标记。总之，CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。但在多倍体植物中的应用有一定局性。另外，CAPs标记需使用内切酶，这又增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。
2．STS(Sequence—tagged sites) STS是序列标签位点或序标位的简称。它是指基因组中长度为200～500bp，且核苷酸／顷序已
知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。1989年，华盛顿大学的Olson等人利用STS单拷贝序列作为染色体特异的界标(Landmark)，即利用不同STS的排列顺序和它们之间的间隔距离构成STS图谱，作为该物种的染色体框架图(Framework map)，它对基因组研究和新基因的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。STS引物的获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列，微卫星序列。其中，最富信息和多态性的STS标记应该是扩增含有微卫星重复顺序的DNA区域所获得的STS标记。
迄今为止，STS引物的设计主要依据单拷贝的RFLP探针，根据已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增。与RFLP相比，STS标记最大的优势在于不需要保存探针克隆等活体物质，只需从有关数据库中调出其相关信息即可。最近，随着人类基因组研究的深入，表达序列标定(expressed sequence tags，ESTs)应运而生。由于它直接与一个表达基因相关，很易于转变成STS。
STS标记表现共显性遗传，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介，它的实用价值很具吸引力。但是，与SSR标记一样，STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，目前仍显成本太高。目前，国际上已开始收集STS信息，并建立起相应的信息库，以便于各国同行随时调用。
第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术
分子标记辅助选择育种 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择 (Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。 育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选
择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。 第一节分子标记的类型和作用原理 一、分子标记的类型和特点 按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引
分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位在鸡遗传育种中的应用 摘要：近年来，随着畜禽基因组研究计划相继开展，分子标记的研究与应用得到 了迅速的发展，这为准确地评价畜禽群体遗传结构及遗传多样性提供了新的机遇。分子标记辅助选择（MAS）也越来越受到育种学家的广泛关注，并且目前已用于生产实践，对提高经济效益和育种效率起到了大的推动作用。而对鸡的染色体上QTL定位工作也有了迅猛的发展，成为动物基因定位工作中一个异常活跃的领域。对鸡数量性状的研究也已发展为直接将研究目标指向各个数量性状位点，借助各种遗传标记，构建遗传连锁图谱，通过一定的统计分析方法，从而将影响数量性状的多个基因定位于特定的染色体区域。分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位之间具有紧密联系。本文主要综述分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位在鸡遗传育种中的研究进展。 关键词：鸡；分子标记辅助选择（MAS）；QTL定位 1.引言 鸡的许多经济性状属数量性状，该类性状的发生受到2对或更多对等位基因的控制，每对等位基因没有显性与隐性的区别，而是共显性的。这些等位基因对该数量遗传性状形成的作用微小，所以也称为微效基因(minor gene)，它们在染色体上的位置称为数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。目前随着QTL 研究的深入，不仅丰富和发展了数量遗传学的内容，成为新兴的分子数量遗传学的主体，也必将对畜禽的育种改良起到极大的推动作用，从而开创动物育种的新纪元。 2.分子标记辅助选择（MAS） 2.1 相关概念 Stam（1986）提出通过限制性片段长度多态性（RFLP），可对生物有机体的基因组进行标记，利用标记基因型能非常准确地估计数量性状的育种值，以该育种值为基础的选择，称为标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）。Lander 和Thompson（1990）定义标记辅助选择，为把分子遗传学方法和人工选择相结合达到性状（traits）最大的遗传改进，人们进一步将MAS定义为以分子遗传学和遗传工程为手段，在连锁分析的基础上，运用现代育种原理和方法，实现性状最大的遗传改进。 2.2 常用分子遗传标记及应用 目前常用于家禽遗传育种的分子遗传标记主要有：(1)限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP);(2)DNA指纹(DNA fingerprint，DFP);(3)随机扩增多态DNA(Randomly Amplified polymorphisms DNA，RAPD);(4)微卫星DNA(Microsatellite DNA);(5)单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP);另外随着仪器的改善和技术的不断提高，现在也发展了很多新型、高效的检测突变的方法。下面主要介绍目前家禽遗传育种中常用的分子遗传标记。
第六章分子标记辅助选择 选择是育种中最重要的环节之一。所谓选择，是指在一个群体中选择符合要求的基因型。但在传统育种中，选择的依据通常是表现型而非基因型，这是因为人们无法直接知道个体的基因型，只能从表现型加以推断。也就是说，传统育种是通过表现型间接对基因型进行选择的。这种选择方法对质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说，则效率不高，因为数量性状的表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系。即使是质量性状，有的也可能会因为表型测量难度较大或误差较大而造成表型选择的困难。另外，在个体发育过程中，每一性状都有其特定的表现时期。许多重要的性状（如产量和品质）都必须到发育后期或成熟时才得以表现，因而选择也只能等到那时才能进行。这对于那些植株高大、占地多、生长季长的作物，特别是果树之类的园艺作物，显然是非常不利的。总之，传统的基于表型的选择方法存在许多缺点，效率较低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对基因型进行选择。 分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以识别的。如果目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标记基因型的检测，就能获知目标基因的基因型。因此，我们能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这称为标记辅助选择（MAS）。这是分子标记在育种中应用的最主要方面。 第一节质量性状的标记辅助选择 如前所述，传统的表型选择方法对质量性状一般是有效的， 86
因为质量性状的表现型与基因型之间通常存在清晰可辨的对应关系。因此，在多数情况下，对质量性状的选择无须借助于分子标记。但对于以下三种情况，采用标记辅助选择可提高选择效率：（1）当表现型的测量在技术上难度很大或费用太高时；（2）当表现型只能在个体发育后期才能测量，但为了加快育种进程或减少后期工作量，希望在个体发育早期（甚至是对种子）就进行选择时；（3）除目标基因外，还需要对基因组的其它部分（即遗传背景）进行选择时。另外，有些质量性状不仅受主基因控制，而且还受到一些微效基因的修饰作用，易受环境的影响，表现出类似数量性状的连续变异。许多常见的植物抗病性都表现为这种遗传模式。这类性状的遗传表现介于典型的质量性状和典型的数量性状之间，所以有时又称之为质量-数量性状。不过，育种上感兴趣的主要还是其中的主基因，因此习惯上仍把它们作为质量性状来对待。这类性状的表型往往不能很好地反映其基因型，所以按传统育种方法，依据表型对其主基因进行选择，有时相当困难，效率很低。因此，标记辅助选择对这类性状就特别有用。一个典型的例子是大豆孢囊线虫病抗性的标记辅助育种（Y oung 1999）。 本节首先介绍质量性状标记辅助选择的基本方法（前景选择和背景选择），然后介绍它们在育种上的应用（基因聚合和基因转移）。 一、前景选择 对目标基因的选择称为前景选择（foreground selection; Hospital and Charcosset 1997），这是标记辅助选择的主要方面。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。假设某标记座位（M/m）与目标基因座位（Q/q）连锁，重组率为r，F1代基因型为MQ/mq，其中Q为目标等位基因，亦即要选择的对象。由于M 87
Euphytica(2005)142:169–196 DOI:10.1007/s10681-005-1681-5C Springer2005 An introduction to markers,quantitative trait loci(QTL)mapping and marker-assisted selection for crop improvement:The basic concepts B.C.Y.Collard1,4,?,M.Z.Z.Jahufer2,J.B.Brouwer3&E.C.K.Pang1 1Department of Biotechnology and Environmental Biology,RMIT University,P.O.Box71,Bundoora,Victoria3083, Australia;2AgResearch Ltd.,Grasslands Research Centre,Tennent Drive,Private Bag11008,Palmerston North, New Zealand;3P.O.Box910,Horsham,Victoria,Australia3402;4Present address:Plant Breeding,Genetics and Biotechnology Division,International Rice Research Institute(IRRI),DAPO Box7777,Metro Manila,Philippines; (?author for correspondence:e-mail:bcycollard@https://www.doczj.com/doc/018448344.html,) Received11July2004;accepted2February2005 Key words:bulked-segregant analysis,DNA markers,linkage map,marker-assisted selection,quantitative trait loci (QTLs),QTL analysis,QTL mapping Summary Recognizing the enormous potential of DNA markers in plant breeding,many agricultural research centers and plant breeding institutes have adopted the capacity for marker development and marker-assisted selection(MAS). However,due to rapid developments in marker technology,statistical methodology for identifying quantitative trait loci(QTLs)and the jargon used by molecular biologists,the utility of DNA markers in plant breeding may not be clearly understood by non-molecular biologists.This review provides an introduction to DNA markers and the concept of polymorphism,linkage analysis and map construction,the principles of QTL analysis and how markers may be applied in breeding programs using MAS.This review has been speci?cally written for readers who have only a basic knowledge of molecular biology and/or plant genetics.Its format is therefore ideal for conventional plant breeders,physiologists,pathologists,other plant scientists and students. Abbreviations:AFLP:ampli?ed fragment length polymorphism;BC:backcross;BSA:bulked-segregant analysis; CIM:composite interval mapping;cM:centiMorgan;DH:doubled haploid;EST:expressed sequence tag;SIM:sim-ple interval mapping;LOD:logarithm of odds;LRS:likelihood ratio statistic;MAS:marker-assisted selection;NIL: near isogenic lines;PCR:polymerase chain reaction;QTL:quantitative trait loci;RAPD:random ampli?ed poly-morphic DNA;RI:recombinant inbred;RFLP:restriction fragment length polymorphism;SSR:simple sequence repeats(microsatellites);SCAR:sequence characterized ampli?ed region;SNP:single nucleotide polymorphism; STS:sequence tagged site Introduction Many agriculturally important traits such as yield,qual-ity and some forms of disease resistance are controlled by many genes and are known as quantitative traits(also ‘polygenic,’‘multifactorial’or‘complex’traits).The regions within genomes that contain genes associated with a particular quantitative trait are known as quan-titative trait loci(QTLs).The identi?cation of QTLs based only on conventional phenotypic evaluation is not possible.A major breakthrough in the characteri-zation of quantitative traits that created opportunities to select for QTLs was initiated by the development of DNA(or molecular)markers in the1980s. One of the main uses of DNA markers in agricul-tural research has been in the construction of linkage maps for diverse crop species.Linkage maps have been utilised for identifying chromosomal regions that contain genes controlling simple traits(controlled by a single gene)and quantitative traits using QTL
分子标记辅助育种技术 第一节 分子标记的类型和作用原理 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。 在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。 在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。 在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。 1、形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。 形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。 有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。 2、细胞学标记 细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。 核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。 可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。 染色体结构特征 带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄 和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染 色质的分布差异。 染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的
遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。 细胞学标记 优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。 缺点： （1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力； （2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料； （3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应； （4）观察鉴定比较困难。 3、蛋白质标记 用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。 非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。 酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。 蛋白质标记的不足之处： （1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术； （2）某些酶的活性具有发育和组织特异性； （3）标记的数量有限。 4 、 DNA标记 DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。 DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸系列的任何差异，包括单个核苷酸的变异。 二、分子标记的类型及作用原理
分子标记的发展及分子标记辅助育种 分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。 分子标记辅助育种示意图 DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的类型 分子标记按技术特性可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指
纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。 分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 各种分子标记的原理和优缺点 第一代分子标记：RFLP RFLP在20世纪70年代已被发现，是发现最早的一种分子标记。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。 RFLP标记的原理：植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA 所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如P32)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。 优点: RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。
目录 第一节分子标记的类型和作用原理 第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术 第三节作物分子标记辅助育种 第一节 分子标记的类型和作用原理 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。 在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。 在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。 在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。 1、形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。 形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。 有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。 2、细胞学标记 细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。 核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。 可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。 染色体结构特征 带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄
和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染 色质的分布差异。 染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的 遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。 细胞学标记 优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。 缺点： （1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力； （2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料； （3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应； （4）观察鉴定比较困难。 3、蛋白质标记 用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。 非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。 酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。 蛋白质标记的不足之处： （1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术； （2）某些酶的活性具有发育和组织特异性； （3）标记的数量有限。 4 、 DNA标记
第十七章分子标记辅助选择育种 分子标记：以DNA多态性为基础的遗传标记 分子标记的特点：1、遗传多态性高；2、在基因组中大量存在且均匀分布；3、稳定性、重现性好；4、信息量大，分析效率高 第一节 分子标记的类型及原理 一、分子标记的类型 1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术：限制性片段长度多态性标记，简称RFLP标记；可变数目串联重复序列标记，简称VNTR标记；原位杂交，简称ISH 2、基于PCR的DNA标记：1）单引物PCR标记；2）双引物选择性扩增的PCR标记；3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。 3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记。分为两类：限制性酶切片段的选择性扩增，如AFLP；PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs 4、基于单核苷多态性的DNA标记：单核苷酸多态性，简称SNP 二、主要分子标记 1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）限制性片段长度多态性 1980，Bostein用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。 （1）RFLP标记的原理 基因组DNA序列上的变化：碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化 （1）RFLP标记的分析步骤 （2）RFLP分析探针 单拷贝或寡拷贝 探针来源：cDNA克隆；基因组克隆（Random Genome）；PCR克隆（3）RFLP标记的特点 优点：①数目几乎无限；②共显性；③可以利用现有探针，具有种族特异性；④RFLP标记遍及全基因组；⑥重复性好 缺点：成本较高;一个探针只能产生一个多态位点；需要许多克隆探针；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染 2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）随机扩增多态性DNA 1990,Williams通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性
分子标记辅助选择(MAS) 的发展策略 Molecular-assisted-selection 作者: jdt5155873(站内联系TA)收录: 2006-02-25 发布: 2006-02-25 分子标记辅助选择(MAS) 的发展策略 在表型选择有效的情况下，MAS 更适用于隐性，限性，测定困难或费用昂贵以及未成熟期鉴定性状。在实际运用过程中应用一定策略，降低应用成本，MAS 的作用将可得到更大发挥。 1.1 定位作图与育种同步进行 育种群体与定位群体之间的重组频率是有变化的，不一定相同，在不同群体中QTL 检测一致性低，而在同一群体不同世代中较高(Bohn et al.，2001)。研究者对目标基因进行定位是为了利用这些基因，一个重要途径就是进行MAS 提高种育种效率，为大规模培育优良品系或品种创造条件，而MAS 希望使用在育种群体中与目的基因重组率仍旧较低的标记。方宣钧等(2001)建议选择杂交亲本时尽量使用与育种直接有关的材料，所构建群体应尽可能做到既是遗传研究群体，又是育种群体，这样定位与MAS 同步进行可缩短基因(QTL) 定位研究与育种应用的距离，提高育种效率和MAS 效益。 1.2 选择合适标记类型 适合于MAS 的分子标记必须符合如下几个条件：检测手段简单快捷，易于实现自动化；DNA 质量要求不高，用量少，可以同时分析大量样品；信息量大，分析效率高；多态性好，在基因组中大量存在而且分布均匀；开发成本和使用成本低。目前已经发展出十几种标记技术，比较常用有RFLP、RAPD、SSR、AFLP (amplified fragment length polymorphism)、SCAR、STS 和CAPS 等。 理想分子标记应该是建立在PCR 技术基础上，重复性高，在广泛基因背景下都能表达，在不同研究者中能相互交换使用，并能有效跟踪目标基因的标记，如水稻抗白叶枯病基因Xa21 标记pTA248。而选用何种分子标记来进行MAS 选择，直接关系到选择效果。对于前景(目标基因)选择，所有标记技术都可以采用，但PCR 标记最佳，共显性SSR、CAPS 和STS 是首选标记，其次是SCAR。至于背景选择，应根据情况灵活选用，目前在低世代最合适的是RAPD、AFLP 和SSR 等，但在高世代AFLP 由于可检测到更多多态位点而优于其他标记。 夏军红等(2000)比较AFLP 和SSR 两种标记背景选择的相关性，发现达显著水平，结果具有同一性。因此，在实际应用过程中，选用一种标记类型进行背景选择即可。
分子标记辅助选择复习资料（GAU） 第一章 1.DNA变性：在高温或某些化学试剂作用下双链DNA分子的两条互补的单链会相互分开的过程。 2.DNA复性：当变性的外界条件消除后，互补的单链DNA又可恢复双螺旋结构的过程。 3.基因组：是指一种生物或个体细胞所具有的一套完整的基因及其调控序列。 4.显性标记：是指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD, AFLP等。 5.共显性标记：是指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现，如RFLP, SSR,SCAR, ISSR, CAPs。 6.琼脂糖凝胶电泳：分离，纯化和鉴定长度为0.2—50Kb的DNA片段。应用于RAPD,RFLP,ISSR,SCAR等。 7.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分离，纯化和鉴定长度为5—500bp的DNA 长度。 非变性PAGE:应用于SSR等 变性PAGE:应用于AFLP等 8.纯化后DNA浓度的确定： OD260∕OD280=1.8 纯DNA OD260∕OD280<1.8 有蛋白污染 OD260∕OD280>1.8 有RNA污染 OD260∕OD280=2.0 纯RNA OD260∕OD280<2.0 有盐，多糖等污染 9.理想分子标记需达到的要求： ①具有高的多态性 ②共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和純合基因性 ③能明确辨别等位基因 ④除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组 ⑤选择中性（即无基因多态性） ⑥检测手段简单，快速 ⑦开发成本和使用成本尽量低廉 ⑧在实验室内和实验室间重复性好 10.分子标记优越性 ①直接以DNA的形式表现 ②数量多，遍及整个基因组，检测位点近于无限 ③多态性高，不需要专门创造特殊的遗传材料 ④不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁 ⑤有许多分子标记表现为共显性 11.分子标记类型 1）以分子杂交为基础的DNA标记技术 ①限制性片段长度多态性（RFLP） ②可变数目串联重复序序列（VNTR） ③染色体原位杂交（In situ Hybridization）
分子标记筛选实验 DNA提取的实验仪器与耗材准备：水浴锅，高速冷冻离心机，小型离心机，预冷的异丙醇，1.5ml的灭菌eppondorf管，50 ml的灭菌离心管，70%的酒精，5M的KAc混合液，研钵，液氮，SDS抽取液，1M Tri-HCl (pH 8.0)，0.5M EDTA (pH 8.0)，TE (pH 8.0)( 相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996） 1.DNA小量提取法（SDS小量提取法） F2群体DNA采用SDS小量提取法，步骤如下： 1. 取新鲜水稻样本叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮，用电钻磨碎。 2. 每管磨碎的水稻叶片中加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴30min。 3. 加入200ul 预冷的5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，于40C 10000转离心4min，吸取上层液到另一准备好的1.5ml eppondorf管中。 4. 加入等体积预冷的异丙醇，置于-200C 30min后，40C 10000转离心4min。 5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，上下颠倒混匀，小型离心机快速离心弃上清，倒扣晾干（注：晾干不宜太久，反止DNA难溶）。 6. 将晾干的DNA溶于100ul TE溶液中， 40C保存备用。 2．DNA大量提取法（SDS大量提取法） 亲本DNA和突变体DNA池、正常株DNA池采取SDS大量提取法，步骤如下： 1.取每个水稻新鲜样本叶片1g，放入10ml离心管，加入液氮，用电钻磨碎。 2.加入5ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴20min。 3.水浴20min后加入1 ml 5MKAc混合液，上下颠倒充分混匀，冰浴20min， 冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。 4.加入等体积的氯仿，室温下以3000（10000 rmp）的速度离心 3min，吸取 上清于另一准备好的50 ml离心管中。 5.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃，可以看见DNA絮状沉淀。 6.用玻棒挑出DNA絮状物，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。 7.将晾干的DNA溶于500ul TE溶液中， 40C保存备用。